等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料的制备及性能评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.010

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
聚氨酯材料：是具有微相分离结构的弹性聚合物，具有优异的机械性能、良好的生物相容性(包括血液相容性)，分子设计自由度大，改变其结构中软硬段的组成及配比，可得到不同硬度、机械性能的产物，所以被认为是最佳综合性能的生物医学合成材料，并且被广泛用于人工心脏、人工皮肤、药物载体、人工血管等领域。
硫酸软骨素：在伤口愈合中起到重要作用，它可保持纤维和细胞间水分，促进炎症细胞迁移和营养成分迁移，且降解产物无毒，可为细胞提供碳源和氮源，增加细胞的信使核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成，促进细胞代谢，加速伤口愈合。故将其用在皮肤支架材料上，可显著提高材料生物性能。

背景：聚氨酯具有优异的机械性能和良好的生物相容性，但其疏水性不利于细胞黏附生长，故限制了聚氨酯在皮肤支架上的应用。
目的：对聚氨酯支架材料进行改性，观察其形态结构，检测其亲水性、机械性能及细胞毒性。
方法：通过静电纺丝方法制备聚氨酯支架材料，然后进行CO2、NH3等离子体处理，最后通过交联剂交联，与胶原蛋白及硫酸软骨素复合，制备等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料，设置为A组；设置3组对照，聚氨酯经静电纺丝后进行等离子体处理制备成支架材料后，浸泡在未加交联剂的胶原硫酸软骨素混合溶液中，取出风干，设为B组；聚氨酯经静电纺丝后进行等离子体处理，制备成支架材料，设为C组；将聚氨酯进行静电纺丝，制备成支架材料，设为D组。对比4组材料的形态结构、亲水性、机械性能及体外细胞毒性。
结果与结论：等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料具有良好的纤维形貌、亲水性及机械性能，可促进细胞的黏附、增殖，无细胞毒性。

ORCID: 0000-0001-7674-6405(玄光善)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 等离子体, 聚氨酯, 胶原, 硫酸软骨素, 复合材料, 细胞毒性, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Polyurethane has excellent mechanical properties and perfect biocompatibility. But its hydrophobicity is not conductive to the adhesion and growth of cells, which limits its use as the scaffold of the skin.
OBJECTIVE: To modify a polyurethane scaffold by plasma processing and crosslinking then to test its hydrophilic, mechanical properties and cytotoxicity in vitro.
METHODS: Polyurethane porous materials were prepared into membranous materials by eletrospinning method and modified by CO2 and NH3 plasma. Then the plasma-modified polyurethane-collagen- chondroitin sulfate composite materials were prepared by crosslinking with collagen type I and chondroitin sulfate at the same time, which was named Group A. Polyurethane porous materials which were electrospun and modified by plasma were soaked into a mixed solution of collagen and chondroitin sulfate without crosslinking agent. After being air-dryed, the materials were prepared, named Group B. Polyurethane porous materials which were electrospun and modified by plasma were named Group C. Electrospun polyurethane porous materials without other treatments were named Group D. Then the morphology, hydrophilicity, mechanical property and in vitro cytotoxicity of the four groups were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The plasma-modified polyurethane-collagen-chondroitin sulfate composite materials enjoy excellent fiber morphology, hydrophilicity and mechanical properties. It can also promote cell adhesion, proliferation and have no cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen, Chondroitin Sulfates, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

玄光善，穆兰兰，孙桐，李青. 等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料的制备及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(43): 6451-6457.

Xuan Guang-shan, Mu Lan-lan, Sun Tong, Li Qing.

A plasma-modified polyurethane-collagen-chondroitin sulfate composite material: preparation and performance

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(43): 6451-6457.

图/表（结果） 4

2.1 红外光谱分析结果图1为4种支架材料的红外光谱图，其中位于3 303 cm^-1特征吸收峰为N-H伸缩振动峰，位于2 930 cm^-1和2 850 cm^-1的特征吸收峰分别为亚甲基中C-H的对称和不对称伸缩振动吸收峰，位于 1 715 cm^-1的特征峰为聚氨酯软段聚碳酸酯二醇的C=O伸缩振动峰，O=C-O的面外弯曲特征峰位于图中 790 cm^-1。C组在CO₂和NH₃等离子体处理后，位于 2 850 cm^-1的特征吸收峰明显变小，而位于3 303 cm^-1特征吸收峰明显增宽增大，为伯胺伸缩振动特征峰，说明经氨气等离子体处理后聚氨酯表面接枝大量-NH₂；位于3 600-3 200 cm^-1的-OH特征峰出现，并且C=O伸缩振动峰及O=C-O的面外弯曲特征峰明显增大，表明CO₂在激发转为等离子态后，接枝在聚氨酯的上形成羧基； 1 250 cm^-1处出现C-O-C的不对称伸缩振动强峰，表示活化的CO₂在聚氨酯表面形成酯基。表面涂布胶原及硫酸软骨素时，聚氨酯表面其他特征峰被掩盖，且由于胶原和硫酸软骨素含有大量-OH，红外光谱出现3 600- 3 200 cm^-1较宽的峰。A组经EDC和NHS交联，-NH₂和-COOH反应生成仲酰胺键(RCONHR')。较等离子体处理聚氨酯材料及表面涂布胶原及硫酸软骨素的等离子体处理聚氨酯材料，等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料红外光谱图中1 680 cm^-1处出现仲酰胺C=O伸缩振动的强吸收峰，即酰胺Ⅰ带；1 530 cm^-1处和1 305 cm^-1处分别出现由于N-H变形振动和C-N伸缩振动偶合产生的酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带，表明存在仲酰胺键，可能是交联生成的新的仲酰胺键。

2.2 扫描电镜观察支架材料表面形貌由图2扫描电镜照片可见，该静电纺丝条件制备的聚氨酯支架形貌良好，纤维平滑直径分布均匀，平均直径为1 μm左右，纤维较粗，这是由于与电压、溶液的流速、距离相比，溶剂是影响静电纺丝形貌的一个比较重要因素。实验选用的是N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃摩尔比为2∶1的混合溶剂，四氢呋喃的表面张力低且易挥发，使射流纤维外层快速挥发，限制了纤维的进一步拉伸，使纤维直径较粗；N，N-二甲基甲酰胺沸点高，不易挥发，可使纤维在电场中有效拉伸。因此，适当增加N，N-二甲基甲酰胺比例，可一定程度减小纤维直径，但当N，N-二甲基甲酰胺量过多时，由于溶剂挥发过慢易形成连珠。等离子体处理聚氨酯表面稍有毛糙，这是由于等离子体处理对聚氨酯纤维有一定的刻蚀作用，但整体表观影响不大。等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料纤维表面被胶原包裹填充，经化学交联复合材料整体出现皱缩现象，纤维有弯曲收缩现象；未经等离子体处理聚氨酯支架材料表面物理涂布胶原硫酸软骨素涂层，纤维直径稍有变粗。

2.3 亲水性检测结果生物材料的亲疏水性是限制其应用的主要因素。就皮肤支架而言，适宜亲水性的皮肤修复材料可使伤口保持湿润，有利于细胞黏附生长，促进伤口愈合。对各种支架材料接触角进行分析发现，未经等离子体处理的聚氨酯支架材料接触角为110°，材料不发生浸润；经等离子体处理后，材料的亲水性显著增加，水滴滴至材料后被迅速吸收，无法测出接触角，涂布和接枝胶原硫酸软骨素的材料也迅速将水滴吸收。聚氨酯有大量非极性基团如酯基，有较高的疏水性，离子体处理可在表面接枝亲水基团，虽然等离子体只在接触面反应，但由于静电纺丝纤维之间空隙大，材料比表面积大，增加了处理效率，使亲水性显著增加；胶原蛋白中含有大量-NH₂、-OH，硫酸软骨素含有-OH、-COOH、-SO₃H亲水基团，也有很好的亲水性。故将聚氨酯进行等离子体处理并与胶原蛋白及硫酸软骨素偶联处理，可得亲水性良好的支架材料。

2.4 机械性能测试结果复合材料的应用是需要良好的机械性能。4种支架材料的应力-应变曲线见图3，等离子体处理前后聚氨酯支架都呈明显的黏弹性力学性质，初始模量小，断裂伸长率达550%左右，拉伸强度可至30 MPa，4种支架材料机械性没有明显差异。这是由于等离子体只在材料表面接枝，对材料内部结构无影响，不破坏材料整体的机械性能，表面接枝的胶原蛋白及硫酸软骨素后支架材料的机械强度也没有明显变化。

2.5 体外细胞毒性实验结果由于聚氨酯是用N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶解后进行静电纺丝，并与胶原蛋白及硫酸软骨素进行化学交联，各支架材料虽经乙醇梯度清洗，仍可能有微量残留，对细胞有一定的毒性。由图4可见A组等离子体处理聚氨酯经胶原和硫酸软骨素修饰后细胞生长状况良好，数量较多，偶见圆形细胞。B组细胞生长情况与A组相似，但细胞数量较A组稍多，可能由于表面涂布胶原及硫酸软骨素为细胞生长提供了营养物质；C组细胞有轻微的拉丝现象，细胞数量较前2组较少；D组死细胞数相对较多，有较严重的拉丝现象。A-D组的细胞相对增殖率分别为105.5%、106.6%、98%、91.8%，4种材料细胞相对增殖率均大于90%，即4种材料的细胞毒性为0-1级，符合国家标准对于医疗器械的生物学要求^[22-23]。

参考文献

[1]Mansbridge J. Skin tissue engineering.J Biomat Sci Polym E.2008;19(8):955-968.
[2]董丽,王旭昇,马绍英,等.组织工程皮肤的构建及组织形态学观察[J].中国组织工程研究,2011,15(41):7631-7634.
[3]Cao H,Chen MM,Liu Y,et al.Fish collagen-based scaffold containing PLGA microspheres for controlled growth factor delivery in skin tissue engineering. Colloids Surf B Biointerfaces. 2015;136:1098-1106.
[4]Wang X,You C,Hu X,et al.The roles of knitted mesh-reinforced collagen–chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats.Acta Biomaterialia.2013; 9(8):7822-7832.
[5]Lee CH,Chang SH,Chen WJ,et al.Augmentation of diabetic wound healing and enhancement of collagen content using nanofibrous glucophage-loaded collagen/PLGA scaffold membranes.J Colloid Interface Sci.2015;439:88-97.
[6]Sundaramurthi D,Vasanthan KS,Kuppan P,et al.Electrospun nanostructured chitosan–poly (vinyl alcohol) scaffolds: a biomimetic extracellular matrix as dermal substitute.Biomed Mater.2012; 7(4):045005.
[7]Gholipour-Kanani A,Bahrami SH, Samadi-Kochaksaraie A,et al.Effect of tissue-engineered chitosan-poly (vinyl alcohol) nanofibrous scaffolds on healing of burn wounds of rat skin.IET Nanobiotechnol.2012;6(4):129-135.
[8]Prasad T,Shabeena EA,Vinod D,et al.Characterization and in vitro evaluation of electrospun chitosan/polycaprolactone blend fibrous mat for skin tissue engineering. J Mater Sci Mater Med.2015;26(1):1-13.
[9]Zhang J,Li G,Gao S,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 released from polycaprolactone/chitosan hybrid membrane to promote angiogenesis in vivo.J Bioact Compat Pol.2014:0883911514554146.
[10]Shalumon KT,Anulekha KH,Chennazhi KP,et al. Fabrication of chitosan/poly (caprolactone) nanofibrous scaffold for bone and skin tissue engineering.Int J Biol Macromol.2011;48(4):571-576.
[11]Por?ba R,Špírková M,Bro?ová L,et al.Aliphatic polycarbonate‐based polyurethane elastomers and nanocomposites. II. Mechanical, thermal, and gas transport properties.J Appl Polym Sci.2013;127(1): 329-341.
[12]Kojio K,Furukawa M,Shimada M,et al.Improvement of the Low-Temperature Property of Aliphatic Polycarbonate Glycols-Based Polyurethane Elastomers. SciAdv Mater.2015;7(5):934-939.
[13]Zhou H,Wang H,Tian X,et al.Effect of 3-Aminopropyltriethoxysilane on polycarbonate based waterborne polyurethane transparent coating.Prog Org Coat.2014;77(6):1073-1078.
[14]Por?ba R,Špírková M,Bro?ová L,et al.Aliphatic polycarbonate‐based polyurethane elastomers and nanocomposites. II.Mechanical, thermal, and gas transport properties.J Appl Polym Sci.2013;127(1): 329-341.
[15]Kucinska-Lipka J,Gubanska I,Janik H,et al.Fabrication of polyurethane and polyurethane based composite fibres by the electrospinning technique for soft tissue engineering of cardiovascular system.Mater Sci Eng C.2015;46:166-176.
[16]Sheikh FA,Macossay J,Cantu T,et al.Imaging, spectroscopy, mechanical, alignment and biocompatibility studies of electrospun medical grade polyurethane (Carbothane 3575A) nanofibers and composite nanofibers containing multiwalled carbon nanotubes.J Mech Behav Biomed Mater.2015;41: 189-198.
[17]Shi C,Yuan W,Khan M,et al.Hydrophilic PCU scaffolds prepared by grafting PEGMA and immobilizing gelatin to enhance cell adhesion and proliferation.Mater Sci Eng C.2015;50:201-209.
[18]Gauvin R,Berthod F.Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications. Materials. 2010;3(3): 1863-1887.
[19]Huang R,Li W,Lv X,et al.Biomimetic LBL structured nanofibrous matrices assembled by chitosan/collagen for promoting wound healing.Biomaterials. 2015;53: 58-75.
[20]Wang W,Lin S,Xiao Y,et al.Acceleration of diabetic wound healing with chitosan-crosslinked collagen sponge containing recombinant human acidic fibroblast growth factor in healing-impaired STZ diabetic rats.Life Sci.2008;82(3):190-204.
[21]Mikami T,Kitagawa H.Biosynthesis and function of chondroitin sulfate.Biochimica et Biophysica Acta. 2013;1830(10):4719-4733.
[22]GB/T 16886.5-2003,医疗器械生物学评价第十二部分:样品制备与参照样品[S].中国标准出版社,2005.
[23]GB/T 16886.5-2003,医疗器械生物学评价第五部分:体外细胞毒性试验[S].中国标准出版社,2005.
[24]Yang J,Wan Y,Yang J,et al.Plasma-treated, collagen-anchored polylactone: Its cell affinity evaluation under shear or shear-free conditions.J Biomed Mater Res Part A.2003; 67(4):1139-1147.
[25]Desmet T,Morent R,Geyter ND,et al.Nonthermal plasma technology as a versatile strategy for polymeric biomaterials surface modification: a review.Biomacromolecules.2009;10(9):2351-2378.
[26]张燕搏,姜明,胡平,等.聚氨酯不同低温等离子体改性及生物相容性评价[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2011, 25(10): 944-946.
[27]张燕搏,王强.低温等离子体技术在生物医用材料改性中的应用[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2012, 26(1): 1-3.
[28]陈璐,杨庆,邵梅玲.PHBV/PCL静电纺纤维膜的低温等离子处理研究[J].合成纤维工业,2013,36(4): 30-33.
[29]Sugiyama K,Okamura A,Kawazoe N,et al.Coating of collagen on a poly (l-lactic acid) sponge surface for tissue engineering.Mater Sci Eng C. 2012;32(2): 290-295.
[30]Chen XX,Zhang XR,Li QS.Research advance of collagen protein in eye diseases.Guoji Yanke Zazhi (Int Eye Sci).2015;15(10):1745-1748.
[31]Müller R,Abke J,Schnell E,et al.Surface engineering of stainless steel materials by covalent collagen immobilization to improve implant biocompatibility. Biomaterials.2005; 26(34): 6962-6972.
[32]陈锐.静电纺制备胶原蛋白/聚氨酯心脏瓣膜组织工程支架材料的研究[D].东华大学,2010.

引言

皮肤作为人体最大器官，起着保持体液、保护身体组织器官、参与免疫、抵御外界侵袭等重要作用^[1]。当皮肤受到损伤时，这道保护屏障就会被打破，造成机体代谢紊乱、免疫失调，病原微生物借机侵入，引起一系列严重反应。因此当皮肤受到损伤时必须有适合的人工皮肤对受伤部位进行覆盖。目前市面上有多种敷料和组织工程皮肤，但大多数产品都存在机械性能差、降解速度过快、血管化速度慢和应用时不易操作等缺点^[2]。理想的皮肤组织工程支架材料应具备一定的柔韧性及机械强度，与组织生长相适应的降解能力，良好的生物相容性，可使细胞黏附生长，促进皮肤组织快速愈合。将天然生物材料与合成支架进行复合是制备理想支架材料的方法，已成为目前生物材料研究的热点，近年来提出的复合材料有聚乳酸-羟基乙酸共聚物-胶原^[3-5]、聚乙烯醇-壳聚糖^[6-7]、聚己内酯-壳聚糖等^[8-10]。

聚氨酯材料是具有微相分离结构的弹性聚合物^[11]，具有优异的机械性能、良好的生物相容性(包括血液相容性)，分子设计自由度大，改变其结构中软硬段的组成及配比，可得到不同硬度、机械性能的产物^[12]，所以被认为是最佳综合性能的生物医学合成材料，并且被广泛用于人工心脏、人工皮肤、药物载体、人工血管等领域^[13]。聚碳酸酯型聚氨酯的软段由聚碳酸酯二醇构成^[14]，由于碳酸酯键能在生理环境中获得更好稳定性，使其与其他聚氨酯相比有更好的生物稳定性和生物相容性^[15-16]。但聚氨酯材料本身具有疏水性，细胞不易黏附和生长，这一因素也限制了其作为细胞支架材料的应用^[17]。

胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最为广泛的一类细胞外蛋白质。作为一种天然生物材料，胶原蛋白具有来源广、免疫原性低、生物相容性好等优点^[18]。皮肤愈合是由真皮层细胞合成分泌胶原蛋白开始的，因此，在聚氨酯支架中复合胶原蛋白，不仅可以提高材料的生物相容性，其降解产物氨基酸也可为真皮细胞合成胶原提供原料，促进皮肤愈合^[19-20]。硫酸软骨素在伤口愈合中起到重要作用，它可保持纤维和细胞间水分，促进炎症细胞迁移和营养成分迁移，且降解产物无毒，可为细胞提供碳源和氮源，增加细胞的信使核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成，促进细胞代谢，加速伤口愈合^[21]。故将其用在皮肤支架材料上，可显著提高材料生物性能。

实验拟通过静电纺丝的方式将聚氨酯制备成纤维膜状支架材料，进行CO₂、NH₃等离子体处理，接枝-COOH、-NH₂，通过交联剂交联使其与胶原蛋白及硫酸软骨素复合，制备等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料，采用红外光谱对其结构进行表征，扫描电子显微镜观察纤维形态结构，并考察其亲水性、机械性能，通过MTT法考察材料的细胞毒性，并观察细胞生长状况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计相互对照，观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至12月在青岛科技大学和青岛中皓生物工程有限公司完成。

1.3 材料 PC-3575A聚碳酸酯型聚氨酯购自Lubrizol；Ⅰ型胶原蛋白(相对分子质量≥300 000，纯度>99%)实验室自提；NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞株购自上海研晶生物科技有限公司；Dil染液购自Amresco公司；硫酸软骨素、噻唑蓝(MTT)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)自sigma公司；静电纺丝机(实验室自组装)；DT-02S低温等离子体处理仪(苏州奥普斯等离子体科技有限公司)；VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)；CKX41型反射荧光显微镜(日本OLYMPUS )；IC1000 countstar细胞计数仪(Inno- Alliance Biotech)；Zwick-Roell Z005拉力机(德国Zwick-Roell公司)；Multiskan FC酶联免疫检测仪(Thermo Fisher Scientific公司)；JSM-7500F扫描电镜(日本电子株式会社)。

1.4 实验方法

等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素支架的制备：将聚氨酯60 ℃烘干至恒质量，溶于N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃摩尔比为2∶1的混合溶剂中，配制成质量分数为15%的混合溶液，静置除尽气泡后进行静电纺丝。静电纺丝接收距离15 cm，电压17 kV，流速 1.5 mL/h，湿度50%。放置24 h后取下纤维膜，放置于真空干燥箱干燥3 d。将静电纺丝膜悬挂放入等离子体处理仪，抽真空至真空度达到15 Pa左右时，通入CO₂，控制钢瓶出气阀压力2 MPa，减压阀压力0.2 MPa，最终腔体气压为60 Pa，待气压稳定后，开始进行辉光放电并计时，处理时间各5 min，处理功率为100 W，相同方法进行NH₃处理。将含10.0 g/L胶原蛋白的0.05 mol/L醋酸溶液，用pH=6.9的0.1 mol/L MES缓冲溶液稀释至 4 g/L。取5 mL稀释后的胶原溶液，加入11.5 mg NHS、5 mg硫酸软骨素，搅拌30 min；再加入5 mL浓度为 40 mmol/L EDC乙醇溶液，混匀，4 ℃孵育5 min后，加入等离子体处理过的静电纺丝膜，室温下反应8 h。反应完毕，用0.05 mol/L醋酸溶液冲洗未交联的胶原及硫酸软骨素，并用大量的去离子水冲洗干净，置于35 ℃真空烘箱中干燥至恒质量。将干燥的支架材料用体积分数50%乙醇清洗4次，30 min/次，用超纯水清洗4次，15 min/次，风干，设为A组。

对照品的制备：将聚氨酯进行静电纺丝，经等离子体处理后，制备成支架材料，浸泡在未加交联剂的胶原硫酸软骨素混合溶液中，取出风干，设为B组；将聚氨酯进行静电纺丝，经等离子体处理后，制备成支架材料，风干，设为C组；将聚氨酯进行静电纺丝，制备成支架材料，风干，设为D组。

1.5 主要观察指标

红外光谱检测：全反射法测4种材料的红外吸收光谱，对材料表面进行表征。

扫描电镜观察：将4种支架材料表面喷金，3 kV加速电压下，用扫描电镜观察纤维表面形貌并拍照。

亲疏水性观察：等离子体处理和偶联胶原蛋白及硫酸软骨素都会导致支架材料表面亲水性的差异，实验对4种支架材料的亲水性进行了评价，采用接触角仪对支架材料表面的接触角进行测定。

机械性能评价：取30 mm×30 mm滤纸，两端各贴上双面胶，将它贴在4种支架材料上，表面再贴两层滤纸，材料与滤纸成夹心状，将滤纸片剪成3份，每份为30 mm×1 0mm样品条，去掉中间未粘滤纸，测支架材料厚度及宽度，夹持两端滤纸，用拉力机对其力学性能进行测试。拉伸速度10 mm/min，所得结果取平均值。

体外细胞毒性实验：①材料浸提液的制备：将4种支架材料用电子束辐照，辐照剂量14 kGy。无菌条件将各样品剪碎移至6孔板，每孔6 cm²/mL(表面积/体积)，加含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液， 37 ℃恒温培养24 h，收集备用。②取NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞，按5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔板(每孔 100 μL)，置于体积分数5%CO₂培养箱中，37 ℃培养 24 h。吸弃孔内废液，实验组每孔加100 μL材料浸提液(A-D组材料)，对照组加100 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，空白组加100 μL不含胎牛血清的DMEM/F12培养液，继续培养48 h后，显微镜观察细胞形态并拍照，加MTT工作液20 μL，继续培养4 h后吸弃内液，加二甲亚砜静置。用酶联免疫检测仪测定吸光度，吸收波长490 nm，重复4次，结果取平均值，计算细胞相对增殖度(RGR)。

当细胞相对增殖度在100%级以上时为0级毒性；在80%-99%时为1级毒性；在50%-79%时为2级毒性；在30%-49%时为3级毒性；在0-29%时为1级毒性。细胞毒性均为0级和1级，符合国家标准对于医疗器械的生物学要求。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0进行t 检验、卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

将聚氨酯同时进行CO₂和NH₃等离子体处理，再与胶原蛋白及硫酸软骨素偶联的研究鲜有报道。实验通过静电纺丝方式制备将聚氨酯成膜状支架材料，等离体子处理后与Ⅰ型胶原蛋白及硫酸软骨素交联，制备等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料，以表面涂布胶原及硫酸软骨素的等离子体处理聚氨酯支架材料、等离子体处理聚氨酯支架材料及未经等离子体处理聚氨酯支架材料为对照，采用红外光谱和扫描电子显微镜观察其形态结构，并检测其亲水性、机械性能，通过MTT法检测材料的细胞毒性，并观察生长状况。实验结果表明，等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料性能优异，是理想的皮肤支架材料，具有较大的研究开发价值。

等离子体是气体在近真空状态，在电场能激发下转变成不同于固体液体气体的物质第四态，其中包含中性和激发态的原子或分子、电子、离子及各类自由基等离子。它有更强的活性，更易于与接触面发生反应，且反应条件容易掌控，反应温度接近常温，不会对材料造成热解或烧灼^[25]。利用不同等离子体处理如O₂、NH₃、CO₂、N₂等，可在材料上接枝不同的活泼基团如-OH、-NH₂、-COOH等^[26]，使材料亲水性发生变化更利于细胞的黏附生长^[27-28]。实验中，将聚氨酯进行静电纺丝，显著增加了比表面积，等离子体处理后在其表面形成大量活泼的-COOH和-NH₂。由于EDC/NHS交联体系中-COOH和-NH₂反应生成酰胺键，等离子体处理为聚氨酯提供了大量的-COOH和-NH₂，促进了其和胶原蛋白及硫酸软骨素的反应。

将聚氨酯和胶原蛋白及硫酸软骨素进行偶联，制备成复合支架材料，此种制备方法有以下优点：其一，胶原蛋白和硫酸软骨素均为天然生物材料，且其降解产物为无毒，表现出极好的生物相容性，将其与聚氨酯复合，可以增加其亲水性和生物相容性，减少炎症反应，促进伤口治愈合^[29-31]；其二，胶原蛋白的降解主要是酶水解，如胶原酶^[32]，在之前的研究中发现，未经交联胶原蛋白在胶原酶溶液中2周之内可完全降解，而交联过后其降解速率显著降低。当其用于烫伤、化学烧伤等严重皮肤损伤时，胶原蛋白的降解速率过快，会破坏支架材料结构，残留聚氨酯，不利于皮肤组织生长。

实验证明，将聚氨酯多孔材料进行NH₃、CO₂等离子体处理，通过静电纺丝法制备膜状支架材料同时与Ⅰ型胶原蛋白及硫酸软骨素交联，制备的等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料具有良好的纤维形貌、亲水性、机械性能，能促进细胞黏附增殖，在一定程度上弥补了目前皮肤敷料存在的不足，但是该复合材料在实际应用之前，需对其生物相容性进行进一步研究，根据皮肤创伤愈合程度调节胶原蛋白及硫酸软骨素的含量，并对材料的降解情况进行深入研究，控制材料的降解速率。总之等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料在皮肤支架材料上将有很大的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

HTML			PDF

最新录用	在线预览	正式出版	最新录用	在线预览	正式出版
0	0	0	0	0	66

来源	本网站	其他网站

次数	62	4
比例	94%	6%

摘要

340

最新录用	在线预览	正式出版

0	0	340

	来源	本网站

	次数	340
	比例	100%