高压氧预处理超长皮瓣组织血管内皮生长因子、转化生长因子β的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

超长皮瓣：皮瓣是由有血液供应的皮肤及其附着的皮下脂肪组织所形成。在皮瓣形成与转移过程中，必须有一部分与本体供皮瓣区相连，此相连的部分称为蒂部，以保持血液供应，其他均与本体分离，转移到另一创面受皮瓣区后，暂时仍由蒂部血运供应营养，等受皮瓣区创面血管长入皮瓣，建立新的血运后，再将蒂部切断，始完成皮瓣转移全过程，故又名带蒂皮瓣，但局部皮瓣或岛状皮瓣转移后则不需要断蒂。大鼠超长皮瓣是沿大鼠背部中线设计0.9-1.0 cm×2.5-6.0 cm大小、蒂在尾端的超长随意皮瓣。

高压氧预处理：高压氧预处理一般只是用于正常人进入空气稀薄区的研究，其结论是可提高进驻高原者的抗氧化活力，改善高原低氧环境体内氧化与抗氧化之间的平衡紊乱，并可维持一定的时间，对于降低急性高原反应的发病率有很好的预防及治疗作用，目前已应用在更多疾病治疗过程中。

背景：高压氧治疗能促进皮瓣内微循环再生，增加血管内血流量与血氧含量，对皮瓣淤血改善效果明显。但高压氧预处理在皮瓣移植中的应用研究还未得到足够重视。

目的：建立大鼠背部超长皮瓣模型，观察高压氧预处理在皮瓣淤血形成早期可能发挥的作用。

方法：SD大鼠36只随机分3组，每组12只。3组均在背部设计随意皮瓣9 cm×2.5 cm制成淤血模型。高压氧预处理组在移植前接受4 d的高压氧治疗，1次/d；移植后高压氧治疗组在移植后接受4 d高压氧治疗，1次/d；对照组皮瓣移植后于常压空气中。移植后第3，5天，用苏木精-伊红染色观察组织浸润，免疫组织化学方法分析组织血管内皮生长因子和转化生长因子β表达，第5天计算皮瓣存活率。

结果与结论：移植后5 d对照组皮瓣存活面积较其他两组少(P < 0.05)，高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组差别不明显(P > 0.05)。移植后3 d和5 d时，对照组皮瓣血管内皮生长因子和转化生长因子β阳性细胞数均低于高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组(P < 0.05)，而高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。结果说明，高压氧预处理可促进随意皮瓣血管内皮生长因子和转化生长因子β的表达，有利于新生血管的生成，能提高随意皮瓣的成活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-6925-8726(朱江英)

关键词: 组织构建, 组织工程, 高压氧预处理, 淤血皮瓣, 皮瓣存活率, 大鼠, 血管内皮生长因子, 转化生长因子β

Abstract:

BACKGROUND: Hyperbaric oxygen (HBO) therapy can alleviate the skin flap congestion by improving the angiogenesis and increasing the oxygen content of blood in skin flaps. Although the HBO therapy ability to increase flap survival has been well described, the research on the application of HBO pretreatment in skin flap transplantation does not arouse adequate concern.
OBJECTIVE: To investigate the effect of HBO pretreatment on early-stage flap congestion in the rat model of over-length dorsal random skin flaps.
METHODS: Thirty-six SD rats were randomly divided into control group (n=12), HBO pretreatment group (n=12) and HBO treatment group (n=12). Rats in the HBO pretreatment group received 4 days of HBO therapy prior to transplantation, once a day. Rats in the HBO treatment group received 4 days of HBO therapy after transplantation. Rats in the control group were raised in the normal conditions after flap transplantation. At postoperative days 3 and 5, rats were sacrificed and the samples were collected. The inflammation of flap tissues was detected using hematoxylin-eosin staining. The expression of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β was analyzed by immunohistochemistry staining. The flap survival rate was calculated at postoperative day 5.
RESULTS AND CONCLUSION: The flap survival area of the HBO pretreatment group and HBO treatment group was larger than that of the control group (P < 0.05). At postoperative days 3 and 5, the expression levels of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β in the flap tissue were higher in the HBO pretreatment group and HBO treatment group than the control group (P < 0.05). However, there was no significant difference in the flap survival area and the expression of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β between HBO pretreatment and HBO treatment groups (P > 0.05). HBO pretreatment can increase the expression of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β and promotes angiogenesis in random pattern flaps, thereby improving skin flap survival.

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠36只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 皮瓣存活率 3组大鼠实验过程中均无死亡，皮瓣移植后无感染。移植后第1天，3组大鼠皮瓣远端变黑，对照组变黑范围略大于高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组；移植后第3天，3组皮瓣远端变黑部分质地逐渐变硬，组织回缩，毛发停止生长，对照组变黑部分范围大于高压氧预处理组和术后高压氧治疗组；移植后第5天，3组皮瓣远端不同面积的痂壳形成，坏死区域稳定，成活与坏死界限较清楚，高压氧预处理组和术后高压氧治疗组皮瓣痂壳呈现深浅不一致的灰色，浅灰色，部分痂壳较软，能轻易剥落，剥落后可见创面新鲜出血，对照组痂壳呈棕深黑，较硬，不易剥落，局部有溃烂。见表1，图1。

2.3 苏木精-伊红染色结果移植后第3天，对照组较高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组炎性细胞浸润明显，微血管少，但高压氧预处理组和术后高压氧治疗组之间差异不明显；移植后第5天，高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组微血管断面密度明显高于对照组，炎症细胞较对照组少；高压氧预处理组和术后高压氧治疗组移植后第5天的毛细血管断面密度较移植后第3天时多，炎性细胞减少，高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组之间差异不明显；对照组移植后第5天的微血管断面密度和移植后第3天时相比未增加，炎性细胞减少。见图2。

2.4 皮瓣转化生长因子β阳性细胞数测定结果 3组各时间点均见转化生长因子β阳性细胞，转化生长因子β呈强阳性主要表达于真皮层中的血管内皮和成纤维细胞的细胞质中。各时间点高压氧预处理组转化生长因子β阳性细胞均显著强于对照组(P < 0.05)，而与术后高压氧治疗组比差异无显著性意义(P > 0.05)。见表2，图3。

2.5 皮瓣血管内皮生长因子阳性细胞数测定结果 3组各时间点均见血管内皮生长因子阳性细胞，血管内皮生长因子呈强阳性主要表达于真皮层中的血管内皮细胞的细胞质中。各时间点高压氧预处理组血管内皮生长因子阳性细胞均显著强于对照组，而较术后高压氧治疗组无显著差异。见表3，图4。

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引言

皮瓣在形成和转移的过程中，最重要的是保证皮瓣成活，然而皮瓣出现血循环障碍，导致皮瓣部分或全部坏死是比较常见而严重的并发症。皮瓣出现血循环障碍本质上是血液供应不充分的表现，静脉、淋巴管回流不通畅。静脉危象发生的概率要比动脉危象高^[1-3]。

静脉淤血是各种皮瓣移植或组织皮移植术后的常见并发症；由于皮瓣的静脉血液回流受阻，使得血液淤积于小静脉和毛细血管内，静脉回流血液较动脉输入的少，皮瓣外观肿胀、呈紫色的临床现象。如果静脉淤血未被及时纠正，皮瓣出现血循环障碍，就会导致皮瓣部分或全部坏死，是比较常见而严重的并发症。

高压氧治疗作为一种能提高皮瓣移植后成活率的方法自20世纪60年代就已开展研究。国外研究发现经高压氧治疗的皮瓣坏死面积明显减少^[4]。而国内学者亦对高压氧治疗皮瓣淤血做了大量研究^[5]，认为经过高压氧治疗能促进皮瓣内微循环再生，增加血管内血流量与血氧含量，对皮瓣淤血改善效果明显。高压氧通过加速皮瓣移植后血管再生、减轻缺血再灌注损伤、抗感染等作用提高皮瓣存活率。在这些过程中，高压氧治疗可能通过增加移植皮瓣中血管内皮生长因子、CD105等因子的表达而促进新生毛细血管形成，提高皮瓣成活率^[6]。皮瓣移植后的高压氧治疗已被认识和应用，但高压氧预处理在皮瓣移植中的应用研究还未得到足够重视。短时的高压氧能改善创面血供，促进伤口愈合，这种效应即使在高压氧治疗结束2周后依然存在。作者推测在术前予以大鼠高压氧处理，一方面使血中溶解的游离氧有所增加，压力升高，使得动脉血氧分压增高，毛细血管与组织间形成压力梯度，增加组织内氧弥散能力，为术后组织储备氧以满足皮瓣的需氧量；另一方面组织氧分压提高，成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞处于高度分裂增殖状态，加速毛细血管的增生，促进侧支循环形成，从而改善血液循环。

此次研究旨在通过大鼠背部超长皮瓣模型的建立以探讨高压氧预处理在皮瓣淤血形成早期可能发挥的作用。

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材料方法

1.1 设计皮瓣组织免疫组织化学检测，随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年6月在广西医科大学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：36只健康SD大鼠，雌雄不限，体质量250-300 g。由广西医科大学动物实验中心协助喂养，自由饮水，室温25 ℃左右，相对湿度40%-70%。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

分组：将36只SD大鼠随机分成3组，对照组、高压氧预处理组和移植后高压氧治疗组，每组均为12只。

实验所用主要试剂及仪器：兔抗大鼠血管内皮生长因子单克隆抗体、兔抗大鼠转化生长因子β单克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒(均为rabbit anti-AChE

1∶800，Bioworld Technology Co，Ltd，MN，USA)；Olympus- B X50显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 高压氧处理预处理方法参照戚征等^[7]的方法基础上进行改进。

高压氧预处理组大鼠术前每天预处理1次，1 h/次，共4 d。将大鼠置于自制不锈钢纯氧实验容器并放入大型空气加压舱内，空气加压20 min，氧舱压力升至 0.1 MPa稳压，然后对实验容器进行通氧操作，开始大流量进氧，务必在5 min内使实验容器内氧体积分数达75%，然后氧流量维持在10-12 L/min，容器内氧体积分数在75%以上，维持同样治疗60 min，减压20 min，氧舱压力降至0出舱，完成一次实验；连续治疗4次。第4天预处理12 h内进行手术。

移植后高压氧治疗组在皮瓣成形移植后即刻接受同高压氧预处理组的高压氧治疗；对照组皮瓣移植后于常压空气中。

1.4.2 皮瓣淤血模型建立术前每组大鼠予以体积分数5%水合氯醛5 μL/g腹腔麻醉，将大鼠四肢固定于实验动物手术台上，用电动理发器剔除大鼠背部毛发，每组大鼠设计以后正中线为轴，蒂在尾端的9.0 cm× 2.5 cm 的背部超长随意皮瓣，消毒铺巾后，沿设计线切开至背部肌膜，在其浅面将皮肤与肉膜由头端向尾端剥离，在皮瓣形成后即刻3-0丝线缝合。手术过程严格遵守无菌操作。

1.5 主要观察指标

1.5.1 皮瓣的大体观察术后大鼠放在无垫料的动物房，由广西医科大学动物实验中心统一喂养，分笼单独常规饲养，室温控制在25 ℃左右。每天定时观察各组大鼠的精神状态、饮食、活动，是否出现腹泻，弓背，翘毛，精神萎靡及皮肤溃疡等变化，以及皮瓣的颜色、质地、厚度、弹性、渗出、毛发生长水肿、坏死范围及针刺皮瓣出血等情况，对皮瓣进行连续的临床观察并详细记录。

1.5.2 皮瓣存活率的测定术后第5天，麻醉各组大鼠后，展平背部，用数码照相机拍摄皮瓣情况，用Image-Pro6.0软件分析系统计算皮瓣坏死面积、成活面积和总面积并计算皮瓣成活率。

皮瓣成活率=皮瓣成活面积/总面积×100%

1.5.3 皮瓣组织病理学观察取材方式：各组均于术后第5天，使用体积分数5%水合氯醛5 μL/g腹腔麻醉，在大鼠背部皮瓣远端3.0-4.0 cm处切取0.5 cm×0.5 cm的皮瓣组织样本浸泡于体积分数4%甲醛液中，固定7 d后石蜡包埋，制成切片，苏木精-伊红染色后显微镜下观察。

1.5.4 皮瓣组织免疫组织化学检测 3组大鼠于术后第3，5天，使用体积分数5%水合氯醛5 μL/g腹腔麻醉，分别在皮瓣远端3.0-4.0 cm处取约0.5 cm×0.5 cm大小的全层组织。用体积分数4%甲醛固定，以兔抗大鼠血管内皮生长因子单克隆抗体和兔抗大鼠转化生长因子β单克隆抗体进行免疫组织化学染色，染色方法按照试剂盒说明书操作。最后以BAD显色，有棕黄色颗粒者的细胞为阳性染色。

1.6 统计学分析数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，结果用x(_)±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

静脉淤血是皮瓣移植术后常见的并发症，造成皮瓣静脉淤血的病理现象有微血管数进行性减少，血流速度进行性减慢，红细胞聚集进行性加重，白色血栓的形成情况呈进行性加重趋势等^[8]。如果静脉淤血未被及时纠正，就会危及皮瓣的成活，称为皮瓣的静脉危象。静脉危象发生的常见原因见于吻合口或血管蒂部血管痉挛、狭窄或血栓形成^[9]，血管蒂部受压、扭曲或损伤^[10]；受区静脉高压反流则是游离皮瓣移植术后失败的重要原因^[11]；除此之外，皮瓣本身的缺陷造成的静脉回流障碍包括皮瓣缺乏回流静脉或者回流静脉不充分等也可造成皮瓣静脉危象。当淤血皮瓣出现新生血管时，其微循环状况将得到极大的改善。高压氧在临床上常应用于皮片移植、皮瓣移植后及创面的治疗，其机制为^[12]：①高压氧可极大提高血氧分压，增大氧的弥散距离，皮瓣局部的缺氧状态得到纠正或改善，使有氧代谢旺盛，产生足够的三磷酸腺苷，有利于蛋白质的合成，促进新鲜肉芽组织和上皮生长。②高压氧有改善皮瓣周围毛细血管通透性的作用，可减少渗出，消除水肿，促进局部循环。③高压氧可以降低红细胞比容，改善红细胞弹性及血小板聚集，使血液黏度降低。高压氧还可减轻白细胞与内皮细胞的黏附，降低血黏稠度，减少白细胞聚集，改善损伤部位的微循环和血流灌注。④高压氧治疗下细胞周围氧张力增高，细胞活跃，可产生胶原和新生血管，建立有效循环及促进侧支循环。已有学者研究显示，短时的高压氧能改善创面血供^[13]，促进伤口愈合，这种效应即使在高压氧治疗结束2周后依然存在。张玉强等^[1⁴^]、张丽等^[15]研究表明高压氧预处理可以提高脑和脊髓的缺血耐受，减轻损伤。王友彬等^[16]认为高压氧预处理可促进连接蛋白43表达，抑制肿瘤坏死因子α表达，减轻皮瓣缺血再灌注炎症反应。而高压氧预处理除可以减轻皮瓣缺血再灌注炎症反应，是否还具有促进血管增生的作用，仍有待进一步深究。

血管内皮生长因子是一种广泛存在于组织细胞中，具有多种生物学功能的糖蛋白。它具有很强的促血管内皮增殖、促新生血管生长成熟的功能及提高血管通透性的作用，是迄今为止促血管新生作用最为明显的诱发因素之一^[17]。已有研究表明，通过加强血管内皮生长因子的表达及其基因治疗在改善心肌缺血、抗动脉粥样硬化、防治动静脉血管损伤、防治血管性再狭窄、促进心血管移植术后功能改善、治疗骨科的缺血性疾病及骨折、治疗视网膜及肾脏病变等方面均有重要作用^[18]。

高压氧可通过提高血液中的氧含量和局部氧分压来改善组织的缺氧状态^[19-22]。Wang等^[23]通过腺病毒载体将血管内皮生长因子基因转入大鼠缺血皮瓣，发现能增加了皮瓣成活率。Hunt等^[24]认为组织氧分压对于毛细血管再生具有重要意义。刘雪华等^[25]研究发现高压氧治疗可能通过移植皮瓣中血管内皮生长因子、连接蛋白43的表达而促进新生毛细血管形成，提高皮瓣成活率。此次实验对大鼠超长皮瓣进行高压氧预处理，研究结果发现高压氧预处理组皮瓣成活面积大于对照组(P < 0.05)，在术后第3天和第5天时高压氧预处理组皮瓣血管内皮生长因子阳性细胞高于对照组(P < 0.05)。作者认为，高压氧预处理同样能促进术后皮瓣血管内皮生长因子因子表达，从而促使术后皮瓣血管再生，一方面通过再生的血管恢复了皮瓣血运的供应，改善缺血；另一方面又能增加手术区域的氧供，改善缺氧，提高皮瓣的缺血耐受，从而增加皮瓣的存活率。另外有学者研究发现高压氧预处理可以降低白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6炎症因子的表达^[26]，减轻自由基、炎症因子对淤血皮瓣的损害作用，但是高压氧预处理是否还可增加其他促进炎症修复因子的表达，目前文献报道尚少。转化生长因子β是一种具有广泛生物学效应的多肽细胞因子，具有抗炎、抑制免疫，影响血细胞生成、血管生成，参加细胞的增殖分化、代谢和内外间质的形成，在组织创伤、修复、炎症等病理生理过程起着重要的作用。罗海林等^[27]研究发现转化生长因子β可在体内通过减弱炎症与增强血管内皮生长因子分泌抑制脂肪间质干细胞凋亡。随着转化生长因子β在各细胞中表达增强，血管内皮生长因子在细胞中的表达也呈增强趋势，转化生长因子β是血管内皮生长因子的诱导因子^[28]。此次实验结果显示3 d和5 d时高压氧预处理组皮瓣转化生长因子β阳性细胞高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明高压氧预处理可提高移植皮瓣组织中转化生长因子β的表达。可见，转化生长因子β的表达，一方面上调促进新生血管形成的因子血管内皮生长因子表达，从而促进新生毛细血管形成；一方面减轻炎症反应，减少炎性细胞浸润，促进移植皮瓣毛细血管的增生，其在皮瓣移植术后减轻静脉淤血提高皮瓣存活率均起到不可或缺的作用。

综上所述，此次实验结果表明高压氧治疗的高压氧预处理组、移植后高压氧治疗组皮瓣存活率优于对照组，都增加皮瓣组织转化生长因子β和血管内皮生长因子的表达，促进血管构建和生成，从而提高皮瓣成活率。高压氧预处理组和术后高压氧治疗组无差别，这可能与高压氧治疗频次、单次治疗时间、治疗次数以及气压梯度等问题有关，不同的治疗时间、间隔时间、日治疗次数、压力梯度，其结果可能会产生较大的差异，有待于进一步深入研究。

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