共培养下后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (20): 3692-3698.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.012

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共培养下后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达

张艳君¹，梅虎¹，蒋稼欢¹，谢静¹，尹琳¹，陈荣富²，许春明¹，王春莉¹，宋国立^1，3

1重庆大学生物工程学院，重庆市 400030
2重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆市 400016
3加州大学圣迭亚哥分校骨科系及生物工程系，美国加利福尼亚州 CA92093-0412

收稿日期:2012-10-17 修回日期:2012-11-17 出版日期:2013-05-14 发布日期:2013-05-14
通讯作者: 宋国立，男，博士后，教授，博士生导师，重庆大学生物工程学院，重庆市 400030；加州大学圣迭亚哥分校骨科系及生物工程系，美国加利福尼亚州 CA92093-0412 klpsung@bioeng.ucsd.edu
作者简介:张艳君☆，1982年生，山西省大同市人，汉族，重庆大学在读博士，主要从事膝关节交叉韧带修复的研究。 zhangyanjun388@126.com
基金资助:
高等学校学科创新引智计划(国家“111计划”)(B06023)；重庆市科技攻关项目(CSTC, 2008AB5)。

Lysyl oxidase gene expressions in the posterior cruciate ligament fibroblasts co-cultured with synovial cells

Zhang Yan-jun¹, Mei Hu¹, Jiang Jia-huan¹, Xie Jing¹, Yin Lin¹, Chen Rong-fu², Xu Chun-ming¹, Wang Chun-li¹, KL Paul Sung^{1, 3}

1 College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China
2 Departments of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
3 Departments of Orthopedics and Bioengineering, University of California, San Diego, La Jolla, CA 92093-0412, USA

Received:2012-10-17 Revised:2012-11-17 Online:2013-05-14 Published:2013-05-14
Contact: KL Paul Sung, M.D., Professor, Doctoral supervisor, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China; Departments of Orthopedics and Bioengineering, University of California, San Diego, La Jolla, CA 92093-0412, USA klpsung@bioeng.ucsd.edu
About author:Zhang Yan-jun☆, Studying for doctorate, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China zhangyanjun388@126.com
Supported by:
the Innovation and Attracting Talents Program for College and University (National “111” project), No. B06023; the Foundation for Sci & Tech Research Project of Chongqing, No. CSTC, 2008AB5

摘要/Abstract

摘要：

背景：后交叉韧带对人膝关节结构的稳定以及功能的发挥起着重要作用。与内侧副韧带相比，损伤后的后交叉韧带难以很好的自我愈合，甚至会导致半月板撕裂和软骨损伤。为了提高后交叉韧带的愈合能力，这就需要寻找新的途径来再生和修复损伤的后交叉韧带。近年来的研究表明，赖氨酰氧化酶在组织损伤修复过程中起到非常重要的作用，但其在后交叉韧带修复过程中的分子机制研究尚未涉猎。
目的：观察与滑膜细胞共培养后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶基因的表达。
方法：将第4代的后交叉韧带成纤维细胞和滑膜细胞分别种植于6孔板和Tanswell中。实验分为2组，即后交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养组和后交叉韧带成纤维细胞单层培养组。培养6 h后，提取总RNA，通过半定量PCR和实时定量PCR检测单层培养组和共培养组中后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶基因表达。
结果与结论：与单层培养组相比，赖氨酰氧化酶、赖氨酰氧化酶样蛋白1、赖氨酰氧化酶样蛋白2、赖氨酰氧化酶样蛋白3和赖氨酰氧化酶样蛋白4的基因表达在共培养的后交叉韧带细胞中都明显升高，分别增加了1.1，1.4，1.1，1.3，1.1倍(P < 0.05)。单层培养组家族成员在单层培养和共培养中表达情况的差异性，说明细胞之间的相互作用会影响后交叉韧带组织的损伤修复，对后交叉韧带损伤修复的机制研究有极其重要的参考价值。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 组织修复, 膝关节, 半月板, 软骨, 后交叉韧带, 内侧副韧带, 滑膜, 单层培养, 共培养, 赖氨酰氧化酶, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: The posterior cruciate ligament is an important ligament contributing to the stability and normal functioning of the knee joint. Compared to the medial collateral ligament, the posterior cruciate ligament has a poor healing ability and often leads to significant knee instability and secondary knee damage including meniscus tears and articular cartilage injuries. In attempting to improve the healing ability of injured posterior cruciate ligament, we need to find new ways for regeneration and repair of injured posterior cruciate ligament. Previous studies have demonstrated that lysyl oxidases play an important role in the tissue repair mechanism, but the effect of lysyl oxidases from injured posterior cruciate ligament on the process of wound repair remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the expressions of lysyl oxidases in the posterior cruciate ligament fibroblasts co-cultured with synovial cells.
METHODS: The fourth passage of posterior cruciate ligament fibroblasts and synovial cells were placed in 6-well plates and Transwell, respectively. Two groups were designed as follows, posterior cruciate ligament fibroblasts group as control and co-cultured group termed as test group. At 6 hours after co-culture, total RNA was isolated and the expressions of lysyl oxidases in the posterior cruciate ligament fibroblasts were analyzed by semi-quantitative reverse-transcription PCR and quantitative real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The results revealed that co-culture contributed to up-regulations of lysyl oxidases compared with the control group, and gene levels were up to 1.1 folds in lysyl oxidase, 1.4 folds in lysyl oxidase-like 1 protein, 1.1 folds in lysyl oxidase-like 2 protein, 1.3 folds in lysyl oxidase-like 3 protein, 1.1 folds in lysyl oxidase-like 4 protein in co-cultured posterior cruciate ligament cells (P < 0.05). The differential expression of lysyl oxidases in co-cultured posterior cruciate ligament cells implies that cell-cell interaction and crosstalk are related with posterior cruciate ligament wound healing and have significant potential value and clinical usage for cure of injured posterior cruciate ligament.

Key words: tissue construction, cytology experiments in tissue construction, tissue repair, knee joint, meniscus, cartilage, posterior cruciate ligament, medial collateral ligament, synovial, monolayer culture, co-culture, lysyl oxidase, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

张艳君，梅虎，蒋稼欢，谢静，尹琳，陈荣富，许春明，王春莉，宋国立. 共培养下后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3692-3698.

Zhang Yan-jun, Mei Hu, Jiang Jia-huan, Xie Jing, Yin Lin, Chen Rong-fu, Xu Chun-ming, Wang Chun-li, KL Paul Sung. Lysyl oxidase gene expressions in the posterior cruciate ligament fibroblasts co-cultured with synovial cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3692-3698.

图/表（结果） 2

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引言

随着社会生活水平的提高，体育竞技日趋盛行，而交通事故也层出不穷，后交叉韧带损伤尤为突出。临床报告显示急性膝关节损伤后后交叉韧带损伤多达3%-44%^[1]，包括单纯的后交叉韧带损伤以及混合性韧带损伤。与内侧副韧带相比，后交叉韧带与前交叉韧带一样损伤后难以愈合，甚至会继发关节软骨损伤，最终将造成骨关节病的发生。目前，主要通过自体移植、异体移植、采用人工材料这3种韧带重建术进行后交叉韧带或前交叉韧带修复^[2-4]。但由于以上3种方法自身存在的缺陷使后交叉韧带的修复并不理想。如自体移植易受到来源限制，还可能会引起并发症；异体移植虽然存在手术时间短，可随意取材，原有肌腱的功能不会被损害等优点，但会造成大量的疾病传播、免疫排斥反应等问题；而人工合成材料重建后交叉韧带远期疗效还存在争议，限制了其临床应用。所以需要研究者在细胞与分子水平上探索交叉韧带无法自我修复的根本原因，期望为损伤后交叉韧带的治疗提供理论依据。过去的大量研究主要集中于对前交叉韧带修复机制的研究，而对后交叉韧带修复的基础研究涉及较少。

在组织修复过程中，组织周围细胞外基质合成和降解处于一个动态平衡状态，这一状态的破坏将会推迟组织修复甚至造成组织无法修复^[5-6]。多种细胞因子、蛋白酶参与了该过程^[7-8]。赖氨酰氧化酶(Iysyl oxidase，LOXs)作为细胞外基质合成酶也参与了这一平衡状态的维持。LOXs是一类Cu离子依赖的胺氧化酶家族，其成员包括有LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3和LOXL-4。LOXs的基本功能是催化细胞外基质胶原和弹性蛋白交联^[9-11]，其交叉连接程度决定着细胞外基质的力学性质以及基质受到蛋白酶降解的敏感性^[12]，LOXs的这一功能使其在组织的稳定、重塑和伤口愈合中发挥重要作用^[13]。当LOXs家族基因缺失或者失活时能诱导多种人类疾病如：结缔组织病、剥脱综合征、铜代谢障碍性疾病、盆腔器官脱垂、骨疾、动脉粥样硬化、神经退行性疾病等^[9]。先前已有研究指出与内侧副韧带细胞相比，前交叉韧带细胞中LOXs的表达量较低，从而使细胞外基质更易被蛋白酶降解，进而破坏了细胞外基质合成和降解的平衡，最终不利于前交叉韧带愈合^[14]。与损伤的前交叉韧带一样，后交叉韧带损伤后无法修复可能也与LOXs有关。但过去对前交叉韧带的研究主要集中于前交叉韧带细胞单层培养。由于前交叉韧带和后交叉韧带是由滑膜包裹的^[15]，韧带细胞与滑膜细胞之间是有交流的，单层培养并没有很好地模拟膝关节内微环境。

体外细胞共培养体系分为直接共培养体系和非接触式共培养体系。直接共培养体系是指将不同细胞混合后接种于同一环境中进行培养，并研究细胞之间的相互作用。彭锦等^[16]将骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞进行直接共培养，发现人脐静脉内皮细胞可以诱导骨髓间充质干细胞向成熟的内皮细胞分化，暗示了细胞融合可能是干细胞向内皮分化因素之一。非接触式共培养指共培养体系中一种细胞对另外一种细胞的影响是通过旁分泌产生的细胞因子进行相互作用，但两者细胞不能接触。由于两种细胞非常容易分离，便于用显微镜观察，并且不影响后续的一系列检测。它包括以下3种方法：①在培养细胞期间，取出它的上清液(含有不同生长因子)，加入到另外一种细胞中进行共培养^[17]。②首先用Ⅰ型胶原凝胶处理玻片，然后将细胞B培养在玻片上，最后将培养的细胞A按一定的比例放入培养皿中与细胞B进行共培养^[18]。③Transwell小室。它是一类具有通透性的支持物的装置，这个装置的底层放了一张透明、有通透性的膜，并且是悬挂式的。一般共培养常选择的是聚碳酸酯膜，聚酯膜，孔径大小为0.4或3.0 μm(根据细胞的大小来选择)。首先将细胞B种在细胞板上，然后将Transwell小室放入培养板中，把细胞A种在Transwell小室内的膜上。张树鹰等^[19]运用Transwell小室实现了成骨样细胞和骨髓基质干细胞的共培养，并证实了成骨样细胞定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的可行性。

实验通过Transwell小室建立后交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养体系，研究共培养条件下细胞之间的交流对后交叉韧带成纤维细胞中LOXs表达的影响，为后交叉韧带修复奠定理论基础。

材料方法

设计：随机分组，细胞学实验对比观察。

时间及地点：于2011年9至11月在重庆医科大学附属第一医院骨科教研室收集正常后交叉韧带与滑膜组织标本；2011年9月至2012年2月在重庆大学生物工程学院国际合作实验室完成实验。

材料：

正常后交叉韧带与滑膜组织标本：后交叉韧带与滑膜组织取自4个25-42岁因外伤行下肢截肢治疗患者的正常膝关节。男2例，女2例，全部来自于重庆医科大学附属第一医院骨科。无菌条件下用剪刀和镊子取得截肢膝关节滑膜组织的滑膜层。经过重庆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

试剂及仪器：

Reagents and instruments:

方法：

细胞培养：在无菌条件下，取出截肢患者正常后交叉韧带和滑膜细胞，用1×PBS(含双抗)多次冲洗，冲洗后以解剖刀剔除组织表面多余的外周组织，然后用眼科剪将组织分开剪成2 mm×2 mm×2 mm组织块，将后交叉韧带和滑膜组织块置于含有DMEM液(含体积分数为10%胎牛血清、50 mg/L抗坏血酸)的培养瓶中(后交叉韧带用低糖DMEM液培养；滑膜用高糖DMEM液培养)，在37 ℃，体积分数为5%CO₂的孵育箱内进行原代培养，每3 d换液1次。原代培养细胞逐渐从组织中长出，当细胞达到90%融合时将组织块转移到新培养瓶中继续原代培养。留在瓶中的细胞经过每3 d换液1次直到细胞铺满瓶底后进行传代，吸掉培养基，无菌PBS洗涤细胞1次，加入0.25%胰酶37 ℃作用1.0-2.0 min后，吸出胰酶，加入培养基吹打瓶壁细胞成单细胞悬液，将悬液以1∶3接种于3个培养瓶中继续培养。选取第4代后交叉韧带细胞和滑膜细胞通过形态鉴定后进行实验。

当细胞从组织中长出来并长满瓶底部后，组织块被移到新的培养瓶中，换以体积分数为10%胎牛血清的DMEM继续培养，而剩余的细胞继续长满瓶底，冻存、传代以备用于实验。实验中的细胞一般是在传代到2-5代的时候使用。

共培养模型的建立：将后交叉韧带细胞以1×10⁵的密度接种于6孔板中，滑膜细胞以同样密度(1×10⁵)接种于Tanswell中。接种后放入体积分数为5%CO₂、37 ℃细胞孵箱中培养12 h后换液，待细胞贴壁培养瓶后，用1%饥饿细胞使其均一化。接着将种有滑膜细胞的Tanswell放入种有后交叉韧带细胞的6孔板中进行共培养，形成共培养组。中间隔以孔径为0.4 μm的聚碳酸酯膜，这张膜是透水膜，细胞不能通过此膜，但细胞所分泌的细胞因子可以通过。而未放入Tanswell的设置为后交叉韧带细胞单层培养组。共培养组和单层培养组中的后交叉韧带细胞经过6 h培养后，分别提取两组中后交叉韧带细胞的总RNA进行实验。

半定量PCR(Semi-quantitative PCR)：其基本步骤如下(反应体系为25 μL，引物序列见表1)：Master Mix 12.5 μL，Primer正负引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 9.5 μL。反应步骤中解链94 ℃， 30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；循环数28- 35个，之后用2%的琼脂糖电泳跑胶，紫外光下获得电泳结果。

实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)：为了更精准的检测到在共培养条件下LOXs表达的变化情况，用到了相对荧光定量PCR，所用引物同上。基本步骤为：SYBR Green 12.5 μL，primer各1 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 9.5 μL。反应步骤中解链94 ℃，15 s；退火58 ℃，15 s；延伸72 ℃，15 s；循环数控制在40个循环。在实验中扩增效率高达η=96.8%，最低为94%。

主要观察指标：与滑膜细胞共培养条件下，后交叉韧带细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达情况。

统计学分析：采用SPSS 13. 0统计分析软件以及单因素方差分析数据，检测各组之间是否存在差异。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

膝关节后交叉韧带是保持膝关节稳定的重要结构之一，它近于膝关节的中心，具有膝关节屈伸和旋转运动轴的功能。后交叉韧带的损伤发病率居高不下，且损伤后无法愈合。在非手术治疗的后交叉韧带损伤患者中，有36%-88%的患者膝关节会产生变性关节退化等并发症^[20]。目前治疗后交叉韧带损伤的最好办法是利用自体和异体移植进行后交叉韧带重建，然而重建后韧带的力学适应能力还未能达到原有后交叉韧带的水平^[21]，并且研究指出后交叉韧带重建患者中20%-60%也会产生变性关节退化等并发症^[20]。提高受损后交叉韧带自我愈合能力是研究者们一直关注的一大难题，确定受损后交叉韧带难以愈合的原因，从而有效地提高受损后交叉韧带自我愈合能力迫在眉睫。

后交叉韧带自我修复能力较差的原因尚不明确。关于前交叉韧带与内侧副韧带修复机制的研究显示：与正常伤口愈合过程一样，在受损韧带整个愈合过程中，既有旧的细胞外基质分子的降解，又有新的细胞外基质分子的再生，细胞外基质总是处于一种动态平衡状态^[5]，其中LOXs在新的细胞外基质分子的合成过程中扮演十分关键的作用。

赖氨酰氧化酶分泌性酶活性首次公布于1968年^[22]，之后先后鉴定出4个人赖氨酰氧化酶样蛋白，分别是赖氨酰氧化酶样蛋白1(LOXL-1)^[23]、赖氨酰氧化酶样蛋白2 (LOXL-2)^[24]、赖氨酰氧化酶样蛋白3 (LOXL-3)^[25]、赖氨酰氧化酶样蛋白4 (LOXL-4)^[26]，从而建立了含有5个成员的LOX基因家族。赖氨酰氧化酶家族的每一个成员都含有高度保守的铜离子结合位点，赖氨酸酪氨酸醌残基和细胞因子受体区域。LOXs具有促进细胞外基质交叉连接、肿瘤抑制、发育调控、细胞衰老和趋化性5大功能，促进细胞外基质交叉连接是LOXs的主要功能。它催化细胞外基质蛋白，如胶原和弹性蛋白中赖氨酸残基的ε-氨基的氧化脱氨，生成α–氨基–半醛残基，这些结构一旦形成，就可以与临近的醛化的或其他未醛化的赖氨酸残基通过非酶促反应自然缩合形成分子内和分子间的交联，此交联结构具有强大的弹性与韧性，并能抵抗胶原酶的水解从而稳定细胞外基质免受基质金属蛋白酶的降解^[27-28]。LOX基因敲除的小鼠一般死于妊娠期或新生儿时期，病理表现为严重的弹性纤维缺损的心血管系统缺陷^[29]。Lau等^[30]研究小组发现LOX过量表达可以提高皮肤创伤愈合的组织韧性。Hou等^[31]运用转化生长因子β1基因转移方法促进LOX的表达从而加快了受伤跟腱的修复。由此可以表明LOX对细胞外基质重塑和损伤修复发挥着非常重要的作用。

体内复杂的微环境对调节组织以及细胞的功能发挥着非常重要的作用。从解剖学来看，维持膝关节的功能主要是依赖于韧带间协调作用^[32]，因此，后交叉韧带组织不是单独存在的，而是与周围的另外一些组织发生相互作用，共同来维持膝关节的功能。在关节内的微环境下，后交叉韧带是一种细胞外结构，并且由一层薄的滑膜组织(synovium)所包裹，自身没有丰富的血管床，主要靠滑膜提供营养和血供^[33]。当韧带及附在其上的滑膜组织撕裂后，后交叉韧带就暴露在滑液，以及出血性分解产物和蛋白酶中^[34-35]。因此，滑膜组织在韧带损伤修复过程中的作用是不容忽视的^[36]。为了更加真实的模拟体内微环境，本文建立了后交叉韧带成纤维细胞与滑膜成纤维细胞共培养体系，这一方法能够最大程度地模拟体内微环境，维持体内性状，观察细胞之间的相互交流在调控细胞功能所起到的作用^[37]。它的许多优点使其在临床和科研得到了广泛的应用。目前，已经有许多研究者通过建立共培养系统来研究不同种类细胞之间的相互作用。这些细胞通过相互交流，能够对细胞生长、细胞分化、细胞凋亡等产生重要作用^[38-39]。

本研究采用Transwell小室插入非接触式共培养，这一培养体系中细胞分类及相互交流作用明确，排除了以往接触式共培养因细胞混杂不利于后期观察和结果分析的弊端。研究通过检测单培养与共培养条件下，后交叉韧带细胞中LOXs的基因表达情况，指出了不同培养环境下的后交叉韧带细胞分泌LOXs的能力确实存在差异。相比单培养而言共培养能够促进LOXs家族5个成员的表达。共培养组的LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3和LOXL-4分别比单培养组增加了1.1，1.4，1.1，1.3，1.1倍。

结论：后交叉韧带细胞与滑膜细胞之间的相互交流影响了LOXs的表达，并且进一步证实滑膜在后交叉韧带损伤修复中的重要作用。这些结果可以为后续探索后交叉韧带损伤修复的机制及治疗方法提供理论依据。

共培养下后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达

Lysyl oxidase gene expressions in the posterior cruciate ligament fibroblasts co-cultured with synovial cells

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