小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.017

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5993-5997.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.017

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养

孟琳琳¹，黄莺¹，马依彤¹，刘芬²，陈邦党²，陈小翠²，盖敏涛²

1新疆医科大学第一附属医院心脏中心，1冠心病二科， 2科技楼冠心病实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 黄莺，博士，副主任医师，副教授，新疆医科大学第一附属医院心脏中心，冠心病二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:孟琳琳，女，1988年生，河北省沧州市海兴县人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事冠心病基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81260022)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2014211C040)

Modified primary culture of neonatal mouse myocardial cells

Meng Lin-lin¹, Huang Ying¹, Ma Yi-tong¹, Liu Fen², Chen Bang-dang², Chen Xiao-cui², Gai Min-tao²

1Second Department of Coronary Heart Disease, 2Laboratory of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Huang Ying, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Second Department of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Meng Lin-lin, Studying for master’s degree, Second Department of Coronary Heart Disease, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260022; the Natural Science Foundation of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014211C040

摘要/Abstract

摘要：

背景：大鼠心肌细胞原代培养技术日渐成熟，但小鼠心肌细胞在同样实验条件下不易获得，而小鼠基因组与人类基因组有更多相似之处，具有更高的研究价值。

目的：改进小鼠乳鼠原代心肌细胞的培养方法，得到纯度高、活力强、保持心肌细胞原有结构和功能的心肌细胞。

方法：将小鼠心肌组织利用酶消方法分离为单个的心肌细胞，实验步骤中将经典的胰酶、胶原蛋白酶混合酶消法分解开，先用胰酶消化心肌组织，使心肌组织变得松散，再用胶原蛋白酶，作用于细胞间质的胶原纤维，使心肌组织分离为单个的心肌细胞。调整胰酶和Ⅱ型胶原蛋白酶的浓度和作用时间，严格控制试剂pH值和各步骤的温度。

结果与结论：心肌细胞在接种24 h后开始贴壁，48 h后可观察到部分心肌细胞出现自主搏动，72 h后彼此形成交联，96 h后可观察到心肌细胞形成细胞簇，并出现一致性搏动。心肌细胞的存活率和纯度均达95%以上。结果证实，实验采用改良方法成功培养出小鼠乳鼠心肌细胞，并且保留心肌细胞的结构和功能，纯度和成活率高，是可行的培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 心肌细胞, 小鼠乳鼠, 原代细胞培养, 酶消法, Ⅱ型胶原蛋白酶, 作用时间, 心肌搏动, 细胞簇, 温度, pH值, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: A lot of work has been carried out on the development of the primary cultured rat myocardial cells at home and abroad. The primary culture technology of rat myocardial cells becomes more mature, but myocardial cells from neonatal mice are not easy to be obtained under the same experimental conditions. The mouse genome has more similarities with the human genome, which has a higher research value.
OBJECTIVE: To improve the primary culture method of neonatal mouse myocardial cells, and to obtain myocardial cells with high purity, vitality and original structure and function.
METHODS: The mouse cardiac tissues were treated using an enzyme digestion method to isolate isolated single myocardial cells: first, the cardiac tissues were digested using trypsin, and then collagenous fibers were treated with collagenase to isolate single myocardial cells. The concentration and action time of trypsin and type II collagenase were adjusted, and the pH values of reagents and temperature of each step were strictly controlled.
RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours after inoculation, the myocardial cells began to be adherent; at 48 hours, independent pulsation of myocardial cells could be observed; at 72 hours, myocardial cells were cross-linked; and at 96 hours, myocardial cells formed cell clusters and presented with consistent beating. The survival rate and purity of myocardial cells were both over 95%. This modified method could successfully culture myocardial cells with high purity and viablility from neonatal mice, and the structure and function of myocardial cells could be retained. Therefore, it is a feasible culture method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Myocytes, Cardiac, Mice

中图分类号:

R318

孟琳琳，黄莺，马依彤，刘芬，陈邦党，陈小翠，盖敏涛. 小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5993-5997.

Meng Lin-lin, Huang Ying, Ma Yi-tong, Liu Fen, Chen Bang-dang, Chen Xiao-cui, Gai Min-tao. Modified primary culture of neonatal mouse myocardial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5993-5997.

图/表（结果） 2

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引言

心血管疾病是全球发病率和死亡率高的主要原因^[1-13]。体外培养心肌细胞已成为心血管疾病基础研究的基本方法之一。国内外学者通过体外培养原代乳鼠心肌细胞，进而研究心肌细胞在缺氧、缺血条件下的存活以及生理特性的改变，为研究心血管疾病的发病机制做了大量研究^[5-21]。通过原代心肌细胞的培养，建立体外模型，可在细胞水平上研究缺血、缺氧对心肌细胞的毒理、病理等机制。乳鼠心肌细胞常被选用做体外实验的研究对象。目前所报道的公认的方法主要为单一酶消法和混合酶消法。单一酶消方法是采用胰酶或者胶原蛋白酶消化心肌细胞，但是单一的胰酶消化易使心肌细胞消化过度，会对心肌细胞的细胞结构和细胞功能造成不利影响，导致心肌细胞的存活率下降。单一的胶原蛋白酶消化能力减弱，不易得到大量的单体的心肌细胞。胰酶和胶原蛋白酶混合酶消法的效果也不令人满意。目前的培养小鼠心肌细胞的方法大多是以上方法的改进，但是以现存方法获取的小鼠乳鼠心肌细胞数量少、活力差，纯度不理想。所以体外培养出纯度高、活力强、功能完整的小鼠乳鼠原代心肌细胞是亟待解决的问题。实验在以往实验的基础上，对方法进行了改进，采用胰酶和胶原蛋白酶分步消化心肌细胞，先用胰酶消化心肌组织，分解组织间的蛋白成分，作用较强，使心肌组织变得松散，再用胶原蛋白酶，作用于细胞间质的胶原纤维，作用缓和，使心肌组织分离为单个的心肌细胞。同时实验降低以往消化酶的浓度，调整了消化步骤中酶的作用时间和温度，更好的保存了心肌细胞的细胞结构和功能。获得了一种可行的小鼠乳鼠心肌细胞培养方法，具体步骤如下，并且对其中关键的影响因素进行探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2014年7月至2015年3月在新疆医科大学第一附属医院科技楼冠心病实验室完成。

1.3 材料出生1-3 d的C57小鼠乳鼠10只，体质量约1.5 g，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供，审批号：IACUC-20120220046。

小鼠乳鼠心肌细胞培养实验所用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清、磷酸盐缓冲液、青霉素/链霉素双抗、牛血清白蛋白	美国Gibco公司
DMEM基础培养基	美国HyClone公司
谷氨酰胺、D-Hanks溶液、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶、Dylight 594标记羊抗兔二抗、锥虫蓝	美国Sigma公司
5-溴脱氧尿嘧啶核苷	美国Thermo公司
心肌标记蛋白Nkx2.5抗体	英国Abcam公司
DAPI、40 g/L多聚甲醛、透化液、Tween-20	中国生工生物工程有限公司
CKX41倒置相差显微镜	日本Olympus公司
LEICA-DMI4000B倒置荧光显微镜	德国LEICA公司

1.4 实验方法

小鼠乳鼠心肌细胞的体外分离与培养：取乳鼠10只，体积分数75%乙醇体外消毒后，用眼科剪沿胸骨左侧打开胸腔，开口为1.0-2.0 cm，轻轻挤压使乳鼠心脏突出与胸腔外，用弯显微镊取下心脏后，迅速放入4 ℃预冷的D-Hanks溶液中，去除连接大血管的心脏部分，大约占心脏组织的1/3，保留心脏的心尖部位，用眼科剪沿着心肌细胞的走行方向将保留的心脏部分剪成花瓣状，心尖部相连。

实验将经典的胰酶、胶原蛋白酶混合酶消法分解开，先用胰酶消化心肌组织，使心肌组织变得松散，再用胶原蛋白酶，作用于细胞间质的胶原纤维，使心肌组织分离为单个的心肌细胞。用D-Hanks溶液轻轻冲洗心脏组织，去掉残留的血液，放入体积分数0.04%的胰蛋白酶(D-Hanks溶液配置)中4 ℃水平摇床消化6 h，往复速度30次/min。加入等量的完全培养基中和胰酶，放入37 ℃水浴箱震荡，往复60次/min，使培养基和胰酶充分反应，终止消化，8 min后去除上清。加入体积分数0.04%Ⅱ型胶原酶(D-Hanks溶液配置)10 mL，放入37 ℃水浴箱震荡，往复60次/min， 8 min后，收集上清，用等体积的完全培养基充分中和，放入37 ℃细胞培养箱中暂存，此步骤重复数次，直至心脏组织被消化完全。收集各次的上清液1 500 r/min，5 min离心，弃上清，用完全培养基重悬心肌细胞，无菌滤网过滤细胞以去除细胞团块，将过滤好的细胞重悬液收集到100 mm的细胞培养皿中。放入37 ℃细胞培养箱中培养2 h，等待绝大部分心肌成纤维细胞贴壁后，收集细胞培养液，接种到1个60 mm的细胞培养皿中，同样条件培养2 h，去除贴壁细胞，收集细胞悬液，接种到另1个60 mm的细胞培养皿中，并在培养液中加入体积分数1%的BrdU以抑制非心肌细胞的增殖。每4 h用倒置相差显微镜观察心肌细胞并拍照记录细胞的贴壁情况和生长状态。

心肌细胞存活率测定：心肌细胞第2次差速贴壁前取500 μL细胞悬液，加入等体积的锥虫蓝染色液充分混合，取20 μL混合液滴于细胞计数板上，倒差显微镜下计数，拒染细胞为活细胞，蓝色细胞为死细胞。观察并计数阳性细胞，估算心肌细胞存活率。此步骤重复3次以上，计算平均值。

心肌细胞的纯度鉴定：用抗心肌标记蛋白Nkx2.5的一抗通过细胞免疫荧光检测心肌细胞纯度。37 ℃ PBS清洗细胞2次，40 g/L多聚甲醛室温下固定心肌细胞15 min，PBS清洗细胞2次，5 min/次，体积分数0.1% TritonX-100室温下透化细胞10 min，PBS清洗细胞2次，5 min/次，加入用体积分数1%BSA的PBST(体积分数0.1% Tween-20)稀释的一抗(1∶200)水平摇床常温孵育1 h。用PBS清洗细胞2次，5 min/次，避光加入用体积分数1%BSA的PBST(0.1%吐温)稀释的羊抗兔二抗(1∶500)常温孵育1 h，PBS清洗细胞2次，避光加入DAPI，常温下孵育1 min。倒置荧光显微镜下拍照并计算心肌细胞的纯度。

1.5 主要观察指标观察小鼠乳鼠心肌细胞的贴壁时间、贴壁后的细胞形态、是否存在自发性搏动。测定心肌细胞的存活率。并通过心肌细胞特有标记蛋白一抗检测所得心肌细胞纯度。

讨论

在心肌细胞的培养过程中，心肌细胞的消化和纯化是最关键的步骤，直接关系到细胞的活性和纯度。实验中的方法是在以前的心肌细胞培养方法基础上加以改进，摸索出最佳酶浓度和酶作用时间，并成功体外培养C57小鼠乳鼠心肌细胞，获得了很高的成活率和纯度。为获得活性好的心肌细胞，酶的消化时间和作用浓度是关键。消化过程中需用到胰酶和Ⅱ型胶原蛋白酶。胰蛋白酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散，同时对心肌细胞膜蛋白也有较强的破坏作用。胰蛋白酶溶液在pH 8.0，温度37 ℃，水浴时，作用能力最强。胶原酶主要作用于细胞间质的胶原纤维，作用缓和，对细胞损伤较小，但消化时间长且不彻底。实验在消化步骤采取在低温下，先使用胰酶消化，低温状态下会降低胰酶对细胞膜的破坏，同时有效的分解了心肌细胞间的蛋白成分，使心肌组织变得松散，有益于下一步胶原蛋白酶的消化。胰酶的消化时间控制在6 h之内。然后用胶原蛋白酶37 ℃恒温震荡继续消化，每次消化时间严格控制并及时终止消化。此法可将心肌组织分离成单个的心肌细胞，同时保持细胞原有的活性和结构功能。实验中应用差速贴壁法以及BrdU纯化心肌细胞^[22-33]。心脏中的非心肌细胞如成纤维细胞，会在培养过程中成为优势细胞，抑制心肌细胞的存活。利用成纤维细胞快速贴壁的特点，采用两次差速贴壁去除成纤维细胞，并根据其会分裂增殖的特点，加入BrdU，其作用为替代胸腺嘧啶核苷酸完成细胞增殖过程中的碱基配对，瓦解其增殖过程^[8]。此外，心肌细胞的活性还会受到多种因素的影响，如培养基成分、pH值以及温度^[10]。心肌细胞对环境的酸碱十分敏感，pH值控制在7.35-7.40最佳^[5]。培养基中不加双抗理论上更加有助于心肌细胞的贴壁。有研究表明，在细胞培养皿中预先铺置一层含有弹性蛋白原的水凝胶，有助于心肌细胞更好更快的贴壁，保持更高更久的自发搏动性^[1-2^，^6-7]。因为水凝胶具有较好的生物相容性，预计水凝胶涂布法和弹性蛋白原作为细胞培养基材有助于心肌细胞的原代培养，但是也有研究表明水凝胶可能诱发心肌细胞的心律失常表现^[4]。此方法与较成熟的大鼠心肌细胞原代培养技术相比，同样存在可取之处。同样实验条件下，采用胰酶、胶原蛋白酶分步消化SD大鼠乳鼠心肌组织，分离心肌细胞的实验方法，心肌细胞纯度为96%-98%，存活率为96.6%- 98%^[4]。说明此次试验可以得到大量活力好、纯度高的小鼠原代心肌细胞。小鼠乳鼠的心肌细胞的原代培养是心血管疾病基础研究中不可缺少的重要部分。实验通过上述方法可成功培养出纯度高、活力好的小鼠乳鼠心肌细胞，可用于心肌缺血、梗死等多种体外模型的建立中。同时应该为改进完善培养方法继续努力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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