失神经支配在胫骨牵张成骨延长过程中的骨再生及Runx2表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5988-5992.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.016

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失神经支配在胫骨牵张成骨延长过程中的骨再生及Runx2表达

郑科¹，宋冬惠¹，冯兴梅¹，祝颂松²，胡静²，叶斌²

1南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市 226001； 2四川大学华西口腔医学院，四川省成都市 610041

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 宋冬惠，博士，副教授，南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市 226001
作者简介:郑科，男，1991年生，安徽省歙县人，汉族，南通大学口腔专业在读硕士，主要从事口腔颌面外科组织工程学研究。
基金资助:
江苏省“六大人才高峰”项目(2013-WSW-048)资助

Denervation effects on bone regeneration and expression of Runx2 during distraction osteogenesis

Zheng Ke¹, Song Dong-hui¹, Feng Xing-mei¹, Zhu Song-song², Hu Jing², Ye Bin²

1Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China; 2West China School of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Song Dong-hui, M.D., Associate professor, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
About author:Zheng Ke, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
Supported by:
Jiangsu Province Six Talent Peaks, No. 2013-WSW-048

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，去除坐骨神经会导致骨折愈合过程中新生编织骨机械硬度不足，而目前对有关失神经因素在牵张成骨过程中作用的相关报道较少。
目的：构建新西兰大白兔胫骨牵张成骨模型，观察失坐骨神经对牵张成骨过程中新骨形成的影响及Runx2表达的变化。
方法：成年新西兰雄性白兔24只建立兔胫骨牵张成骨延长模型，并随机分为切除坐骨神经组和保留左坐骨神经组。完成牵张6周后，用X射线、骨密度及三维CT重建技术检测已延长的胫骨，组织学分析新骨形成情况。
结果与结论：影像学、组织学检查显示所有实验动物的牵张裂隙中均可发现有新骨生成，Runx2均有不同程度的表达。但与保留左坐骨神经组相比，切除坐骨神经组牵张裂隙中新生骨量较少、矿化程度低，并且Runx2表达量较低。提示失神经支配抑制牵张成骨中新骨的生成及Runx2的表达，神经支配可能在牵张成骨的新骨生成过程中起重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 失神经, 牵张成骨, 新骨形成, Runx2, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: During the healing of fractures, removal of sciatic nerve can result in insufficient mechanical rigidity of newborn woven bone. However, there are less reports concerning the denervation effects during distraction osteogenesis.

OBJECTIVE: To observe the effect of removal of the sciatic nerve on bone regeneration and the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) protein during distraction osteogenesis in a rabbit model.

METHODS: Twenty-four adult male New Zealand rabbits were selected and underwent left tibial osteodistraction to construct animal models of distraction osteogenesis. Before distraction, the animals were randomly divided into group R (resecting the left sciatic nerve) and group I (intact left sciatic nerve). Six weeks after completion of distraction, the animals were killed and the lengthened tibias were harvested for radiography, three-dimensional CT reconstruction, histological evaluation, connectivity density (Conn.D) evaluation.

RESULTS AND CONCLUSION: New regenerated bone was present and Runx2 protein was expressed in the distraction gaps of all animals at the end of the study, as revealed by radiography, three-dimensional CT reconstruction, and histological observation. However, less new bone formation and a lower degree of mineralization and expression of Runx2 protein were observed in group R compared with group I. The results suggest that the denervation appears to have an inhibitory effect on bone formation and the expression of Runx2 protein during distraction osteogenesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tibia, Sciatic Nerve, Bone Regeneration, Biomechanics

中图分类号:

R318

郑科，宋冬惠，冯兴梅，祝颂松，胡静，叶斌. 失神经支配在胫骨牵张成骨延长过程中的骨再生及Runx2表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5988-5992.

Zheng Ke, Song Dong-hui, Feng Xing-mei, Zhu Song-song, Hu Jing2 Ye Bin. Denervation effects on bone regeneration and expression of Runx2 during distraction osteogenesis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5988-5992.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰白兔24只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。 2.2 动物建模后一般状况实验动物均能够耐受外科手术的过程。牵张装置能够在牵张成骨周期中保持其牵张间隙的功能，在整个实验中未见明显感染及骨折。 2.3 X射线检测结果在牵张完成后6周，观察两组样品牵张间隙中的骨再生情况。放射影像学检查结果显示，切除坐骨神经组中牵张区新生骨的骨密度低于保留坐骨神经组中牵张区新生骨的骨密度。这表明失坐骨神经组的牵张区骨生成量较少、具有较低的矿化程度(图1)。 2.4 三维CT重建分析结果在实验结束后，皆使用高分辨率三维CT重建观察两组中所有牵张区以皮质骨连接的骨相接部位。结果显示，与保留坐骨神经组相比，切除坐骨神经组中皮质骨较薄且新生的骨小梁数较少，保留坐骨神经组中牵张区新生骨骨小梁呈现规则的空间结构，骨皮质结构更加完整(图2)。 2.5 组织学检测结果 2.5.1 苏木精-伊红染色两个实验组的新生骨组织标本使用苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察新生成的骨组织结构(图3)。切除坐骨神经组中可观察到纤维组织，及紊乱的、极细微的骨小梁结构；在保留坐骨神经组中，牵张间隙中更厚的相连结骨皮质结构，骨小梁结构更成熟。 2.5.2 免疫组织化学染色保留坐骨神经组Runx2蛋白呈现阳性(图4)。

2.6 统计学检测结果保留坐骨神经组中12份样品的骨密度平均值为21.0(SD2.3) mm^-3，而切除坐骨神经组中骨密度平均值为12.4(SD2.5) mm^-3，t=8.8，P < 0.05(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年1至10月在南通大学动物实验中心完成。

1.3 材料健康成年雄性新西兰白兔24只，体质量 2.5-3.0 kg，由南通大学动物实验中心提供。24枚单边纯钛外固定牵张器由本课题组与四川大学华西口腔医学院共同设计和研制。牵张器最大牵张距离为20 mm，螺距1.0 mm，使用长35 mm、直径1.8 mm纯钛螺钉穿皮质骨固定。鼠抗兔的Runx2单克隆抗体由上海博研生物工程研究中心提供。

实验动物的喂养与使用遵守南通大学动物伦理委员会的有关规定。实验动物的麻醉方式为经静脉的开他敏 (20 mg/kg)及塞拉嗪(5 mg/kg)复合麻醉。

1.4 方法

1.4.1 动物模型建立将兔的左后肢胫骨中部作一长为 1.5 cm的纵行切口，分离肌肉骨膜等软组织，暴露胫骨骨干。在大量生理盐水冷却状态下使用直径为1 mm裂钻对皮质骨行预处理后，旋入4枚直径为1.5 mm纯钛螺钉。在定制的外部牵张器固定于4枚钛钉后，使用超微钻头于胫腓关节下、第2第3钛钉之间处行横向截骨术，术中全程使用大量生理盐水冷却。最后逐层缝合切口。

上述操作后7 d，实验动物被随机分为2组：切除左坐骨神经组(切除坐骨神经组，n=12)及保留左坐骨神经组(保留坐骨神经组，n=12)。全麻情况下，在左后肢侧上部作一长3 cm切口，分离肌间膜后暴露坐骨神经。切除坐骨神经组实验动物切除长为1 cm的坐骨神经，保留坐骨神经组实验动物经同样方法找到坐骨神经后不作切除。

术后7d，所有实验动物的左胫骨以1.0 mm/d (0.5 mm/12 h)的速度进行牵张，总牵张天数为12 d，牵张长度是12 mm。在整个牵张成骨的过程中，所有实验动物的左后肢被悬吊于特定设计的悬吊带中，以排除重力对新骨形成的影响。完成牵张后6周，所有实验动物以注射过量戊巴比妥(150 mg/kg)的方式被处死。

1.4.2 X射线检测及三维CT重建分析收集牵张后的胫骨。胫骨样本被放置于距X射线管30 cm处。设置X射线放射参数为电压70 kV、电流7 mA，曝光时间为0.06 ms。用分辨率为2 048×2 048像素、体素大小为10 μm的台式微电脑断层摄影术(μ CT-80；Scanco Medical，Bassersdorf，Switzerland)进行CT扫描。完成影像学检测后，胫骨样本被截取为包涵牵张部位的长为30 mm的片段。样本片段被置于体积分数4%甲醛缓冲液中以避免脱水。

1.4.3 组织学检测将每组的12份样品，于体积分数4%甲醛缓冲液中固定24 h，后置于EDTA缓冲液中，于恒温培养箱中脱钙处理8周。然后每组随机选取6份样品包埋于石蜡中。显微镜用薄片切片机纵向切取厚度为6 μm切片，切片采用苏木精-伊红染色。每组剩余的6份样品行免疫组织化学分析，定性测定Runx2蛋白表达。采用鼠抗兔Runx2抗体，进行锚定，具体操作详见产品说明书。二抗采用羊抗兔IgG，具体操作遵循产品说明书。后置于光学显微镜下观察细胞，明确Runx2的表达。

1.4.4 骨密度检测将胫骨牵张成骨标本置于双能X线骨密度检测仪(challen ger FR216Ⅲ1438，DMS，france由四川大学华西医院提供)的检测台上，采用小动物测量模式，手动选取10 mm感兴趣区，由同一操作人员在不知道的情况下重复测量3次，取平均值，记录下骨矿密度数值，最后结果取平均值。

1.5 主要观察指标 ①两组兔牵张区X射线检测和三维CT重建分析结果。②两组兔新生骨组织苏木精-伊红染色结果及免疫组织化学染色Runx2蛋白表达。

1.6 统计学分析数据以平均数形式呈现，运用SPSS 17.0软件进行配对t 检验分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

既往研究显示，在大鼠骨折愈合模型中，失神经支配会导致骨组织形成减弱^[5-6]。这表明在骨组织代谢过程中，健全的神经支配发挥着重要性。作者通过切除牵张间隙同侧坐骨神经，建立失神经支配的牵张成骨实验动物模型，从而研究在牵张成骨过程中失神经支配对骨再生的影响。已有报道显示，失神经支配能够导致单侧后肢失用^[9]，普遍认为，这种废用在牵张成骨中是不利因素需加以避免。因此，为了排除此种失用的影响，实验动物的后肢被悬吊于特制的吊环上。在完成8周的牵张后，影像学及组织学检测结果均显示失神经支配的实验动物中，新骨形成较少且矿化程度较低。失去坐骨神经组动物的牵张间隙中，新生骨组织的骨密度分析参数较低，本实验结果显示失神经在牵张成骨中会抑制骨再生。已有研究显示，Runx2蛋白在骨组织形成、成骨细胞分化方面有重要作用，在成骨细胞分化的信号途径中起关键作用^[10]。骨形态发生蛋白能过促进软骨细胞、成骨细胞的分化，进而促进软骨组织、骨组织的形成。而骨形态发生蛋白/smads信号的靶目标是Runx2，有研究证据支持Runx2与骨形态发生蛋白信号在成骨基因表达的协同作用^[11]。近年研究显示Runx2通过MAPK信号通路参与骨细胞分化调节，促进软骨细胞表达血管内皮细胞生长因子，诱导血管向软骨组织生长，促进软骨成骨^[10^，¹²^]。Sun等^[1³^]将Runx2基因修饰的腺病毒转染至兔脂肪间充质干细胞，并将干细胞导入兔下颌骨牵张间隙中，结果显示实验组Runx2基因表达较对照组明显升高，新生骨组织密度亦较对照组高。神经系统在骨代谢中扮演着重要角色。Hurrell^[1⁴^]发现成骨细胞周围神经纤维影响着骨组织的生长和改建，去坐骨神经可使大鼠骨折愈合过程中编织骨机械强度减弱^[5^，¹⁵^]。此外，实验还发现神经细胞通过释放神经肽类物质如降钙素基因相关肽、酪氨酸羟化酶、血管肠肽等以调节骨细胞功能^[4]。同样，肾上腺素类递质作为一种强效神经递质对骨细胞功能有调控作用，有研究显示，与去甲肾上腺素共培养的间充质干细胞成骨分化能力受抑制，Runx2等被认为有益于成骨的基因表达受抑制，这提示成骨作用可能有自主神经系统参与^[1⁶^-1⁸^]。雷德林等^[1⁹^]在研究离断下牙槽神经对下颌骨牵张成骨影响的试验中证实，下牙槽神经离断后，该侧牵张区新骨的生物力学强度不足，提示在牵张成骨的新骨形成中，感觉神经起一定的调控作用。牵张成骨是一个包含了骨组织形成与重吸收的动态过程^[²⁰^]。在牵张缝隙中，机械刺激促使成骨细胞增殖与分化^[2^1-22^]。这些成骨细胞的代谢活动受到包括神经调节因子在内的多种因子的调控^[2^3-24^]。这些包括Runx2在内的成骨调节因子的合成与分泌受到失神经支配的影响，以降钙素基因相关肽与P物质的量在失神经支配后显著减少而体现，而P物质被证明有益于牵张成骨中新骨的形成^[2⁵^-2⁸^]。此外，上述神经调节因子的缺乏被证明是导致骨质疏松的原因之一^[2^，⁴^，^29-31^]。这提示骨质吸收在失神经支配后会加速。本实验结果显示，在牵张成骨过程中失神经支配将导致愈合组织内骨形成障碍，在此过程中Runx2基因的表达降低，可能参与了骨形成障碍的发生。这一事实亦证明保留神经支配对牵张成骨的骨组织形成具有重要意义，这也为临床牵张成骨技术的应用提供新的参考与思路，为其广泛、有效的应用成为可能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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骨延长的适应症及其意义：
1.伴有外伤、骨感染症、先天性骨短缩、肿瘤及症侯群存在下肢不等长者。如果2cm以上肢短缩，走起路来，跛行明显，通过骨延长术一旦补足短缩的长度，步态可以改善。
2.手指短缩。手工作上，穿鞋子、穿衣服时，有时不自由，通过手指的延长术，不仅外观改善，机能也能得到改善。
3.因肿瘤及先天性的原因，前壁及下肢不等长，不均衡，会引起磷近的关节的畸形及机能不全。通过骨延长术，骨的长度调整后，有时畸形也能得到矫正。
4.有人因先天性多发性软骨形成不全（侏儒症）骨代谢性疾病，上下肢成长障碍者，由于身材矮小，难以利用自动取款机和公用电话，时常感到日常生活不自由，有的人连大便坐便也上不去。有的连电微锅炉，公用电话都够不到，由于大腿过短而不能伸坐在椅子上，小腿短缩，坐在椅子上足不能着地，而造成坐位不稳。
另一方面，上肢如果短缩，日常生活动作在很多情况下会引起功能障碍。例如学习及读书时，由于两肘不能安定而难以保持良好的姿势，坐位在原位移动时，不能用手支撑上肢，走路时躯干的平衡也难以维护。排便后手够不到后边擦屁股，在生活上也成了问题。
四肢骨的延长术，在软骨发育不全（侏儒症）的患者，不仅外观上能得到改善，而且在日常生活上也能大大改善。
5.脊椎管狭窄症是侏儒症的严重合并症，必须尽力减轻转移向椎管的负担；上肢骨的延长能缓和移向椎管狭窄症的负担，有预防脊椎变性的功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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