印苦楝内酯调节破骨细胞分化及凋亡缓解骨质疏松症

doi:10.12307/2026.260

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (35): 9120-9127.doi: 10.12307/2026.260

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印苦楝内酯调节破骨细胞分化及凋亡缓解骨质疏松症

李文豪，张巍，李文明，夏文宇，吴泽彬，耿德春

苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2025-08-24 修回日期:2026-01-04 出版日期:2026-12-18 发布日期:2026-04-24
通讯作者: 耿德春，博士，研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:李文豪，男，1999年生，湖南省衡阳市人，汉族，硕士，主要从事骨质疏松及骨免疫相关基础研究。
基金资助:
江苏省研究生科研与实践创新计划(KYCX243339)，项目负责人：李文明

Nimbolide relieves osteoporosis by regulating osteoclast differentiation and apoptosis

Li Wenhao, Zhang Wei, Li Wenming, Xia Wenyu, Wu Zebin, Geng Dechun

Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2025-08-24 Revised:2026-01-04 Online:2026-12-18 Published:2026-04-24
Contact: Geng Dechun, PhD, Researcher, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Li Wenhao, MS, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
Graduate Research and Practice Innovation Program of Jiangsu Province, No. KYCX243339 (to LWM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
印苦楝内酯：是一种从印度苦楝树的花和叶中提取的三萜类活性化合物，已被证明具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌感染等多种生物活性。
骨质疏松：是一种以低骨量、骨小梁微结构破坏及病理性骨折易感性显著升高为特征的系统性骨代谢障碍，核心病理机制在于破骨细胞介导的骨吸收-成骨细胞介导的骨形成偶联失衡，其中破骨细胞异常分化驱动的病理性骨丢失被视为疾病进展的核心驱动因素。

背景：印苦楝内酯是一种三萜类活性化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌感染等多种生物活性。然而，印苦楝内酯是否可以通过调节破骨细胞分化及凋亡而减轻骨质疏松症仍未见报道。
目的：探讨印苦楝内酯对破骨细胞分化、凋亡以及骨质疏松症的影响。
方法：①细胞实验：将小鼠骨髓来源巨噬细胞分为4组，对照组使用含巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基培养，破骨诱导组使用含巨噬细胞集落刺激因子及核因子κB受体活化因子配体的α-MEM完全培养基培养，印苦楝内酯低、高剂量组在破骨诱导分化培养基中加入100 nmol/L或200 nmol/L印苦楝内酯培养。抗酒石酸酸性磷酸酶染色、Annexin V-FITC/PI染色和RT-qPCR检测印苦楝内酯对破骨细胞分化及破骨细胞凋亡的影响。②体内实验：将24只8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术组仅切除卵巢周围脂肪，模型组切除双侧卵巢，印苦楝内酯低、高剂量组在造模后腹腔注射5，10 mg/kg印苦楝内酯溶液，每2 d注射1次，造模8周后收集血清及股骨进行相关检测。
结果与结论：①细胞实验：RT-qPCR以及抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，印苦楝内酯可以抑制破骨分化相关基因的表达，抑制体外破骨细胞分化；RT-qPCR以及Annexin V-FITC/PI染色结果显示，印苦楝内酯可以抑制凋亡相关基因的表达，诱导成熟破骨细胞凋亡；RT-qPCR结果显示印苦楝内酯可以通过Fas/Fasl信号通路促进破骨细胞凋亡，且印苦楝内酯对破骨细胞分化及凋亡的调节作用呈现浓度依赖性。②动物实验：Micro-CT以及苏木精-伊红染色结果显示，印苦楝内酯可以减少雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的骨质流失，且10 mg/kg印苦楝内酯效果更好；印苦楝内酯对去卵巢小鼠血清雌二醇水平无显著影响。结果表明：体外实验证实印苦楝内酯不仅可以抑制破骨细胞分化，还可以促进成熟破骨细胞凋亡；体内实验证实印苦楝内酯可以减轻雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的过量骨丢失。

https://orcid.org/0000-0001-8720-5196 (李文豪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 印苦楝内酯, 破骨细胞分化, 破骨细胞凋亡, 骨质疏松症, 绝经后骨质疏松症, 骨破坏, 破骨细胞, 骨稳态

Abstract: BACKGROUND: Nimbolide, a triterpenoid bioactive compound, exhibits multiple biological activities including anti-inflammatory, antioxidant, antitumor, and antibacterial effects. However, its potential to alleviate osteoporosis by regulating osteoclast differentiation and apoptosis remains unreported.
OBJECTIVE: To investigate the effects of nimbolide on osteoclast differentiation, osteoclast apoptosis, and osteoporosis.
METHODS: (1) Cell experiments: Mouse bone marrow-derived macrophages were divided into four groups: the cells were cultured in α-MEM complete medium containing macrophage colony-stimulating factor in the control group; the cells were cultured in α-MEM complete medium containing macrophage colony-stimulating factor and receptor activator of nuclear factor-κB ligand in the osteoclast induction group; the cells were cultured in osteoclast-inducing differentiation medium supplemented with 100 nmol/L or 200 nmol/L nimbolide, respectively in the low- and high-dose nimbolide groups. The effects of nimbolide on osteoclast differentiation and apoptosis were assessed using tartrate-resistant acid phosphatase staining, Annexin V-FITC/PI staining, and RT-qPCR. (2) In vivo experiments: Twenty-four 8-week-old female C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: The mice in the sham group underwent only removal of perovarian fat; the mice in the model group underwent bilateral ovariectomy. The low-dose and high-dose nimbolide groups received intraperitoneal injections of 5 mg/kg and 10 mg/kg nimbolide solutions, respectively, every 2 days after modeling. Serum and femoral samples were collected after 8 weeks of modeling for relevant analyses.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell experiments: RT-qPCR and tartrate-resistant acid phosphatase staining revealed that nimbolide inhibited the expression of osteoclast differentiation-related genes and suppressed osteoclast differentiation in vitro. RT-qPCR and Annexin V-FITC/PI staining demonstrated that nimbolide suppressed the expression of apoptosis-related genes and induced apoptosis in mature osteoclasts. RT-qPCR results demonstrated that nimbolide promotes osteoclast apoptosis through the Fas/Fasl signaling pathway, with its regulatory effects on osteoclast differentiation and apoptosis exhibiting concentration-dependent properties. (2) Animal experiments: Micro-CT and hematoxylin-eosin staining results demonstrated that nimbolide reduced bone loss in estrogen-deficient osteoporotic mice, with a more pronounced effect at 10 mg/kg; nimbolide had no significant impact on serum estradiol levels in ovariectomized mice. In vitro experiments confirm that nimbolide not only inhibits osteoclast differentiation but also promotes apoptosis in mature osteoclasts. In vivo experiments confirm that nimbolide can mitigate excessive bone loss in estrogen-deficient osteoporosis in mice.

Key words: nimbolide, osteoclast differentiation, osteoclast apoptosis, osteoporosis, postmenopausal osteoporosis, bone destruction, osteoclasts, bone homeostasis

中图分类号:

李文豪, 张巍, 李文明, 夏文宇, 吴泽彬, 耿德春. 印苦楝内酯调节破骨细胞分化及凋亡缓解骨质疏松症[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9120-9127.

Li Wenhao, Zhang Wei, Li Wenming, Xia Wenyu, Wu Zebin, Geng Dechun. Nimbolide relieves osteoporosis by regulating osteoclast differentiation and apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(35): 9120-9127.

图/表（结果） 4

2.1 印苦楝内酯对骨髓来源巨噬细胞毒性的影响印苦楝内酯是从印楝中分离出的一种分子式为C27H30O7、相对分子质量为466.52的三类活性化合物(图1A)。为了确定印苦楝内酯干预浓度对骨髓来源巨噬细胞活性是否有影响，将骨髓来源巨噬细胞分别暴露于不同浓度(0，50，100，200，400 nmol/L)的印苦楝内酯中培养24，72 h，采用CCK-8实验检测印苦楝内酯对细胞的毒性。实验结果显示，400 nmol/L浓度以下的印苦楝内酯干预24，72 h对吸光度值没有显著影响(图1B)，对细胞存活率也无显著影响(图1C，D)。综上所述，此研究选取的印苦楝内酯干预浓度对细胞没有毒性。因此，将100 nmol/L和200 nmol/L确定为印苦楝内酯的体外细胞干预浓度。
2.2 印苦楝内酯抑制核因子κB受体活化因子配体诱导骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化干预5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，破骨诱导组骨髓来源巨噬细胞融合成大量抗酒石酸酸性磷酸酶阳性的多核破骨细胞(图2A)。与破骨诱导组相比，印苦楝内酯干预后破骨细胞形成显著减少，且200 nmol/L印苦楝内酯的抑制效果明显优于100 nmol/L印苦楝内酯(图2B)。此外，进一步采用RT-qPCR检测印苦楝内酯对破骨细胞相关基因Mmp9、Ctsk、Acp5、Nfatc1、c-Fos以及Oscar表达的影响。干预3 d后，破骨诱导组上述破骨细胞相关基因表达较对照组显著增加，而印苦楝内酯干预显著抑制了上述破骨细胞相关基因的表达，且这种效应具有浓度依赖性(图2C，D)。结果表明，印苦楝内酯可以在体外抑制破骨细胞分化。
2.3 印苦楝内酯可以促进成熟破骨细胞凋亡与破骨诱导组相比，印苦楝内酯干预明显促进了成熟破骨细胞的凋亡，且200 nmol/L印苦楝内酯促凋亡效果明显优于100 nmol/L印苦楝内酯(图3A)。进一步采用RT-qPCR检测凋亡相关基因的表达，印苦楝内酯干预显著促进了Bax、Bak、Cytochrome c和Caspase3的表达，同时抑制了Bcl2的表达，且呈现浓度依赖性(图3B)；此外，印苦楝内酯干预显著促进了Fas及Fasl的表达，同样呈现浓度依赖性(图3C)。上述结果表明，印苦楝内酯可以在体外通过激活Fas/Fasl信号通路促进成熟破骨细胞的凋亡。
2.4 印苦楝内酯干预抑制雌激素缺乏引发的过量骨丢失骨小梁区域三维重建结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠骨小梁结构稀疏程度明显增加，表明双侧卵巢去势成功诱导了小鼠的骨质疏松症状。而在印苦楝内酯干预后，骨小梁结构得到部分恢复，疏松程度也得到明显改善(图4A)。苏木精-伊红染色也观察到骨小梁结构增加(图4B)。对感兴趣区域的骨参数进行分析发现，模型组小鼠骨密度、骨体积分数和骨小梁数目均显著下降，同时骨小梁分离度显著增加；印苦楝内酯干预后，小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目以及骨小梁分离度均得到显著改善。然而，印苦楝内酯低、高剂量组仅骨体积分数和骨小梁数目指标存在显著性差异(图4C)。此外，小鼠血清雌二醇水平检测结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠血清雌二醇水平明显下降，而印苦楝内酯干预对小鼠血清雌二醇水平无显著影响(图4D)。以上实验结果表明，印苦楝内酯可以减少卵巢去势小鼠骨质丢失。

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引言

骨质疏松症是一种常见的慢性代谢性骨科疾病，主要特征是由于多种因素引起的骨矿物质密度降低和骨组织微结构破坏，这可能导致骨骼脆性和骨折易感性增加[1-3]。研究表明，骨骼健康状态受到骨稳态的直接影响。骨稳态是指骨组织代谢过程中成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡状态[1，4]。当骨吸收超过骨形成时，会破坏骨稳态，最终引发骨质疏松症[5]。随着世界人口老龄化的加速，骨质疏松症在人类生活中变得越来越普遍，目前全世界有超过2亿人患有骨质疏松症[6]。临床常用的治疗骨质疏松症的药物包括双膦酸盐、降钙素和选择性雌激素受体调节剂等[7-9]。尽管这些药物可以恢复骨骼强度，但是也会导致骨应变降低，而且有些临床药剂价格昂贵，不良反应严重，需要长期使用[10-11]。因此，开发新型有效药物迫在眉睫，而解决这一需求则需科研人员深入解析骨质疏松症的病理机制。
破骨细胞是来源于骨髓单核/巨噬细胞谱系的介导机体骨吸收作用的关键细胞。当骨髓单核/巨噬细胞谱系受到巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)共同刺激时，可以分化为破骨细胞[12-13]，随后分化的破骨细胞通过分泌氢离子、基质金属蛋白酶以及组织蛋白酶K引起骨基质降解，导致骨吸收过度进而引起骨质疏松症[14-15]。调节破骨细胞分化和凋亡被认为是治疗骨质疏松症的重要方法[16-17]。
印苦楝内酯(Nimbolide)是一种从印度苦楝树的花和叶中提取的三萜类活性化合物[18]，已被证明具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌感染等多种生物活性[19]。最近的研究表明，印苦楝内酯可以通过抑制炎症反应缓解大鼠佐剂性关节炎，还可以通过Toll样受体途径减轻炎症细胞浸润，抑制类风湿性因子，改善血沉[20]。然而，印苦楝内酯是否可以通过抑制破骨细胞分化而减轻骨质疏松症仍未见报道。该研究探讨印苦楝内酯对破骨细胞的影响，并在卵巢切除小鼠体内验证其抗破骨细胞效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2023年5月至2025年1月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 24只雌性C57BL/6J小鼠，SPF级，6-8周龄，体质量15-20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SYXK(沪)2022-0012，小鼠饲养于SPF级动物房，可自由获取食物及水。动物实验通过苏州大学动物伦理委员会批准(批准号：SUDA20230605A32)。
1.3.2 实验试剂印苦楝内酯(MCE公司)，胎牛血清(诺唯赞公司)，α-MEM培养基(HyClone公司)，青/链霉素双抗(索莱宝公司)，核因子κB受体活化因子配体(R&D公司)，巨噬细胞集落刺激因子(R&D公司)，总RNA提取试剂(诺唯赞公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(碧云天公司)，组织固定液(塞维尔公司)，无菌PBS(塞维尔公司)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(碧云天公司)，小鼠雌二醇ELISA检测试剂盒(科艾博生物公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞提取及培养将6-8周龄C57BL/6J小鼠麻醉后迅速脱颈处死，用灭菌的手术器械分离出双侧股骨和胫骨，随后放入无菌PBS清洗。在无菌操作台内，将分离后的股骨和胫骨依次用体积分数75%乙醇、无菌PBS、体积分数75%乙醇、无菌PBS浸泡、清洗和消毒各3 min，随后用灭菌后的外科剪剪掉胫骨、股骨两端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器抽吸含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基冲洗骨髓腔直至变白，将冲洗液移入15 mL离心管，1 200 r/min离心3 min，弃上清，加入红细胞裂解液裂解骨髓红细胞3 min，1 200 r/min离心3 min，弃上清，用α-MEM完全培养基重悬骨髓细胞沉淀，接种至细胞培养皿，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养16-24 h后全换液，用预热好的培养基润洗1遍，1 200 r/min离心3 min，用含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子、体积分数10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基充分吹打混匀细胞，接种至培养皿贴壁一两天，贴壁细胞为骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)。
1.4.2 CCK-8实验使用CCK-8实验探究不同浓度印苦楝内酯(0-400 nmol/L)对骨髓来源巨噬细胞的影响。首先，用无菌细胞刮板将培养皿的骨髓来源巨噬细胞刮下，以5 000个/孔的细胞密度将骨髓来源巨噬细胞种植于96孔板中，于培养箱中培养24 h待细胞贴壁后，每孔加入10 μL不同浓度的印苦楝内酯(0，50，100，200，400 nmol/L)，继续培养24，72 h时，将每孔培养基更换为α-MEM完全培养基，随后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值。
1.4.3 破骨细胞分化诱导将骨髓来源巨噬细胞按4×105个/孔或2×104个/孔细胞密度分别接种于6孔或24孔细胞培养板中，加入含有30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基培养8 h，待细胞贴壁后，去除旧培养基，将细胞分为4组进行干预：对照组使用含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基培养，破骨诱导组使用破骨诱导分化培养基(含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体的α-MEM完全培养基)培养。根据前期文献报道[21]，选取100 nmol/L和200 nmol/L作为印苦楝内酯低剂量和高剂量。印苦楝内酯低、高剂量组在破骨诱导分化培养基中加入100 nmol/L或200 nmol/L印苦楝内酯进行干预，干预3-5 d后进行相应检测。
1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色将骨髓来源巨噬细胞按照2×104个/孔的细胞密度种植于24孔板中，按照1.4.3描述对细胞进行分组干预。干预5 d后，去除培养基，用预冷PBS润洗细胞3次，使用40 g/L多聚甲醛固定15 min，去除多聚甲醛，用预冷PBS润洗细胞3次。根据试剂说明书使用抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒对细胞进行染色。染色结束后，显微镜观察并拍摄破骨细胞图像，≥3个细胞核的细胞即破骨细胞，使用Image J对每组的破骨细胞数量进行定量分析。
1.4.5 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 将骨髓来源巨噬细胞按照4×105个/孔的细胞密度种植于6孔板中，按照1.4.3描述对细胞进行分组干预。干预3 d后，去除培养基，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，用氯仿提取总RNA，采用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA浓度及纯度。然后，取1 μg 总RNA，根据cDNA反转录试剂盒操作手册构建20 μL反转录体系，将总RNA反转录合成cDNA。将SYBR与上、下游引物、DEPC水按扩增试剂盒说明书混合，加入荧光定量专用的PCR 96孔板，然后加入反转录所得的cDNA，充分混匀后上机，进入qPCR扩增流程：初始变性阶段95 ℃维持10 min实现双链解离，之后进入循环扩增阶段，每个循环包含95 ℃变性15 s与60 ℃退火/延伸复合步骤60 s，共计40个循环；以Gapdh为内源性参照进行标准化校准，利用2-ΔΔCT计算基因的相对表达量。

引物购自中国生工生物工程股份有限公司，引物序列见表1。

1.4.6 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测将骨髓来源巨噬细胞按照4×105个/孔的细胞密度种植于6孔板中，加入含有30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基培养8 h，待细胞贴壁后，去除旧培养基，将细胞分为4组进行干预：对照组使用含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基培养，破骨诱导组以及印苦楝内酯低、高剂量组使用破骨诱导分化培养基(含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体的α-MEM完全培养基)培养，3 d后换液，印苦楝内酯低、高剂量组在破骨诱导分化培养基中加入100 nmol/L或200 nmol/L印苦楝内酯干预3 d。干预结束后，使用胰蛋白酶消化，1 200 r/min离心3 min，收集细胞沉淀，用预冷PBS清洗细胞3次，再次1 200 r/min离心3 min获取细胞。根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书所述对细胞进行染色，染色结束后上流式细胞仪检测。
1.4.7 构建小鼠卵巢切除模型根据实验设计，24只C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术组、模型组、印苦楝内酯低剂量组和印苦楝内酯高剂量组，每组6只。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)，待麻醉起效后，用剃须刀剔除背部正中5 cm×5 cm区域的毛发，碘伏消毒后沿背部中线切开皮肤，逐层分离皮肤和肌层，在肾脏下缘脂肪垫定位卵巢，结扎输卵管后切除双侧卵巢。假手术组仅切除卵巢周围脂肪。术后逐层缝合手术切口，在原环境继续饲养，术后第2天印苦楝内酯低、高剂量组小鼠腹腔注射5，10 mg/kg印苦楝内酯溶液[22]，模型组和假手术组注射等体积无菌PBS，每2 d注射1次。在造模后第8周，采用眼球取血法获取小鼠全血，然后麻醉状态下快速脱颈处死，收集股骨组织固定于组织固定液中。
1.4.8 Micro-CT断层扫描采用高精度显微断层成像系统(SkyScan 1076，Bruker MicroCT，比利时)进行骨组织样本扫描及骨微结构定量分析。
扫描参数设置如下：电流800 μA，电压50 kV，分辨率18 μm。扫描结束后，选取股骨远端生长板上方区域(100层×9 μm)作为感兴趣区分析骨小梁结构破坏情况，并进行二维和三维图像重建，分析骨组织形态计量参数，包括骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁分离度等。
1.4.9 苏木精-伊红染色 Micro-CT扫描后的股骨用于形态学分析。股骨依次完成脱钙处理、梯度脱水、二甲苯透明化、石蜡浸渍及包埋等前处理工序，最终制备成5 μm厚度的组织切片。将烘烤后的组织切片分别置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡
15 min，彻底清除石蜡成分；脱蜡结束后按照下列顺序进行梯度水化：无水乙醇浸泡2次，3 min/次；体积分数95%，90%，80%，70%乙醇各浸泡3 min，终末以去离子水水化3 min；复水后的玻片首先浸入改良型Harris苏木精染液中染色2 min，随后进行5次水洗(1 min/次，总时长约5 min)，接着在1%盐酸乙醇分化液中分化1 min，去离子水水洗1 min，将样本浸入1%伊红染液复染3 min，用流动水持续冲洗3 min；依次采用体积分数95%乙醇(重复2次，每次3 min)、无水乙醇(重复2次，每次3 min)、二甲苯溶液(重复2次，每次5 min)进行脱水透明处理；处理完毕的切片置于通风橱内自然干燥后，用中性树脂封固，显微镜观察。
1.4.10 雌二醇水平检测采用眼球取血法获取小鼠全血，血液样本置于冰上静置25 min，然后4 ℃、3 000 r/min离心15 min后获取血清，随后对试剂盒的样本孔、标准品孔、空白孔进行布局。按照说明说要求和板布局依次加样：标准品孔加入50 μL各浓度标准品，样品孔加入50 μL样品，空白孔不加样；加样结束后，加入100 μL辣根过氧化物酶标记的雌二醇抗体，37 ℃避光孵育1 h；孵育结束后，移除板内液体，使用吸水纸拍打干燥，加入洗涤液，反复洗涤5次，每次1 min；拍干残液，每孔加入A、B液各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；孵育结束后，每孔加入终止液50 μL，使用酶标仪检测各孔吸光度值(波长450 nm)，最后根据标准品浓度以及标准品吸光度值绘制曲线，根据曲线方程计算样本浓度。
1.5 主要观察指标印苦楝内酯对破骨细胞形成、成熟破骨细胞凋亡和雌激素缺乏小鼠骨量丢失的调控作用。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 10.0进行统计分析。连续变量资料以x±s表示。首先对数据进行正态性检验，对于符合正态分布的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，对于不符合正态分布的数据采用非参数Kruskal-Wallis H检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

骨骼健康取决于成骨细胞介导的骨生成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡[23-24]。既往研究已证明，绝经后骨质疏松症存在过度的骨吸收活动，这导致了机体骨微结构破坏和骨丢失[25-27]。破骨细胞作为唯一具有骨吸收功能的多核巨细胞，对维持骨骼系统的稳态至关重要，其形成主要受两种关键细胞因子(核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子)的调节[28-30]。尽管在治疗骨质疏松症方面已经取得了很大的进展，但是仍然需要进一步开发针对破骨细胞起源的疗法。目前，已经开发出多种抗骨质疏松药物，如双膦酸盐、地舒单抗和特立帕肽等[31-32]。尽管双膦酸盐可有效减缓骨质流失，但仍存在胃肠道反应和不典型骨折等不可避免的不良反应[33-34]。地舒单抗可以通过阻断核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号抑制破骨细胞分化及成熟来治疗绝经后骨质疏松症，但是值得注意的是，地舒单抗应用后的颌骨坏死和严重感染等严重不良事件也已经有相关报道[35-36]。因此，迫切需要有效以及安全的抑制破骨细胞分化及功能的新治疗药物。目前的实验结果表明，印苦楝内酯可以通过抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化并促进成熟破骨细胞凋亡，有效抑制卵巢切除诱导的骨丢失，这些结果证明印苦楝内酯可以作为一种有前途的骨质疏松症治疗药物。
印苦楝内酯是一种柠檬苦素类四降三萜化合物，大量存在于苦楝树的叶子和花中。既往研究显示，印苦楝内酯不仅在多种癌细胞中发挥有效的抗增殖作用和化疗功能，还具有抗炎和抗氧化功能。KATOLA等[21]研究表明，印苦楝内酯可以靶向多种信号通路从而抑制小胶质细胞的神经炎症反应。最近研究还证明了印苦楝内酯在糖尿病性心肌病中的重要作用[37]。ZHANG等[22]发现印苦楝内酯可以通过蛋白激酶B/ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径调节内质网应激和线粒体功能来预防糖尿病性心肌病。此外，印苦楝内酯可以通过Toll样受体信号通路以及信号转导和转录活化因子3/核因子κB/Notch1信号通路缓解类风湿关节炎[20，38]。还有研究表明，印苦楝内酯联合甲氨蝶呤治疗可以强化抗关节炎作用，并通过抗炎和抗氧化作用显著降低甲氨蝶呤产生的肝肾毒性[39]。
通过RT-qPCR检测结果显示印苦楝内酯干预后破骨细胞相关基因表达显著降低，且这种抑制作用具有浓度依赖性。此外，抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果也证实了印苦楝内酯对破骨细胞分化的抑制作用。最近的研究表明，诱导成熟破骨细胞凋亡也是治疗破骨细胞介导的骨科疾病的重要方式[40-41]。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测结果表明，印苦楝内酯干预显著促进了成熟破骨细胞凋亡，进一步通过RT-qPCR检测结果显示印苦楝内酯干预显著促进了凋亡相关基因的表达，且这种促凋亡作用是通过Fas/Fasl信号通路介导的。现有数据表明，Fasl基因显著上调与Caspase3激活有高度同步性，结合Annexin V-FITC/PI检测结果，提示印苦楝内酯可能通过Fas/Fasl外源性凋亡通路触发破骨细胞程序性死亡。但是，在骨髓来源巨噬细胞诱导的破骨细胞中常少量混杂其他细胞，因此，未来仍需要进一步探究这些混杂细胞对结果的影响。
基于印苦楝内酯在体外对破骨细胞分化及凋亡的调节作用，进一步在卵巢去势小鼠模型中验证了其体内治疗效果。实验结果证实，腹腔注射印苦楝内酯可缓解雌激素缺乏诱导的过量骨质丢失，这表明印苦楝内酯可以通过调节破骨细胞分化及破骨细胞凋亡缓解骨质疏松症。但值得注意的是，HUO等[42]发现印苦楝内酯干预改善了糖皮质激素诱导的骨质疏松症状，且他们在研究中还发现印苦楝内酯干预显著改善了血清雌二醇水平。而在此实验中，虽然已去除了雌激素的最大来源器官卵巢，但鉴于体内其他器官也可产生少量雌激素，结果显示印苦楝内酯干预对小鼠血清雌二醇水平无显著影响。
实验结果表明，印苦楝内酯可能作为潜在的抗骨质疏松症候选药物，其通过调控破骨细胞分化及凋亡抑制破骨细胞介导的骨丢失，这为开发新型骨保护疗法提供了创新性理论依据和转化医学视角。然而，印苦楝内酯的分子作用网络及体内代谢稳定性仍存在研究缺口，需结合基因编辑模型、药代动力学分析以及靶点与蛋白质的相互作用来进一步验证。关于印苦楝内酯对破骨细胞的细胞周期的影响也需要进一步研究。
综上所述，印苦楝内酯可以通过抑制破骨细胞分化、促进Fas/Fasl介导的破骨细胞凋亡缓解雌激素缺乏介导的骨质疏松症。目前的实验结果不仅为骨质疏松症的治疗提供了新策略，亦提示印苦楝内酯在骨关节炎等病理场景中可能具有多维度干预潜力。未来研究需系统评估印苦楝内酯的生物利用度、器官特异性毒性及长期用药风险，以推动从基础研究向临床应用的跨越。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

印苦楝内酯调节破骨细胞分化及凋亡缓解骨质疏松症

Nimbolide relieves osteoporosis by regulating osteoclast differentiation and apoptosis

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