机器学习联合生物信息学筛选与自噬相关的肺纤维化关键基因及实验验证

doi:10.12307/2025.971

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (35): 7679-7689.doi: 10.12307/2025.971

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

机器学习联合生物信息学筛选与自噬相关的肺纤维化关键基因及实验验证

巩月红1，2，王梦君3，任航3，郑辉3，孙佳佳3，刘军鹏3，张飞3，杨建华1，2，胡君萍4

1新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆药物临床研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；新疆医科大学，3临床医学部，4药学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830017

收稿日期:2024-11-04 接受日期:2024-12-31 出版日期:2025-12-18 发布日期:2025-05-07
通讯作者: 胡君萍，博士，教授，博士生导师，新疆医科大学药学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830017 并列通讯作者：杨建华，博士，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；新疆药物临床研究重点实验室带头人，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:巩月红，女，1976年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，硕士，副主任药师，主要从事新疆地产新药抗肺纤维化研究。并列第一作者：王梦君，女，2002年生，河北省张家口市人，汉族，主要从事新疆地产新药抗肺纤维化研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区卫生健康委员会“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划项目(TSYC202301B095)，项目负责人：巩月红；新疆维吾尔自治区大学生创新训练计划项目(S202310760059)，项目负责人：王梦君；新疆维吾尔自治区科学技术厅自然科学基金重点项目(2021D01D11)，项目负责人：胡君萍；新疆医科大学第一附属医院创新团队培养项目(党字[2023]52号)，项目负责人：杨建华

Machine learning combined with bioinformatics screening of key genes for pulmonary fibrosis associated with cellular autophagy and experimental validation

Gong Yuehong1, 2, Wang Mengjun3, Ren Hang3, Zheng Hui3, Sun Jiajia3, Liu Junpeng3, Zhang Fei3, Yang Jianhua1, 2, Hu Junping4

1Pharmaceutical Department of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3School of Clinical Medicine, 4School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2024-11-04 Accepted:2024-12-31 Online:2025-12-18 Published:2025-05-07
Contact: Hu Junping, PhD, Professor, Doctoral supervisor, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Co-corresponding author: Yang Jianhua, PhD, Professor, Doctoral supervisor, Pharmaceutical Department of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Gong Yuehong, Master, Associate chief pharmacist, Pharmaceutical Department of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Wang Mengjun, School of Clinical Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Gong Yuehong and Wang Mengjun contributed equally to this work.
Supported by:
The “Tianshan Talents” high-level medical and health personnel training plan of the Health Commission of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No.TSYC202301B095(to GYH); Xinjiang Medical University Student Innovation Training Program, No. S202310760059 (to WMJ); Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2021D01D11 (to HJP); Innovation Team Training Project of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. [2023]52 (to YJH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肺纤维化：是一类以成纤维细胞增殖和大量细胞外基质聚集，伴随炎症损伤和组织结构破坏为特征的肺疾病。
自噬：又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是细胞为了应对饥饿、缺氧等外界环境条件刺激下出现的一种破坏蛋白质和细胞器而细胞膜不被破坏的自我调控过程。

背景：肺纤维化的早期诊断是及时开展抗纤维化药物治疗的基础，因此，探索并发现能够有效应用于肺纤维化早期诊断的理想生物标志物对疾病治疗至关重要。
目的：通过生物信息学和机器学习技术对肺纤维化过程中涉及的与自噬相关关键基因进行深入分析，探究与自噬相关的肺纤维化核心基因是否可以作为评估肺纤维化进展中可靠的生物标志物。
方法：基于GEO数据库(是由美国国家生物技术信息中心开发和维护的一个公共数据库，用于存储和共享生物信息学数据)下载肺纤维化GSE24206和GSE110147两个数据集，利用R软件中的“limma”包将两组基因表达矩阵归一化处理。从GeneCards数据库(由美国国家生物技术信息中心创建，该知识库自动整合了约200个Web来源的以基因为中心的数据，包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传、临床和功能信息)提取自噬相关基因集；对肺纤维化数据集进行差异基因分析，将差异基因与自噬基因集交叉对比提取共同基因，识别肺纤维化过程中可能发挥作用的自噬基因。交集基因通过GO、KEGG进行功能富集和细胞免疫浸润分析。通过蛋白质-蛋白质相互作用和机器学习筛选与自噬相关的肺纤维化核心基因，并对核心基因进行集富集分析。将筛选出的核心基因构建诊断模型，用校准曲线来评估线形图模型的预测能力，采用外部数据集GSE21369进行受试者工作特征曲线分析，验证与自噬相关的肺纤维化基因的表达特征，通过Coremine数据库预测与基因IL6、COL1A2相关的中药。培养人胚肺成纤维细胞，通过转化生长因子β1处理造模，利用qRT-PCR技术验证IL6、COL1A2在模型细胞中的相对表达。
结果与结论：①获得肺纤维化差异基因51个、与自噬基因交集基因25个，GO分析显示25个交集基因与细胞外基质组织、胶原代谢过程、胶原原纤维组织、生长因子结合等过程有关，KEGG分析显示25个交集基因主要与磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路、细胞外基质-受体相互作用等信号通路有关；②免疫浸润分析发现，肺纤维化组活化记忆性CD4+ T细胞、M0巨噬细胞、静息树突状细胞表达显著升高(P < 0.05)，呈强相关性；③共筛选出2个参与肺纤维化进展的自噬特征基因：COL1A2、IL6，列线图模型显示两核心基因预测肺纤维化的发病较为准确，受试者工作特征曲线分析显示2个特征基因均具有诊断意义；COL1A2、IL6与细胞周期通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、Janus激酶-信号转导与转录激活子信号通路以及细胞因子与细胞因子受体相互作用相关；预测到与COL1A2、IL6相关的中药共20味，功效以清热解毒、活血行气为主；细胞实验验证了COL1A2、IL6在肺纤维化中高表达。结果表明：COL1A2、IL6可能是肺纤维化潜在的诊断生物标志物，但是它们与肺纤维化相关的特异性尚需进一步研究。

https://orcid.org/0000-0002-3036-1240(巩月红)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肺纤维化, 自噬；机器学习, 生物信息学, 免疫浸润, 最小绝对收缩与选择算子, 基因富集分析, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Early diagnosis of pulmonary fibrosis is the foundation for timely antifibrotic drug therapy. Therefore, exploring and discovering ideal biomarkers that can be effectively used for the early diagnosis of pulmonary fibrosis is crucial for the treatment of the disease.
OBJECTIVE: To conduct an in-depth analysis of key autophagy-related genes involved in the process of pulmonary fibrosis by means of bioinformatics and machine learning techniques, in order to investigate whether autophagy-related core genes of pulmonary fibrosis can be used as reliable biomarkers in the assessment of the progression of pulmonary fibrosis.
METHODS: Two datasets of pulmonary fibrosis, GSE24206 and GSE110147, were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database (a public database developed and maintained by the U.S. National Center for Biotechnology Information to store and share bioinformatics data), and the gene expression matrices of these two datasets were normalized by using the “limma” package in R software. The autophagy-related genes were extracted from GeneCards database (a database created by the U.S. National Center for Biotechnology Information, which automatically integrates gene-centric data from about 200 Web sources, including genomic, transcriptomic, proteomic, genetic, clinical, and functional information). Differential gene analysis was performed on the pulmonary fibrosis dataset, and the common genes were extracted by cross-comparing the differential genes with the autophagy genes, so as to identify autophagy genes that may play a role in the process of pulmonary fibrosis. The intersecting genes were analyzed for functional enrichment and cellular immune infiltration by gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Core genes of pulmonary fibrosis associated with autophagy were screened by protein-protein interactions and machine learning, and core genes were subjected to the enrichment analysis. Diagnostic models were constructed from the identified core genes. Calibration curves were used to assess the predictive ability of the line graph model. An external dataset, GSE21369, was used to perform a receiver operating characteristic curve analysis to validate the expression profiles of pulmonary fibrosis genes associated with autophagy, as well as to predict Chinese herbs associated with the genes IL6 and COL1A2 via the Coremine database. Finally, human embryonic lung fibroblasts were cultured and modelled by transforming growth factor-β1 treatment, and the relative expression of genes in the model cells was verified using qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 51 pulmonary fibrosis differential genes and 25 genes intersecting with autophagy genes were obtained. Gene ontology analysis showed that the 25 intersecting genes were related to extracellular matrix tissue, collagen metabolism, collagen pro-fibroblasts, and growth factor binding, etc. The results of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis indicated that they were mainly related to the Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway and the signaling pathway of the extracellular matrix-receptor interactions. (2) Immunoinfiltration analysis revealed that the expression of activated memory CD4+ T cells, M0 macrophages, and resting dendritic cells was significantly elevated in the pulmonary fibrosis group (P < 0.05), showing a strong correlation. (3) Two autophagy signature genes involved in the progression of pulmonary fibrosis were identified: COL1A2 and IL6. The column-line diagram model showed that the two core genes predicted the onset of pulmonary fibrosis more accurately, and the receiver operating characteristic curve analysis showed that the two characteristic genes had diagnostic significance. COL1A2 and IL6 were related to the cell-cycle pathway, mitogen-activated protein kinase signaling pathway, Janus kinase-signal transduction and activator of transcription signaling pathway and cytokine-cytokine receptor interactions. A total of 20 Chinese herbs were predicted to be related to COL1A2 and IL6 genes, and their efficacies were mainly to clear away heat and detoxify toxins and to invigorate blood and move qi. COL1A2 and IL6 were verified to be highly expressed in pulmonary fibrosis. To conclude, COL1A2 and IL6 may be potential diagnostic biomarkers for pulmonary fibrosis, but its specificity to pulmonary fibrosis needs to be further investigated.

Key words: pulmonary fibrosis, autophagy, machine learning, bioinformatics, immune infiltration, minimum absolute contraction and the selection operator, gene enrichment analysis, engineered tissue construction

中图分类号:

巩月红, 王梦君, 任航, 郑辉, 孙佳佳, 刘军鹏, 张飞, 杨建华, 胡君萍. 机器学习联合生物信息学筛选与自噬相关的肺纤维化关键基因及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7679-7689.

Gong Yuehong, Wang Mengjun, Ren Hang, Zheng Hui, Sun Jiajia, Liu Junpeng, Zhang Fei, Yang Jianhua, Hu Junping. Machine learning combined with bioinformatics screening of key genes for pulmonary fibrosis associated with cellular autophagy and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(35): 7679-7689.

图/表（结果） 11

2.1 肺纤维化自噬相关基因将肺纤维化数据集GSE24206和GSE110147进行合并，通过R软件“limma”包中的“normalize Between Arrays”函数，对两组基因表达矩阵进行常规的背景校正和分位数归一化处理，去除批次效应，见图1。
2.2 肺纤维化差异基因筛选综合分析合并后的肺纤维化数据集后，依据筛选标准(adj.P.val < 0.05且 |logFC|> 2)鉴定出了51个差异表达基因，其中有32个上调基因，这些可能反映了肺纤维化病理过程中的适应性或激活状态；19个下调基因，这些基因可能在疾病状态下的功能受到了抑制，见图2。
2.3 肺纤维化自噬相关基因进一步将筛选出的51个肺纤维化差异基因与GeneCards数据库中收录的9 861个已知自噬相关基因进行了交叉比对，旨在识别出既在肺纤维化中表现出显著差异，又与自噬过程紧密相关的基因。经过比对，筛选出25个交集基因，其中上调基因15个、下调基因10个，这些基因被确认为与自噬相关的肺纤维化基因，结果如图3所示。
2.4 特征基因的功能富集分析对25个与自噬相关的肺纤维化差异基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示，在生物过程方面，主要存在于细胞外基质组织、细胞外结构组织、外部包封结构组织、胶原代谢过程、胶原原纤维组织、细胞-底物黏附；分子功能方面，主要在血小板衍生生长因子结合、细胞外基质结构成分赋予拉伸强度、细胞外基质结构成分、生长因子结合、蛋白酶结合、SMAD结合中发挥作用；细胞组分方面，主要存在于纤维状胶原三聚体、带状胶原原纤维、内质网腔、胶原三聚体复合物、胶原三聚体、含胶原的细胞外基质(图4A-C)。KEGG富集分析结果显示，肺纤维化自噬差异基因主要在AGE-RAGE(高糖基化终末产物-糖基化终末产物受体)信号通路、PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B)信号通路、松弛素信号通路、细胞外基质-受体相互作用、蛋白质消化与吸收等信号通路中(图4D，E)。
2.5 免疫浸润分析结果采用CIBERSORT算法对合并数据集的对照组和肺纤维化组进行免疫浸润分析，探究两组之间不同免疫细胞浸润水平的差异。结果显示，正常组中CD8+ T细胞、调节性T细胞、静息NK细胞、M1巨噬细胞表达高于肺纤维化组(P < 0.05)，
肺纤维化组活化记忆性CD4+ T细胞、M0巨噬细胞、静息树突状细胞表达高于正常组(P < 0.05)(图5A，B)。除IL6之外，其余24个与自噬相关的肺纤维化差异基因与CD8+ T均呈现强相关性，同时除IL6、RTKN2、CP之外，其他基因与静息NK细胞也呈现强相关性；此外，STX11、 ATP5MC1、RRAS、POSTN、COX5B、DSC3、SPP1、AGER、TMEM100、LUC7L3、CFH、CEBPD这基因与M1巨噬细胞呈现出强相关性(图5C)。
2.6 蛋白质与蛋白质相互作用网络将与自噬相关的肺纤维化的25个基

因导入STRING数据库，利用STRING数据库构建了蛋白质相互关系的蛋白质与蛋白质相互作用网络进一步识别25个基因中的核心基因，设定了合适的参数以剔除孤立节点，确保了网络的连通性。使用Cytoscape软件对网络进行了可视化处理，清晰地展示了25个节点和55条边构成的复杂网络结构(图6)。为了深入探究网络中的关键节点，进行了拓扑学分析，运用“Degree”“MCC”“EPC”和“MNC”这4种算法来评估节点的重要性。综合比较4种算法的排名结果，筛选出了节点重要性排名前5位的基因并取其交集，最终得到了3个高连接度的基因：COL1A1、COL1A2和IL6(图7)。
2.7 机器算法的选择绘制LASSO和SVM算法的受试者工作特征曲线(图8A，B)，通过对比2种算法的曲线下面积值以确定算法的准确性，最终采用LASSO和SVM两种算法用于后续分析。结果显示，LASSO算法共确定了6个候选基因，包括分别是COL3A1、COL1A2、CEBPD、EPHA3、PLA2G1B、IL6(图8C，D)；SVM算法确认获得23个候选基因，包括 COL1A2、COL3A1、DSC3、ATP5MC1、CEBPD、AGER、CFHRTKN2、PLA2G1B、COX5B、PROM1、EIF1AY、RRAS、COL1A1、EPHA3、IL6、ARMC3、CP、POSTN、MMP1、TMEM100、STX11、LUC7L3(图8E，F)。将上述2种算法所得到的候选基因取交集，同时再和蛋白质与蛋白质相互作用网络中的高连接度基因取交集，共得到2个与自噬相关的肺纤维化基因(IL6和COL1A2)，这2个基因被认为是参与肺纤维化进展中与自噬相关的关键基因(图8G)。
2.8 诊断基因模型的构建与验证为了明确2个差异基因是否具有预测诊断肺纤维化的意义，基于“rms”包构建肺纤维化的诊断列线图(图9A)，使用校准曲线评估该模型的预测能力，校准曲线显示真实患病风险与预测患病风险之间的差异非常小，说明列线图模型预测肺纤维化的发病较为准确(图9B)。采用外部数据集GSE21369数据集对IL6和COL1A2进行受试者工作特征分析，结果显示，在GSE21369数据集中IL6和COL1A2与空白组相比表达显著升高，2个基因中IL6和COL1A2基因的曲线下面积AUC值分别为0.790，0.855(图9C)，均大于0.75，说明IL6和COL1A2这2个基因效果较为可靠，表明IL6和COL1A2可作为肺纤维化进展的自噬潜在诊断生物标志物。
2.9 GSEA富集分析为了深入理解差异基因在不同表达水平下对各类信号通路的调控影响，研究进行了GSEA富集分析，结果显示，当COL1A2处于高表达状态时，细胞周期通路和剪接体通路呈现明显的上调趋势，而MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路则显著下调；另一方面，IL6在高表达组中则表现出对MAPK信号通路、JAK-STAT(酪氨酸激酶-信号转导及转录激活因子)信号通路以及细胞因子与细胞因子受体相互作用的显

著上调作用，同时伴随着细胞周期通路和非同源末端连接通路的明显下调(图10)。
2.10 药物预测分析结果研究预测获得可调控IL6、COL1A2基因的中药共计20味，其功效以清热解毒、活血行气为主，性味中甘味中药数量最多，苦味、平味次之，数量接近；归经情况以肝、脾经为主，见表2，图11。
2.11 体外细胞实验验证关键基因表达结果为了验证数据集的可靠性，采用 qRT-PCR来验证细胞样本中上述2个基因的表达水平，结果显示实验组中白细胞介素6、Ⅰ型胶原α2链基因mRNA表达均高于正常对照组(P < 0.01)，见图12。

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引言

肺纤维化是一种病因尚不明确、进行性、不可逆的肺部疾病[1-2]，又被称为类肿瘤疾病，主要特征表现为肺部细胞外基质的过度沉积和瘢痕组织的形成，导致患者肺功能下降及生活质量受损[3-4]。全球每10万人中有2-29人患有肺纤维化，患者的5年生存率仅为20%-30%[5-6]。近年来，COVID-19感染席卷全球，随访患者发现肺纤维化是该病后遗症中发生率较高的一种[7]。中国肺纤维化患者数量亦呈明显增多趋势，严重威胁人民生命健康[8-9]。然而，肺纤维化诊断难、预后差，肺移植受限，临床指南推荐的药物治疗长期疗效不明且伴随有显著的不良反应等诸多问题，使得肺纤维化的早期发现及有效治疗成为临床亟待解决的问题[10-12]。最近有研究显示肺纤维化患者生存率提升，这一积极变化可能与生物标志物研究的最新进展密切相关，为肺纤维化的早期诊断、疾病进展监测和抗纤维化药物治疗反应评估提供了新视角和新可能性[13-14]。因此，更准确、灵敏的生物标志物的发现与应用，有望为肺纤维化的诊断、治疗策略开辟新路径。
有研究发现，巨噬细胞自噬在巨噬细胞极化、慢性炎症和器官纤维化中起着重要作用[15-16]。在肺纤维化的发展中自噬也有着关键而复杂的调节作用[17]，自噬功能受损会导致炎症、加速氧化应激反应、促进肺泡细胞凋亡、加快成纤维细胞增殖与转化等，与肺纤维化的发展方向直接相关。文献报道，通过激活自噬过程可以抑制肺上皮细胞的上皮-间质转化，进而改善由博来霉素引起的肺纤维化[18-19]。在肺纤维化患者的肺组织样本中，自噬活性不足已被明确观察到[20]。自噬缺陷被认为可能加速肺成纤维细胞的活化，进而加剧博来霉素诱导的肺纤维化进程[21]，因此，明确自噬如何调节肺纤维化的发病机制将极大地促进肺纤维化诊断与治疗的进展。
随着机器学习对复杂生物信息数据高效处理技术的发展，以简洁、明了的方式对基因序列数据进行科学归类、分析和判定，能够更深入探索新的生物标志物等关键信息，可为揭示疾病的发病机制、实现疾病的早期诊断和有效治疗提供新的线索和视角，对疾病的诊断及治疗过程产生了显著的促进作用[22-23]。因此，此次研究旨在融合机器学习与生物信息学技术，对肺纤维化与自噬相关的关键基因进行精准筛选，并通过细胞实验予以验证，以期从自噬的视角出发深入探究肺纤维化的病理机制，为该疾病的诊断与治疗策略提供新的启示与方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计生物信息学结合机器学习分析与自噬相关的肺纤维化关键基因特征，并进行实验验证。
1.2 时间及地点实验于2024年5-10月在新疆医科大学和新疆医科大学第一附属医院完成。
1.3 资料研究中的数据来源于GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/)、Genecards数据库(https://www.GeneCards.org/)。GEO是由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)开发和维护的一个公共数据库，收集了来自全球各种生物学研究的基因表达和基因组数据，包括DNA序列、RNA序列、蛋白质序列、基因表达谱等，是一个全球最大的生物医学领域的公共数据库平台。Genecards是一个综合性的基因信息数据库，由NCBI创建，该知识库自动整合了约200个Web来源的以基因为中心的数据，包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传、临床和功能信息。
1.4 方法
1.4.1 数据下载从GEO数据库中以“Pulmonary fibrosis”为检索词筛选基因表达数据集，最后纳入2个数据集，GSE24206和GSE110147，GSE24206数据集由GPL570(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)平台生成，来自11例肺纤维化患者的17份样本：6 例患者提供了一对上下叶样本，5例患者提供了单例样本，6份对照标本来自肺移植时健康供体肺的常规肺减容手术；GSE110147数据集由GPL6244(Affymetrix Human Gene1.0 ST Array)平台生成，从22例接受肺移植的肺纤维化患者、10例非特异性间质性肺炎患者和5例混合肺纤维化-非特异性间质性肺炎患者的受者器官中获得新鲜冰冻肺样本，11例正常肺组织从肺癌侧面切除的组织获得。另外，从GeneCards数据库中获取自噬相关基因。
1.4.2 数据处理首先从2个数据文件中提取共同的基因，并将它们整合到一个矩阵中。使用R软件中的“SVA”包对合并后的表达矩阵进行批次效应的去除，再通过“limma”包中的“normalizeBetweenArrays”函数，对两组基因表达矩阵进行常规的背景校正和分位数归一化处理，从而减轻实验间的技术差异。最后，利用“tidyverse”和“ggplot2”包对处理前后的数据进行可视化，绘制箱线图和主成分分析图，以直观展现批次效应校正的效果和数据整体分布。通过R软件“limma”包中的“normalize Between Arrays”函数，对两组基因表达矩阵进行常规的背景校正和分位数归一化处理，输出校正后的基因表达矩阵。最后，利用R软件中的“tidyverse”和“ggplot2”包，将处理前后的数据进行可视化处理，绘制出箱线图和主成分分析图。
1.4.3 筛选差异表达基因使用R软件的“limma”包对提取的肺纤维化基因表达量进行差异分析，筛选标准为：调整后的adj.P.val < 0.05且对数折叠变化(|logFC|)≥2，得到肺纤维化差异基因，利用R软件中的“pheatmap”包和“ggplot2”包将差异分析结果以热图和火山图的形式可视化。通过在线分析网站(https://www.bioinformatics.com.cn/)将肺纤维化差异基因和自噬相关基因取交集，获得肺纤维化自噬相关基因，并将结果可视化。
1.4.4 功能富集分析使用R包“cluster Profiler”和“org.hs.eg.db”对差异表达基因基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes genomes，KEGG)分析，以adj.P.val < 0.05为限制条件，对肺纤维化自噬差异基因进行GO和KEGG富集分析，再利用“ggplot2”包对富集结果可视化，筛选出细胞成分、生物过程、分子功能及富集通路，利用R语言进行可视化分析。
1.4.5 免疫细胞浸润分析利用反卷积算法计算GSE24206和GSE110147数据集中肺纤维化组和对照组的每个样本中22种免疫细胞比例，使用Wilcoxon检验评估每种免疫细胞的丰度差异。通过Pearson相关分析评估与自噬相关的肺纤维化关键基因与免疫浸润细胞的关联。
1.4.6 关键基因蛋白相互作用网络的构建将交集靶点基因上传至STRING数据库(htts:// string-db.org/)，生物物种选项设置为 “Homo sapien”，最小相互作用阈值设定为“Highest conffdence≥0.4”，其他参数设定为默认值，利用CytoHubba插件筛选出核心靶点，并构建蛋白质与蛋白质相互作用网络。再利用Cytoscape软件(v3.7.2)对蛋白质与蛋白质相互作用网络进行拓扑学分析。为了识别网络中具有高连接度基因，应用“CytoHubba”插件，选择“Degree”“MCC”“EPC”和“MNC”4种算法进行筛选，有效识别出蛋白质与蛋白质相互作用网络中可能在肺纤维化自噬过程中发挥着重要作用的高连接度基因。
1.4.7 机器算法筛选候选生物标志物使用R软件的“glmnet”“caret”“mlbench”等对与自噬相关的肺纤维化差异表达基因数据集分别进行最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)算法和支持向量机(support vector machine，SVM)算法，通过对比两种算法在疾病特征基因筛选方面的精确度，以确定最终用于后续分析的机器学习算法，绘制韦恩图，筛选出最终的诊断性基因。
1.4.8 诊断性模型的构建与验证将筛选出的基因构建诊断模型，然后利用校准曲线来评估线形图模型的预测能力。采用外部数据集GSE21369集中对候选生物标志物进行验证，确定生物标志物评估其诊断价值，并使用R语言pROC包绘制受试者工作特征曲线，计算曲线下面积AUC值，一般AUC值越大说明预测较为准确，当AUC值< 0.5则无诊断意义。
1.4.9 GSEA富集分析为深入研究特征基因IL6(白细胞介素6)和COL1A2(Ⅰ型胶原α2链基因)所涉及的生物学途径，从分子特征数据库MSigDB中获取了c2.cp.kegg.symbols基因集合，将该基因集合用作GSEA算法的输入数据，利用“limma”“clusterProfiler”
“enrichplot”以及“org.Hs.eg.db”等R包来执行富集分析。在分析结果中，如果调整后的adj.P.val < 0.05则认为富集结果具有统计学意义。
1.4.10 核心基因药物预测通过Coremine数据库(https://www.coremine.com/medical)预测与基因IL6和COL1A2相关的中药。在预测结果中先去除重复值，再分别选取P值最小的前10个中药进行后续分析。参考《中华本草》和《中国药典》等著作，查询中药的性味、归经以及主要功效。
1.4.11 体外细胞实验将人胚肺成纤维细胞MCR-5(普诺赛)于37 ℃恒温水浴加热，复苏，按1×107 L-1的细胞浓度转培至细胞培养瓶中，待细胞汇合度至80%时进行传代，将2.5 mL细胞悬液接种于6孔板内，细胞浓度为1×109 L-1，分为实验组和正常对照组，实验组加入10 ng/mL 转化生长因子β1[24]，两组置于37 ℃ CO2培养箱内培养。培养24 h后，用PBS清洗细胞2次，采用TRIzol试剂提取总RNA。采用TaKaRa公司的反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，由上海生工生物工程股份有限公司合成引物，引物序列见表1。按照说明书进行qRT-PCR实验，以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt计算目的基因表达的相对变化值。

1.5 主要观察指标肺纤维化数据集差异表达基因数量，差异表达基因与自噬交集基因的GO、KEGG和免疫浸润分析结果，差异基因的蛋白质与蛋白质相互作用、LASSO分析结果，差异基因的GSEA分析结果，外部数据集的受试者工作特征分析结果，差异基因的药物预测以及核心基因在实验组人胚肺成纤维细胞中的相对表达。
1.6 统计学分析采用Origin 2018 统计学软件进行数据处理。生物信息分析采用 R软件、LASSO回归、聚类分析、Spearman相关分析、受试者工作特征曲线分析。使用SPSS 25.0软件进行数据分析，所有实验重复3次，数据以x±s表示，组间差异比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经新疆医科大学第一附属医院生物统计学专家程毅审核。

讨论

尽管现代医学在肺纤维化治疗领域取得了显著进展，治疗手段日益多样化，但高昂的治疗费用及明显的不良反应等问题依然存在，严重制约了肺纤维化患者生存率的提升。临床上对有效治疗肺纤维化的方法日益迫切需求，然而，肺纤维化的精准诊断是及时启动已获批准药物抗纤维化治疗、改善预后的关键，临床中常因肺纤维化的诊断延迟使现有疗法未能充分利用[25]。因此，揭示肺纤维化特征性的生物标志物和治疗靶点是肺纤维化诊断、治疗的关键。
近年来的研究发现，自噬是肌成纤维细胞分化、组织重塑和成纤维的重要调节因子[26]。当自噬发生功能障碍时，肺泡上皮细胞易受到衰老与损伤的侵袭，进而启动上皮-间质转化，驱动成纤维细胞的增殖及分化为肌成纤维细胞，过程中伴随着α-平滑肌肌动蛋白的过度表达及细胞外基质的累积，最终加剧肺纤维化的形成[27-28]。另外，在转化生长因子β1介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的过程中，自噬受到抑制，而自噬的激活则可能阻断这一分化路径，减轻纤维化程度。由此可见，活化的自噬在肺纤维化的发展中具有保护作用[29]，调控自噬通路有望成为肺纤维化诊断与治疗的新策略。因此，此次研究联合多芯片数据集，利用生物信息学分析和机器学习寻找自噬相关的肺纤维化潜在的生物标志物，以期得到可能识别更早期肺纤维化的生物标志物以及与自噬相关的基因靶点，为肺纤维化的诊断及治疗提供新的思路。
此次研究通过GEO数据库中的2个微阵列数据集筛选出51个肺纤维化差异表达基因，从GeneCards数据库获得的9 861个自噬相关基因，与51肺纤维化差异表达基因交叉比对获得25个交集基因。针对25个基因，基于GO、KEGG分析表明核心差异表达基因主要涉及PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B)信号通路、细胞外基质-受体相互作用等信号通路。通过免疫浸润分析正常组和肺纤维化组之间免疫细胞浸润水平的差异，结果发现肺纤维化与CD4+T细胞、M0巨噬细胞、静息树突状细胞表达呈现强相关性；针对25个基因，经过蛋白质与蛋白质相互作用和最小绝对收缩及选择算子筛选出2个参与肺纤维化进展的自噬特征核心基因：COL1A2、IL6。采用外部数据集GSE21369数据集对IL6和COL1A2进行受试者工作特征分析验证，结果表明IL6和COL1A2可作为肺纤维化进展中的潜在诊断生物标志物。TANAKA等[30]研究发现IL6是一种多效性细胞因子，从局部病变处向全身发送炎症信号，驱动炎症级联反应，最终导致病理性纤维化发展。PAN等[31]采用单细胞转录组学技术筛选了肥胖引起的心脏纤维化的关键标志物中发现，Col1a2 可能是肥胖引起的心脏纤维化的重要标志物。
IL6家族细胞因子在炎症、纤维化形成以及维持机体平衡的免疫反应中发挥重要作用。IL6介入了肺纤维化的发病过程，与肺纤维化的发生发展均有密切联系[32]。肺纤维化患者血清中IL6的含量随病程进展呈上升趋势，高水平的IL6是肺纤维化急性加重的早期特征[33]。在肺纤维化患者和动物模型中可见IL6的过表达。中药宣肺败毒汤能有效抑制成纤维细胞胶原沉积，下调包括IL6在内的炎性因子分泌，抑制IL-6/STAT3活化，减轻博来霉素诱导的肺纤维化[34]。多酚类新木脂素通过在体外和体内抑制IL-6/CD44/STAT3信号通路，改善肺纤维化[35]。
COL1A2是Ⅰ型胶原蛋白的前α2链的编码基因，在大部分结缔组织中Ⅰ型胶原蛋白含量较为丰富，在成骨细胞和成纤维细胞中大量存在，与肺纤维化的形成存在密切的相关性[36]。研究发现，尿酸抑制矽肺患者肺泡巨噬细胞COL1A2表达能够减缓外空间胶原蛋白的合成、降低与COL1A2相关的细胞质囊泡的形成，从而降低肺纤维化[37]。研究表明，药物干预后可减少IL6、白细胞介素1β等的释放，抑制α-平滑肌肌动蛋白的表达和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的产生，减轻炎症反应、阻止成纤维细胞活化和胶原沉积，从而降低炎症细胞浸润，改善肺组织损伤和肺纤维化，干预肺纤维化进程[38]。
为了进一步探讨这2个基因在肺纤维化中的意义，又进行了GSEA富集分析，结果显示与细胞周期通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路以及细胞因子与细胞因子受体相互作用相关，并且预测与COL1A2、IL6基因相关的中药共20味，功效以清热解毒、活血行气为主。最后进行了体外细胞实验验证，人胚肺成纤维细胞经转化生长因子β1处理造模后，采用qRT-PCR检测这2个基因的表达，发现这2个基因可能是肺纤维化潜在的诊断生物标志物。通过对2个基因的鉴定，衍生出药物靶点，为未来的研究提供了新的思路，研究结果可能有助于制定肺纤维化的早期诊断策略、预后标志物和治疗靶点。
综上所述，文章通过应用生物信息学分析和机器学习成功识别出2个与自噬相关的肺纤维化特征性差异基因，即IL6和COL1A2，它们可作为诊断肺纤维化的关键标志物。然而，该研究的数据来源为GEO数据库，尽管已整合了该数据库的多个数据集，但所获得的数据量仍然有限，其与肺纤维化相关的特异性尚需进一步研究。因此，未来的研究有必要进一步纳入更多的临床样本，以增强研究结果的普遍适用性和可靠性。同时，开展动物体内实验以验证IL6和COL1A2在肺纤维化中的具体作用及其机制，进一步探究自噬与肺纤维化的特定关联，并深入研究其他自噬相关基因及信号通路，以来全面阐释自噬在肺纤维化中的调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

机器学习联合生物信息学筛选与自噬相关的肺纤维化关键基因及实验验证

Machine learning combined with bioinformatics screening of key genes for pulmonary fibrosis associated with cellular autophagy and experimental validation

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