人工虎骨粉改善脊柱骨关节炎大鼠脊柱小关节的退变及关节软骨免疫微环境

doi:10.12307/2025.778

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5511-5519.doi: 10.12307/2025.778

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

人工虎骨粉改善脊柱骨关节炎大鼠脊柱小关节的退变及关节软骨免疫微环境

李雯1，赵婧宜1，胡雯1，熊彬1，唐超2

1西南医科大学，四川省泸州市 646000；2西南医科大学附属医院骨科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2024-07-22 接受日期:2024-09-21 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-20
通讯作者: 唐超，在读博士，主治医师，西南医科大学附属医院骨科，四川省泸州市 646000
作者简介:李雯，女，2002年生，新疆维吾尔自治区阿克苏市人，汉族，西南医科大学本科在读，主要从事脊柱关节炎的基础和临床研究。

Artificial tiger bone meal improves degeneration of spinal facet joints and immune microenvironment of articular cartilage in rats with spine osteoarthritis

Li Wen1, Zhao Jingyi1, Hu Wen1, Xiong Bin1, Tang Chao2

1Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2024-07-22 Accepted:2024-09-21 Online:2025-09-18 Published:2025-02-20
Contact: Tang Chao, Doctoral candidate, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Li Wen, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨关节炎：是一种以关节软骨损害为主，并累及整个关节组织最常见的关节疾病，最终发生关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害，表现为关节疼痛、僵硬、肥大及活动受限。
人工虎骨粉：是一种天然虎骨的仿生中成药，其有效成分和药理作用与天然虎骨一致，具有抗炎、镇痛、增强机体免疫力、促进骨折愈合等功效，适用于关节炎、风湿、骨质疏松等疾病。

背景：脊柱骨关节炎是以脊柱小关节、关节韧带和肌腱为主要表现的慢性炎症性疾病，是慢性腰痛的主要原因。人工虎骨粉具有抗炎和缓解疼痛的生物作用，因此有望为脊柱骨关节炎治疗提供新的策略。
目的：探讨人工虎骨粉调控白细胞介素23/白细胞介素17(IL-23/IL-17)免疫轴炎症因子表达水平改善大鼠脊柱骨关节炎的分子作用机制。
方法：60只大鼠随机分为空白对照组、模型组及人工虎骨粉低、中、高剂量组，每组12只。除空白对照组外，其余各组通过对大鼠腰椎关节囊关节腔内注射碘乙酸0.1 mL建立骨关节炎模型。造模15 d后人工虎骨粉低、中、高剂量组分别按120，240，480 mg/(kg•d)灌胃给药治疗，空白对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃。给药21 d后，采用Western Blot法测量大鼠脊柱关节软骨中白细胞介素17、白细胞介素23、基质金属蛋白酶3、趋化因子受体6的表达水平；ELISA法检测大鼠血清中相关炎症因子的表达水平；应用苏木精-伊红染色和番红 O-固绿染色法观察大鼠关节损伤退变程度。
结果与结论：①Western Blot检测结果显示，人工虎骨粉高剂量组大鼠的关节软骨中白细胞介素17、白细胞介素23、基质金属蛋白酶3、趋化因子受体6的表达水平较模型组显著降低(P < 0.05)；②ELISA检测结果显示，与模型组相比，人工虎骨粉中、高剂量组大鼠的血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3水平下调效果显著(P < 0.05)； ③苏木精-伊红染色和番红 O-固绿染色显示，人工虎骨粉各剂量组大鼠滑膜炎症细胞浸润及增生情况较模型组明显改善，其中人工虎骨粉中、高剂量组病理炎症国际骨关节炎研究学会评分及Mankin’s 评分显著降低(P < 0.05)；④提示人工虎骨粉可明显改善碘乙酸化学刺激引起的大鼠脊柱小关节的炎症及退变，其中高剂量组效果更显著，其机制可能是通过抑制IL-23/IL-17免疫轴相关炎症因子的表达，改善关节软骨免疫微环境。

https://orcid.org/0009-0006-4072-323X(李雯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊柱骨关节炎, 人工虎骨粉, IL-23/IL-17免疫轴, 炎症, 大鼠, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Spine osteoarthritis is a chronic inflammatory disease of the spine, articular ligaments, and tendons, and is the main cause of chronic low back pain. Artificial tiger bone powder has anti-inflammatory and pain-relieving biological effects, so it is expected to provide a new strategy for targeted therapy of spinal osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of artificial tiger bone meal in regulating the expression level of interleukin-23/interleukin-17 immune axis in improving spine osteoarthritis in rats.
METHODS: Sixty SD rats were randomly divided into blank control group, model group, artificial tiger bone meal low-, medium- and high-dose groups, with 12 rats in each group. Except for the blank control group, osteoarthritis models were established in the other groups by injecting 0.1 mL of iodoacetic acid into the joint cavity of the lumbar vertebral joint capsule of the rats. 15 days after modeling, the artificial tiger bone meal low, medium and high dose groups were treated by intragastric administration of 120, 240 and 480 mg/kg per day respectively. The blank control group and model group were given the same volume of normal saline by gavage. After 21 days of treatment, the expression levels of interleukin-17, interleukin-23, matrix metalloproteinase-3, and chemokine receptor-6 in rat spinal articular cartilage were measured by western blot assay. The expression levels of related inflammatory factors in rat serum were detected by ELISA. The degree of joint injury and degeneration in rats was observed by hematoxylin-eosin staining and safranin O-fast green staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of western blot assay showed that the expression levels of interleukin 17, interleukin 23, matrix metalloproteinase 3, and chemokine receptor 6 in the articular cartilage of rats in the artificial tiger bone meal high-dose group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). (2) ELISA results showed that compared with the model group, the artificial tiger bone meal medium- and high-dose groups had a significant down-regulating effect on the levels of serum interleukin 17, tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and matrix metalloproteinase 3 (P < 0.05). (3) Hematoxylin-eosin staining and saffron O-solid green staining showed that the infiltration and proliferation of synovial inflammatory cells in each treatment group of artificial tiger bone meal were significantly improved compared with the model group, and the pathological inflammation Osteoarthritis Research Society International score and Mankin’s score in the medium- and high-dose groups of artificial tiger bone meal were significantly reduced (P < 0.05). (4) It is suggested that artificial tiger bone meal could significantly improve the inflammation and degeneration of spinal facet joints caused by iodoacetic acid chemical stimulation. Among them, the effect of the high-dose group was more significant. The mechanism may be to inhibit the expression of interleukin-23/interleukin-17 immune axis-related inflammatory factors and improve the immune microenvironment of articular cartilage.

Key words: spine osteoarthritis, artificial tiger bone meal, interleukin-23/interleukin-17 immune axis, inflammation, rat, engineered tissue construction

中图分类号:

李雯, 赵婧宜, 胡雯, 熊彬, 唐超. 人工虎骨粉改善脊柱骨关节炎大鼠脊柱小关节的退变及关节软骨免疫微环境[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5511-5519.

Li Wen, Zhao Jingyi, Hu Wen, Xiong Bin, Tang Chao. Artificial tiger bone meal improves degeneration of spinal facet joints and immune microenvironment of articular cartilage in rats with spine osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5511-5519.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析共纳入60只大鼠，48只大鼠经脊柱骨关节炎造模后均存活，其中43只大鼠攀爬跳跃活动减退，造模15 d后通过小动物高分辨率CT下可见骨关节炎改变，造模成功率为90%，5只大鼠未见明确脊柱骨关节炎表现(模型组2只、低剂量组1只、中剂量组1只、高剂量组1只)。空白对照组12只完全存活。
2.2 人工虎骨粉对大鼠脊柱关节软骨中炎症因子表达水平的影响与空白对照组相比，模型组大鼠软骨组织IL-17、IL-23、MMP-3、CCR-6水平显著升高(P < 0.05)，人工虎骨粉低剂量组大鼠软骨组织IL-23和MMP-3水平显著升高(P < 0.05)，中剂量组大鼠软骨组织MMP-3水平显著升高(P < 0.05)，高剂量组大鼠与空白对照组无统计学差异(P > 0.05)；与模型组相比，人工虎骨粉低剂量组大鼠软骨组织CCR-6水平显著降低(P < 0.05)，中、高剂量组大鼠软骨组织IL-17、IL-23、CCR-6显著降低(P < 0.05)，高剂量组MMP-3显著降低(P < 0.05)；与人工虎骨粉低剂量组相比，高剂量组大鼠软骨组织IL-23、MMP-3水平显著降低(P < 0.05)，中剂量组IL-17、IL-23、MMP-3、CCR-6无明显统计学差异(P > 0.05)，高剂量组IL-17、CCR-6无统计学差异(P > 0.05)；与人工虎骨粉中剂量组相比，高剂量组IL-17、IL-23、MMP-3、CCR-6无统计学差异(P > 0.05)，见图3，4。
2.3 人工虎骨粉对骨关节炎大鼠血清细胞因子的影响如图5所示，与空白对照组比较，模型组和人工虎骨粉不同剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17水平均显著升高(P < 0.05)。与模型组比较，人工虎骨粉低剂量组血清TNF-α、IL-1β水平显著下调(P < 0.05)，人工虎骨粉中、高剂量组血清TNF-α、IL-1β和IL-17水平显著下调(P < 0.05)，而人工虎骨粉低剂量组血清IL-17相较模型组无统计学差异(P > 0.05)。与人工虎骨粉低剂量组比较，中、高剂量组血清TNF-α、IL-1β和IL-17水平显著下调(P < 0.05)。与人工虎骨粉中剂量组比较，高剂量组TNF-α、IL-1β水平显著下调(P < 0.05)，而高剂量组血清IL-17相较中剂量组无统计学差异(P > 0.05)。
2.4 人工虎骨粉对骨关节炎大鼠血清MMP-3的影响如图6所示，MMP-3在各造模组大鼠中高表达，与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，人工虎骨粉中、高剂量组血清MMP-3水平显著下调(P < 0.05)，而低剂量组效果有限，相较模型组未见统计学差异(P > 0.05)。与低剂量组比较，人工虎骨粉中、高剂量组血清MMP-3水平显著下调(P < 0.05)。与中剂量组比较，高剂量组血清MMP-3水平显著下调(P < 0.05)。
2.5 人工虎骨粉对大鼠脊柱关节病理变化的影响
2.5.1 大鼠脊柱关节苏木精-伊红染色所有最终进入研究的大鼠采用0.3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后脱臼处死后，取出各组大鼠腰椎及小关节组织，观察腰椎关节突的关节面退变情况，见图7。组织切片行苏木精-伊红染色，光镜下观察滑膜增生和炎症细胞浸润情况、骨和软骨破坏情况等病理学变化。如图8所示，在空白对照组中，大鼠关节腔面光滑，软骨表面平滑光整，结构清晰可见，滑膜组织形态正常，滑膜组织细胞排列较整齐，滑膜中没有观察到炎症细胞的浸润；而模型组关节结构和形态严重受损，关节表面凹凸不平，软骨细胞排列混乱，存在明显的软骨和骨破坏，滑膜中有大量炎症细胞聚集和浸润，上皮表面粗糙；人工虎骨粉低剂量组中，滑膜中炎症细胞的浸润及滑膜增生情况较模型组有所改善，但仍存在较为明显的软骨破坏现象；人工虎骨粉中、高剂量组较模型组关节炎症状改善显著，关节结构和形态较模型组正常，滑膜中存较少炎症细胞浸润，滑膜增生轻微，无明显的软骨损伤现象。
大鼠脊柱关节组织病理炎症国际骨关节炎研究学会评分显示：与模型组相比，人工虎骨粉各剂量组的病理炎症评分均有下降，人工虎骨粉各剂量组对大鼠脊柱关节炎症具有显著的改善作用，相较模型组差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5.2 大鼠脊柱关节番红O-固绿染色对各组大鼠脊柱关节组织切片行番红O-固绿染色，光镜下观察大鼠脊柱关节软骨损伤情况和软骨下骨形态，红染部分为软骨基质，蓝绿色为骨组织。如图9所示，在空白对照组中大鼠脊柱关节软骨结构正常，表面光整，软骨细胞排列整齐，

数目及形态均正常，软骨基质被番红染液深染，潮线清晰；而模型组中软骨结构破坏严重，软骨层明显变薄，细胞数目减少，部分软骨重度失染甚至不着色，潮线被破坏，Mankin’s 评分显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，人工虎骨粉低剂量组对于软骨损伤的改善效果不明显，软骨表

面不规整，软骨层较薄，局部软骨中度失染，潮线不清晰；而人工虎骨粉中、高剂量组软骨损伤情况明显减轻，软骨结构基本正常，软骨细胞局部无异常增多或减少，基质染色轻微减少，潮线完整，相较模型组Mankin’s评分显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

脊柱关节炎是以脊柱、关节韧带和肌腱为主要表现的慢性炎症性疾病，可累及关节软骨、软骨下骨、关节囊、滑膜和周围软组织[1-2]，是一种致残性疾病，严重影响患者的生活和躯体功能[3]。随着炎症损伤进展和组织修复过程，受累及的关节逐渐出现间隙变窄变形、增生形成，是慢性腰痛的主要原因[4]。据统计 2020年，全球腰痛的流行病例估计为6.19亿，在大多数国家，腰痛是导致残疾的主要原因[5]，同时也给患者及其家庭、社会的经济、心理造成损失或伤害[6]。
骨关节炎的发病涉及多种因素，包括遗传、年龄、性别、肥胖、体力活动等[7]。骨关节炎进展过程中最重要的机制之一是细胞因子平衡紊乱，其中炎症递质白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达是激活其他细胞因子并促进关节退变进展的信号通路激活剂[8]。根据既往研究表明，IL-23/IL-17免疫轴在炎症发生的过程中起到重要作用。IL-23是一种由p19和p40亚基组成的异二聚体细胞因子，主要由活化的抗原呈递细胞产生[9]，通过增加辅助性T细胞17的分化和扩增，进而促进IL-17的产生[10]。IL-17主要由辅助性T细胞17产生，可表达趋化因子受体6(chemokinereceptor 6，CCR-6)，即CCR(C-C基序)配体20(CCL20)的受体[11]，通过诱导促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的产生导致骨关节炎的慢性炎症和组织损伤[12]。随着炎症递质和基质金属蛋白酶生成的增加，关节软骨免疫微环境调控失衡，加重关节软骨的破坏以及关节软骨和软骨下骨的退行性改变。因此，IL-23/IL-17免疫轴是骨关节炎发病机制中的关键因素。
骨关节炎的治疗包括药物治疗和非药物治疗[13]，其中药物治疗包括非类固醇抗炎药、糖皮质激素和其他营养补充剂等[14-15]，非药物治疗包括手术治疗、物理疗法、康复锻炼等[16-17]。目前，一些针对骨关节炎发病过程中起关键作用的炎性细胞因子和细胞内通路的靶向治疗药物和中药治疗已经越来越受到研究者的关注[18]，其中，人工虎骨粉是常用的中药制剂之一。由于虎骨来源稀少，且捕杀野生动物违法，现多使用人工合成的虎骨粉，成分与天然虎骨基本相同[19]。人工虎骨粉可以缓解老年原发性骨质疏松症患者的关节疼痛及活动受限[20]，据过往研究显示，人工虎骨粉可以改善氧化应激损伤和炎症因子的释放，但其在治疗骨关节炎疾病中，是否通过基于IL-23/IL-17免疫轴调控关节软骨免疫微环境的炎症因子表达水平仍不清楚[21]。因而，此次研究的目的是探究人工虎骨粉对脊柱骨关节炎中IL-23/IL-17免疫轴表达的影响，通过观察人工虎骨粉对碘乙酸诱导大鼠脊柱骨关节炎的抗炎作用，从关节组织炎症及退变病理学变化来评估人工虎骨粉改善骨关节炎的效果；另外测量相关炎症因子的表达水平，评估关节免疫微环境改变，阐明其潜在作用机制，期待能为靶向治疗骨关节炎提供新的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计，多组比较动物实验，组间比较采用单因素方差分析，事后两两组之间比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年2月在西南医科大学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取SPF级SD雄性大鼠60只，6-8周龄，体质量180-200 g，购于西南医科大学实验动物中心，生产许可编号：SCXK(川)2023-0017。于维持屏障环境的动物中心饲养房中喂养，饲养房内温度维持在22-25 ℃，湿度维持在55%-65%，照明维持明暗各12 h 交替。依次标记1-60编号，通过计算机随机筛选编号平均分为5组，每组12只。
实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20210906-2。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要药品、试剂及仪器人工虎骨粉(金天格胶囊，处方组成为马鹿骨、梅花鹿骨、猪骨、羊骨，主要有效成分：总氨基酸≥18%、钙≥18%、磷≥8%，国药准字Z20030079)购自金花企业西安金花制药厂；碘乙酸(货号：M22748-25G)购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；戊巴比妥钠( 批准文号：国药准字H31021724，批号：20150506) 购自上海上药新亚药业有限公司；IL-1β(货号：RA20020)、IL-17(货号：RA20117)、TNF-α(货号：RA20035)、MMP-3(货号：RA20503)ELISA 试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；乙二胺四乙酸脱钙液(货号：G1105-500ML)、骨组织番红固绿染液(货号：GP051)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；蛋白3 Alpha抗体(货号：AB-9829)购自艾博抗(上海)贸易有限公司，IL-17一抗(货号：DF6127)，IL-23抗体(货号：DF-13760)购自Affbiotech公司；GAPDH鼠单抗(Proteintech)；CCR-6多克隆抗体(货号：YT5714)购自Immunoway公司。
1.4 方法
1.4.1 大鼠碘乙酸致关节炎模型建立
(1)造模剂准备：称取2 g碘乙酸溶于50 mL生理盐水中(质量浓度为40 mg/mL)[22]。
(2)碘乙酸关节内注射建模：60只大鼠采用随机数字表法抽选其中12只作为空白对照组，其余48只建立脊柱小关节骨关节炎模型。使用碘乙酸一次注射0.1 mL到大鼠左侧各腰椎关节突关节囊内，为提高造模阳性率，拟采取对大鼠L1-L5左侧逐一注射碘乙酸，右侧各腰椎关节突关节囊不进行操作，作为自我对照。空白对照组在相同侧及节段注射等量生理盐水到腰椎关节突关节囊内。
(3)造模评价：造模结束后，每日对大鼠活动状态进行密切观察，每日驱赶大鼠活动30 min，使其在化学刺激的作用下产生炎症反应及过度活动致关节退变。饲养15 d后观察造模大鼠有一定程度活动受限，并通过小动物高分辨率CT扫描证实大鼠腰椎造模关节呈现关节炎影像表现，即可认定为造模成功，见图1。
1.4.2 分组与给药
(1)分组：完全随机设计，将60只大鼠依次标记1-60编号，通过计算机随机筛选编号平均分为5组；空白对照组12只未进行碘乙酸造模处理，模型组、人工虎骨粉低、中、高剂量组均进行碘乙酸脊柱骨关节炎造模，每组12只。

(2)给药方案：造模后15 d通过大鼠活动度及小动物高分辨率CT明确模型成功后，开始连续给药21 d。根据药物说明书，人工虎骨粉成人临床剂量为1.2 g/次，按照大鼠等效剂量[g/kg]=[人类剂量/体质量(60 kg)]×12换算得出为240 mg/kg[23]，将其定为中剂量组，按照1∶2∶4比例，人工虎骨粉低、中、高剂量组给药剂量分别为120，240，480 mg/(kg•d)，1次/d。
(3)药物处理及给药途径：依据测得大鼠的体质量称取药品，将人工虎骨粉药物溶解、稀释或浓缩定容至30 mL，连续21 d，通过灌胃方式定量、足量喂养大鼠。空白对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水，见图2。
1.4.3 标本采集连续给药21 d后，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(40-50 mg/kg)麻醉后颈椎脱臼处死大鼠。在麻醉前采用尾静脉取血法收集大鼠血液，制备新鲜血清，保存于-80 ℃，后续用于ELISA检测。取各组大鼠L1-L5脊柱关节突关节，除去皮毛和肌肉，用PBS冲洗2遍后，于40 g/L多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h。将固定后组织浸没于10%乙二胺四乙酸中脱钙处理 3 周后，进行石蜡包埋，用切片机制成 3-5 μm厚的矢状面切片。将切片置于60 ℃烤箱中过夜后备用，后续行苏木精-伊红、番红O-固绿和免疫组化染色。
1.4.4 Western Blot法检测大鼠脊柱关节软骨IL-17、IL-23、MMP-3、CCR-6表达水平
(1)电泳：提前10 min取出蛋白与Marker在室温下解冻，使用振荡器混匀后低速离心机处理数秒。将电泳凝胶卡入电泳槽内，倒入新鲜电泳液，取出梳子，补充电泳液完全没过凝胶。样品前后2个泳道留空，使用10 μL的移液枪向泳道内依次加入待测蛋白，记录好加样顺序。向样品前后2个泳道加入Marker进口3 μL，国产5 μL。盖好电泳盒盖子，插上电源，注意电极。至前端蛋白标记至电泳槽下横梁高度结束。
(2)转膜：转膜前准备，将转膜滤纸防止托盘内，用转膜液提前浸润2 min，聚偏氟乙烯(PVDF)做好标记后放入甲醇中激活1 min。根据Marker的指示与目标蛋白的分子质量大小，水平切胶，放在转膜滤纸上，避免气泡混入。在凝胶条带上贴上PVDF膜，使其覆盖整个Marker范围。三明治夹心顺序，滤纸夹子-转膜滤纸-凝胶-PVDF膜-转膜滤纸-滤纸夹子。黑面对凝胶膜，白面对PVDF膜(恒流300 mA，时间1 h，转膜盒需要水浴防止过热)。
(3)封闭：转膜后取出PVDF膜，放入快速封闭液封闭30 min。封闭完成后，使用Tris盐缓冲液(TBST)冲洗。
(4)孵育：对应一抗(MMP-3抗体稀释比例1∶500、IL-17抗体稀释比例1∶200、IL-23抗体稀释比例1∶500、CCR-6稀释比例1∶500、内参GAPDH鼠单抗稀释比例1∶10 000)冷藏孵育过夜> 8 h；回收一抗，使用TBST在摇床上清洗10 min×3次。对应二抗(山羊抗兔 IgG 抗体，稀释比例 1 ∶ 4 000；山羊抗鼠 IgG 抗体，稀释比例 1 ∶ 4 000)常温孵育> 2 h；回收二抗，使用TBST在摇床上清洗10 min×3次。曝光液现用现配，1∶1配置，注意避光使用，使用化学成像系统曝光。
(5)抗体剥脱：完成第一次化学发光检测后，TBST漂洗5 min；倒掉TBST，加入适量抗体洗脱液，确保NC或PVDF膜被完全覆盖，室温摇床孵育10 min；回收抗体洗脱液，加入TBST漂洗3次，每次5 min；根据实验目的进行封闭和抗体孵育等后续工作。从抗体封闭开始继续操作到曝光第2条蛋白。
1.4.5 大鼠脊柱关节病理学苏木精-伊红染色
(1)切片脱蜡至水：放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各8 min分别脱蜡，然后使用无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、体积分数85%、75%乙醇各5 min梯度至水，自来水冲洗2 min。
(2)苏木精染色：将切片置于苏木精染液中染色5 min，盐酸水溶液分化2 s之后氨水水溶液返蓝15-30 s，自来水冲洗。
(3)伊红染色：将切片置于体积分数95%乙醇中脱水，而后放入伊红染液中染色5-8 s。
(4)脱水封固：将切片按次序置入无水乙醇Ⅰ30 s，无水乙醇Ⅱ 2.5 min，无水乙醇Ⅲ 2.5 min脱水，而后以二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2.5 min透光，采用中性树胶固定密封切片。
(5)用光学显微镜观察大鼠腰椎切片苏木精-伊红染色情况，观察内容包括炎性细胞浸润情况、骨和软骨破坏等病理学变化等，取适当的视野采集图像进行后续分析，由2名研究者以双盲方法进行病理评分，通过苏木精-伊红染色评估国际骨关节炎研究学会评分，评分范围为0-6，其中0=表面完整，软骨形态完整，1=表面完好无损，2=表面不连续性，3=垂直裂缝(裂缝)，4=糜烂，5=剥蚀，6=变形[24]。
1.4.6 大鼠脊柱关节病理学番红O-固绿染色
(1)切片脱蜡置水：放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min分别脱蜡，然后使用无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各10 min、体积分数95%，90%，80%，70%乙醇各5 min梯度脱水，而后自来水冲洗2 min。
(2)固绿染色：将切片置入骨组织固绿染液中，充分染色1-5 min，用流动自来水冲洗多余染液直至软骨呈现无色，后用体积分数1%盐酸行10-15 s快速处理，自来水稍冲洗。
(3)番红染色：将切片置入番红染液中，充分染色5-10 s，之后用四缸无水乙醇进行快速脱水，每次时长3-5 s，4次脱水后置于显微镜下观察，以软骨染为红色，而背景呈现无色为宜。
(4)封固：将切片经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min透光后，采用中性树胶封固。
(5)用光学显微镜观察各组大鼠踝关节切片番红O-固绿染色情况，软骨和骨破坏等病理学变化，取适当的视野采集图像，由2名研究者独立以双盲原则按照 Mankin’s 评分标准从以下4个方面进行评分：Ⅰ 软骨结构(0-6分)，Ⅱ 软骨细胞外观(0-3分)，Ⅲ 软骨基质染色(0-4分)，Ⅳ 潮线完整性(0-1分)，4项总和评分最高为14分，分数越高则软骨退变程度越严重[25]。
1.4.7 ELISA 法检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17、MMP-3的表达水平
(1)试剂盒准备：将所需ELISA试剂盒及各组大鼠血清样本平衡至室温。
(2)配备标准品：按照试剂盒说明书中标准品的准备方法配备和稀释标准品。
(3)加样：设置标准孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准孔各加不同浓度的标准品50 μL，0值孔加样本稀释液50 μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50 μL。
(4)加酶，孵育抗体：除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔加入HRP 标记的检测抗体100 μL，用封板膜盖住反应板，37 ℃恒温箱避光孵育60 min。
(5)洗板：揭开封板膜，弃去板中液体，并向每个孔中加满洗涤液，静置 20 s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复四五次。
(6)显色：将TMB显色底物按说明书充分混合后，所有孔中加入底物混合液 100 μL。封板37 ℃恒温箱避光孵育15 min。
(7)终止显色：所有孔中加入终止液 50 μL终止显色。
(8)读取吸光度(A)值：5 min内反应板置于酶标仪中，在 450 nm 波长下读取A值，绘制标准曲线，测算出样品中IL-1β、TNF-α、IL-17、MMP-3的质量浓度。
1.5 主要观察指标 ①Western Blot法检测大鼠脊柱关节软骨IL-17、IL-23、MMP-3、CCR-6表达水平；②大鼠脊柱关节苏木精-伊红染色及番红O-固绿染色镜下病理学表现及病理评分(国际骨关节炎研究学会评分和Mankin’s 评分)；③ELISA 法检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17、MMP-3的表达水平。
1.6 统计学分析数据采用 IBM SPSS 25.0 软件进行统计学分析，作图用GraphPad prism 10软件。多组之间计量资料比较采用One-Way ANOVA 方差分析，事后检验两组之间比较采用LSD法进行差异分析，检验水准α=0.05。文章统计学方法已经通过西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究旨在探讨人工虎骨粉对碘乙酸诱导的脊柱骨关节炎模型大鼠关节退变及关节软骨免疫微环境的调节作用，并阐明其可能的作用机制，结果发现人工虎骨粉治疗后的脊柱小关节软骨退行性改变得到明显改善，血清及关节软骨中IL-23/IL-17免疫轴相关炎症因子表达水平明显下降，关节软骨胶原产生明显增加，且人工虎骨粉剂量与软骨退变改善、炎症因子表达水平降低呈现相关性。上述结果提示，人工虎骨粉可减轻大鼠脊柱关节炎活动受限程度，改善关节软骨退变，缓解关节炎症对大鼠产生的影响。作者观察到在脊柱关节炎模型组大鼠中，IL- 23和IL-17的表达水平明显上调，这与先前的研究结果一致，表明IL-23/IL-17免疫轴在脊柱关节炎的发展中起到重要作用[26]。然而，在人工虎骨粉治疗后，IL-23和IL-17的表达水平以及IL-1β、TNF-α等炎症因子水平显著下调，进一步证实了人工虎骨粉抗炎的作用。此次研究结果表明，人工虎骨粉可降低大鼠血清IL-1β、TNF-α的表达水平，提示人工虎骨粉治疗骨关节炎的机制可能与下调细胞因子IL-1β、TNF-α分泌有关。与模型组相比较，使用人工虎骨粉各组血清IL-1β、TNF-α水平降低，这一结果提示，人工虎骨粉可能通过调节IL-23/IL-17免疫轴相关炎症因子的活性来改善脊柱关节炎的病理过程。通过Western Blot结果进一步分析作用机制，发现人工虎骨粉能够抑制关节炎模型大鼠关节软骨中IL-23的产生。IL-23是由多种免疫细胞产生的细胞因子，它在慢性炎症过程中起到重要的调节作用。通过抑制IL-23的产生，人工虎骨粉可能减少炎症反应的程度，从而改善脊柱关节炎的病理过程。另外，人工虎骨粉还能够抑制关节炎模型大鼠软骨中IL-17的产生。IL-17是一种由辅助性T细胞17分泌的促炎细胞因子[26]，它在自身免疫性疾病中发挥重要作用。通过抑制IL-17的产生，人工虎骨粉可能减少关节软骨免疫微环境中炎症细胞浸润和关节破坏，从而改善脊柱关节炎的病理过程。
骨关节炎是最常见的肌肉骨骼疾病，是导致全球残疾的常见疾病之一[27]。既往研究中，骨关节炎的病理过程涉及多种因素，如细胞因子、趋化因子、炎症递质、基质降解等，这些因素可能对滑膜、软骨、软骨下骨和其他关节结构造成损害，引起关节退行性改变，最终导致疼痛、僵硬和残疾[28-29]。大量研究表明，骨关节炎的病理过程与细胞免疫产生多种细胞因子及炎性因子密切相关，其中关节滑膜细胞及滑膜组织有大量巨噬细胞、T淋巴细胞的浸润，而激活的CD4+ T细胞能够分泌大量的炎性细胞因子IL-17、IL-1β、TNF-α等[30]。辅助性T细胞17在炎性反应和自身免疫中具有重要作用，辅助性T细胞17分泌多种炎性细胞因子，其中主要表达IL-17，IL-17能够刺激免疫细胞及非免疫细胞产生促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-α)及趋化因子的表达，引起组织炎性细胞浸润和组织破[31]。IL-23由活化的巨噬细胞和B淋巴细胞分泌产生，主要参与机体免疫性疾病的调节。IL-23作为一种调节因子，可促进辅助性T细胞17产生IL-17，促进炎性反应的发生[32]。炎性细胞因子的增多，导致关节软骨细胞的损伤。关节软骨由水和细胞外基质组成，Ⅱ型胶原、聚集聚糖或其他蛋白聚糖是细胞外基质的主要组成成分[33]，它们通常被蛋白聚糖包被[34]，对软骨细胞具有保护作用，当受到机械或炎症刺激时，会导致聚集聚糖酶和胶原酶的上调；同时，基质降解酶水平也会上调，其中MMP-3是主要的基质降解酶[35]。此次研究中，MMP-3在各造模组的大鼠中高表达，表明关节软骨损伤以及炎症因子刺激加重；与模型组比较，人工虎骨粉中、高剂量组血清MMP-3水平显著下调，这表明有效剂量人工虎骨粉可降低炎症因子表达、调控关节软骨免疫微环境，促进软骨细胞的修复进而改善关节软骨的退变。
骨关节炎中，在多种刺激下软骨细胞会增加一些细胞因子、趋化因子等的分泌，如IL-1β、TNF-α等，这些因子到达滑膜，并触发炎症过程[34]，导致软骨细胞丢失和软骨下骨的重塑。目前，骨关节炎的治疗包括关节置换术、药物治疗、物理疗法等[36]，然而，使被破坏的关节组织完全恢复仍然是一个难题。因此，寻找缓解疼痛、改善功能、延缓病情进展的理想方法具有重要的临床意义。近年来，人工虎骨粉作为一种传统中药，被广泛应用于治疗骨关节炎等骨骼疾病。既往研究表明，人工虎骨粉是国内治疗骨质疏松症的一类新药[37]，具有抗炎、镇静、镇痛、促进骨折愈合和改善骨质的作用[38]。这是由于人工虎骨粉富含骨胶原蛋白，可通过激活成骨细胞，促进基质被矿化及新骨形成；而且富含钙、磷，便于人体快速吸收，改善骨代谢，抑制骨质流失，增加骨密度[39]；同时，人工虎骨粉含有锌、铁、锰等微量元素，参与合成骨代谢活动中酶，加速合成骨胶原纤维的形成，促进骨量的增加及炎症愈合[40]。此外，人工虎骨粉可能通过调节炎症因子的产生和免疫细胞的活性来改善脊柱关节炎。先前研究表明，人工虎骨粉可抑制炎症因子如IL-1β和TNF-α等炎症因子的产生，同时能够调节免疫细胞的活性[41]。这些结果提示，人工虎骨粉可能通过多个途径来调节脊柱关节炎的病理过程。此次研究基于IL-23/IL-17免疫轴炎症分子通路，证实了人工虎骨粉可通过调控该免疫轴相关炎症因子的表达水平改善关节软骨免疫微环境。该研究结果为人工虎骨粉治疗骨关节炎提供了新的分子机制和作用靶点。
此次研究的局限性：研究仅进行了大鼠血清和关节软骨中炎症因子水平的分析，缺少大鼠关节液炎症因子的进一步补充验证；同时该研究仅在组织病理和细胞分子层面进行研究，结果虽然表明人工虎骨粉缓解骨关节炎进展可能与抑制IL-23/IL-17免疫轴的表达有关，但未行基因表达的对比或者反证。
总结起来，此次研究结果表明，人工虎骨粉能有效改善碘乙酸化学诱导的骨关节炎大鼠的关节软骨退变病理形态，其作用机制是通过降低IL-17/IL-23免疫轴相关炎症因子的表达水平，改善关节软骨免疫微环境。这些发现为人工虎骨粉在治疗骨关节炎方面的应用提供了理论依据和新的分子靶点机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人工虎骨粉改善脊柱骨关节炎大鼠脊柱小关节的退变及关节软骨免疫微环境

Artificial tiger bone meal improves degeneration of spinal facet joints and immune microenvironment of articular cartilage in rats with spine osteoarthritis

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