转录组测序分析黄连总碱抗脑缺血的作用机制

doi:10.12307/2025.063

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4161-4171.doi: 10.12307/2025.063

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转录组测序分析黄连总碱抗脑缺血的作用机制

田良良1，2，周瑞3，曹光昭1，张晶晶1，4

1中国中医科学院，中药研究所，北京市 100700；2广东药科大学，中医药研究院，广东省广州市 510006；3广州中医药大学中药学院，广东省广州市 510006；4北京脑科学与类脑研究中心，北京市 102206

收稿日期:2023-11-24 接受日期:2024-04-15 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 张晶晶，博士，研究员，中国中医科学院，中药研究所，北京市 100700；北京脑科学与类脑研究中心，北京市 102206
作者简介:田良良，男，1996年生，广东药科大学在读硕士，主要从事中药药理方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81974550)，项目负责人：张晶晶；中国中医科学院创新工程(CI2021A04612)，项目负责人：张晶晶

Action mechanism of Coptidis Rhizoma Alkaloids against cerebral ischemia based on transcriptome sequencing

Tian Liangliang1, 2, Zhou Rui3, Cao Guangzhao1, Zhang Jingjing1, 4

1Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 2Institute of Chinese Medicinal Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 3School of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 4Chinese Institute for Brain Research, Beijing 102206, China

Received:2023-11-24 Accepted:2024-04-15 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Zhang Jingjing, PhD, Researcher, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; Chinese Institute for Brain Research, Beijing 102206, China
About author:Tian Liangliang, Master candidate, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; Institute of Chinese Medicinal Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 81974550 (to ZJJ); Innovation Project of China Acadenly of Chinese Medical Sciences, No. CI2021A04612 (to ZJJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

转录组测序：近年来，基于转录组学的研究方法为深入了解中医药干预脑缺血的分子机制和治疗靶点提供了新的途径，转录组测序可以帮助确定在缺血性脑卒中过程中基因表达的全貌。
黄连总碱：为黄连中的生物碱，文献报道其能减轻缺血再灌注损伤大鼠的炎症反应，降低肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素1β表达水平。

摘要
背景：黄连清热燥湿、泻火解毒，黄连及其成分对脑缺血有显著的保护作用，基于网络药理学和转录组测序探究黄连总碱抗脑缺血的作用机制。
目的：在明确黄连总碱对脑缺血大鼠保护作用的基础上，基于网络药理学和转录组测序技术探讨黄连总碱干预脑缺血的作用机制。
方法：将SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、阳性药物组和黄连总碱组，后3组采用改良线栓法制备大脑中动脉阻塞的缺血再灌注模型，假手术组不插入线栓，其余手术操作相同。通过TTC染色、Longa 5神经功能缺损评分、苏木精-伊红染色、尼氏染色评价黄连总碱对脑缺血再灌注模型大鼠的脑保护作用。对假手术组、缺血再灌注组、黄连总碱组大鼠脑组织进行转录组测序，通过差异表达基因筛选、基因本体论分析、京都基因与基因组百科全书分析以及转录组学与网络药理学关联分析，阐明黄连总碱干预脑缺血的作用特点，最后通过ELISA检测及免疫荧光染色对黄连总碱干预脑缺血的关键靶点进行验证。

结果与结论：①黄连总碱可降低缺血再灌注模型大鼠Longa 5神经功能缺损评分及脑梗死面积，增加神经元、尼氏小体数目；②黄连总碱治疗后差异表达基因的基因本体论功能富集分析包括炎症反应、分裂原活化蛋白激酶级联的正调控等生物学过程；京都基因与基因组百科全书通路富集分析主要涉及白细胞介素17信号通路、神经活性配体-受体相互作用、环磷腺苷信号通路等通路；③转录组分析发现黄连总碱主要调控的基因有前列腺素内过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子、瞬间受体电位A1等；④采用网络药理学分析发现，黄连总碱中9个成分可能通过87个成分靶点关联到过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子及瞬间受体电位A1而发挥作用；⑤ ELISA检测及免疫荧光染色结果进一步证实，黄连总碱调控脑缺血再灌注模型大鼠过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达；⑥提示黄连总碱能明显改善脑缺血再灌注模型大鼠损伤，可能通过调控过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1而发挥作用。

https://orcid.org/0000-0002-4105-3905 (田良良)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 黄连总碱, 脑缺血, 转录组测序, 过氧化物合酶2, 脑源性神经营养因子, 瞬间受体电位A1

Abstract: BACKGROUND: Coptis chinensis can clear heat, dry dampness, relieve fire, and detoxify. Coptis chinensis and its components have a significant protective effect on cerebral ischemia. The action mechanism of anti-cerebral ischemia of Coptidis Rhizoma Alkaloids was explored based on network pharmacology and transcriptome sequencing.
OBJECTIVE: Based on the study of the protective effects of Coptidis Rhizoma Alkaloids on cerebral ischemia of rats, the action mechanism of Coptidis Rhizoma Alkaloids intervention in cerebral ischemia was investigated by using network pharmacology and transcriptome sequencing technology.
METHODS: The SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia/reperfusion group, positive drug group, and Coptidis Rhizoma Alkaloids group. The ischemia/reperfusion model of middle cerebral artery occlusion was prepared by modified thread method in the latter three groups. No thread was inserted and the other operations were the same in the sham operation group. TTC staining, Longa 5 neurological deficient score, hematoxylin and eosin staining, and Nissl staining were used to evaluate the protective effect of Coptidis Rhizoma Alkaloids on ischemia/reperfusion model rats. Transcriptome sequencing was performed on the brain tissues of rats in sham operation group, ischemia/reperfusion group, and Coptidis Rhizoma Alkaloids group. Differentially expressed genes, gene Ontology analysis, Kyoto encyclopedia of genes and genomes analysis, and Correlation Analysis of Transcriptomics and Network Pharmacology were used to elucidate the effect of Coptidis Rhizoma Alkaloids on cerebral ischemia. Finally, ELISA and immunofluorescence staining were used to verify the key targets of Coptidis Rhizoma Alkaloids in the intervention of cerebral ischemia.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Coptidis Rhizoma Alkaloids treatment decreased the Longa 5 neurological deficit scores and cerebral infarction area of ischemia/reperfusion model rats, increased the number of neurons and Nissl bodies. (2) Differentially expressed gene after Coptidis Rhizoma Alkaloids treatment analyzed by functional enrichment analysis of gene ontology includes biological processes such as inflammatory reaction and positive regulation of mitogen-activated protein kinase cascade. The enrichment analysis of Kyoto gene and genome encyclopedia analysis pathway mainly involves interleukin-17 signaling pathway, neuroactive ligand-receptor interaction, cyclic adenosine-3′,5′-mconophosphate signaling pathway and so on. (3) Analysis of transcriptomics showed that the main genes regulated by Coptidis Rhizoma Alkaloids were prostaglandin endoperoxide synthase 2, brain derived neurotrophic factor, and transient receptor potential A1. (4) Network pharmacology analysis revealed that nine components in Coptidis Rhizoma Alkaloids may exert their effects by associating with 87 targets related to prostaglandin endoperoxide synthase 2, brain derived neurotrophic factor, and transient receptor potential A1. (5) ELISA and immunofluorescence staining results further confirmed that Coptidis Rhizoma Alkaloids regulated the expression of prostaglandin endoperoxide synthase 2, brain derived neurotrophic factor, and transient receptor potential A1. (6) It is concluded that Coptidis Rhizoma Alkaloids treatment can significantly improve the injury in ischemia/reperfusion model rats, possibly by regulating prostaglandin endoperoxide synthase 2, brain derived neurotrophic factor, and transient receptor potential A1.

Key words: Coptidis Rhizoma Alkaloids, cerebral ischemia, transcriptome sequencing, prostaglandin endoperoxide synthase 2, brain derived neurotrophic factor, transient receptor potential A1

中图分类号:

田良良, 周瑞, 曹光昭, 张晶晶. 转录组测序分析黄连总碱抗脑缺血的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4161-4171.

Tian Liangliang, Zhou Rui, Cao Guangzhao, Zhang Jingjing. Action mechanism of Coptidis Rhizoma Alkaloids against cerebral ischemia based on transcriptome sequencing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4161-4171.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 56只大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、阳性药物组和黄连总碱组，每组14只。取材后每组6只行TTC染色；每组3只行病理染色及转录组测序；最后每组5只行ELISA检测。
2.2 黄连总碱含量测定结果 黄连碱含量为91.07 mg/g、盐酸小檗碱含量为222.07 mg/g、盐酸巴马汀含量为57.36 mg/g，表小檗碱含量为41.81 mg/g，四者在黄连总碱中共含有41.23%。
2.3 黄连总碱化学成分与潜在作用靶点 通过数据库筛选后获得palmatine作用靶点16个，berberine作用靶点16个，epiberberine作用靶点10个，coptisine作用靶点9个，columbamine作用靶点19个，jatrorrhizine作用靶点18个，magnoflorine作用靶点21个，ferulic
acid作用靶点14个，groenlandicine作用靶点15个，berberrubine作用靶点12个，oxyberberine作用靶点18个，choline作用靶点1个，8-oxocoptisine作用靶点41个，合并后删除重复值共得到药物作用靶点87个，见表1。

2.4 黄连总碱降低缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分 脑缺血再灌注24 h的Longa 5评分显示，假手术组未见神经功能缺损，缺血再灌注组的神经功能缺损评分较高，与缺血再灌注组相比，黄连总碱组和阳性药物组的神经功能缺损得到明显改善(P < 0.01)，表明黄连总碱对缺血再灌注大鼠具有较好的神经保护作用，见表2。

2.5 黄连总碱降低缺血再灌注大鼠脑梗死率 由TTC染色结果可知，与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠脑梗死面积显著增大(P < 0.01)；与缺血再灌注组大鼠比较，黄连总碱组和阳性药物组明显改善缺血再灌注大鼠脑梗死情况，降低脑梗死面积(P < 0.01)，见表2及图1。
2.6 黄连总碱对缺血再灌注大鼠脑组织染色病理形态的影响 病理染色结果显示，假手术组大鼠大脑皮质轮廓清晰，形态完整，未见明显的空泡及细胞变性，海马神经元排列规则、紧密，细胞形态正常，胞浆丰富，核仁明显，尼氏小体着色较深且数量多；缺血再灌注组大鼠大脑皮质组织疏松，有明显空泡，海马神经元排列松散、紊乱，细胞间隙增宽，神经元细胞稀疏、数量少，部分丢失，细胞核固缩，与周围组织不紧密，尼氏小体颜色变浅；与缺血再灌注组相比较，黄连总碱组大鼠脑皮质轮廓较清晰，形态较完整，空泡明显减少，正常细胞多，海马神经元数量较多，尼氏小体数量较多，染色较均一，结构较完整，见图2及表3，4。

2.7 转录组揭示黄连总碱干预脑缺血的差异表达基因 为了鉴定出黄连总碱干预脑缺血的作用特点，进行转录组测序。如图3A所示，缺血再灌注组与假手术组相比共有1 650个差异表达基因，其中1 256个上调差异表达基因，394个下调差异表达基因；如图3B所示，与缺血再灌注组相比，黄连总碱组的差异表达基因共519个，其中126个上调差异表达基因，393个下调差异表达基因。差异表达基因的热图分析显示，给药黄连总碱后，模型大鼠差异表达基因的表达量向假手术组显著回调，见图4。

2.8 GO 功能富集分析和 KEGG 通路富集分析 与缺血再灌注组相比，黄连总碱组的差异表达基因主要富集到38个GO条目，其中生物过程20条，细胞组分5条，分子功能13条。排前5位的生物过程分别是对含嘌呤化合物的反应(response to purine-
containing compound)、多细胞生物过程(multi-multicellular organism process)、炎症反应(inflammatory response)、对肽类激素的反应(response to peptide hormone)、分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联的正调控(positive regulation of MAPK cascade)；排前5位的细胞组分分别是细胞外基质(extracellular matrix)、膜侧(side of membrane)、肌原纤维(myofibril)、细胞基底部(basal part of cell)、致密核心颗粒(dense core granule)；排前5位分子功能分别是信号受体调节活性(signaling receptor regulator activity)、趋化因子的活动(chemokine activity)、肽激素结合(peptide hormone binding)、激素的活动(hormone activity)、醇脱氢酶(NAD+)活性[alcohol dehydrogenase (NAD+) activity]。见图5A。
与缺血再灌注组相比，黄连总碱组的差异表达基因共富集到10条KEGG通路，主要为白细胞介素17信号通路(IL-17 signaling pathway)、神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、环磷腺苷信号通路(cAMP signal pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，见图5B。

2.9 网络药理学分析 将转录组学黄连总碱组与缺血再灌注组的关键差异表达基因与网络药理学黄连总碱抗脑缺血预测的87个潜在作用靶点进行关联分析，构建成分-靶点-差异表达基因图，由图6可知，差异表达基因与预测的87个潜在作用靶点能较好关联，黄连总碱可能通过干预预测的87个潜在作用靶点而影响过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子及瞬间受体电位A1发挥抗脑缺血
作用。
2.10 ELISA检测脑组织过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1表达水平 对黄连总碱干预脑缺血的关键靶点进行验证，结果表明，相较于假手术组，缺血再灌注组大鼠脑组织过氧化物合酶2表达水平显著升高(P < 0.01)，脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1表达水平均明显降低(P < 0.01)；相较于缺血再灌注组，黄连总碱组大鼠脑组织过氧化物合酶2表达水平显著降低(P < 0.01)，脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1表达水平均明显升高(P < 0.01)，见表5。

2.11 免疫荧光法检测大鼠脑组织中过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达结果 结果见图7。与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠脑组织中过氧化物合酶2的荧光强度明显增强，阳性细胞数增多；脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1荧光强度明显减弱，阳性细胞数减少。与缺血再灌注组比较，黄连总碱组大鼠脑组织中过氧化物合酶2的荧光强度明显减弱，阳性细胞数减少；脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1荧光强度明显增强，阳性细胞数增加。

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引言

脑卒中是常见的脑血管疾病，是全球第二大死亡原因，其中缺血性脑卒中占卒中总数的近80%[1-3]。目前临床上可用的治疗缺血性脑卒中的方法为组织型纤溶酶原激活剂、重组组织型纤溶酶原激活剂溶栓治疗和血管内血栓切除术等，旨在血管快速再通，以恢复受损区域的氧气和营养供应。然而，溶栓最佳治疗时间窗为发病后4.5 h内，在全球范围内仅有不到5%的急性缺血性脑卒中患者能及时接受静脉溶栓治疗，这限制了治疗的普及性和有效性[4-5]。此外，在一些患者中，早期恢复血流灌注易发生更严重的脑缺血再灌注损伤[6]，其临床治疗是一个巨大的挑战，亟需寻求更安全有效的治疗方式。
近年来，基于转录组学的研究方法为深入了解中医药干预脑缺血的分子机制和治疗靶点提供了新的途径。缺血性脑卒中会导致大量基因表达水平的变化，转录组测序可以帮助确定在缺血性脑卒中过程中基因表达的全貌，有助于探究缺血性脑卒中病理过程的分子基础，包括细胞的坏死和凋亡、缺血性损伤、治疗反应和炎性细胞浸润。同时，通过对差异表达基因进行富集分析，可以了解在缺血性脑卒中受到影响的生物学过程和信号通路，这有助于理解脑缺血损伤的分子机制，也为发展针对特定生物学过程和信号通路的治疗方法提供线索[7-8]。
黄连清热燥湿、泻火解毒，研究表明对脑缺血有显著的保护作用，其成分黄连素(小檗碱)具有显著的抗炎和减轻氧化应激的作用，可维持正常的内皮功能，减轻缺血再灌注损伤，具有潜在的神经保护和抗凋亡作用[9-13]；黄连总碱能显著降低缺血再灌注大鼠脑梗死率和神经功能缺损评分，减轻炎症反应，降低肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素1β水平[14]。此次研究在明确黄连总碱对脑缺血大鼠保护作用的基础上，基于网络药理学和转录组测序技术探讨黄连总碱干预脑缺血的作用机制，并通过实验验证，以明确黄连总碱抗脑缺血的机制、特点，为进一步研究黄连总碱在抗脑缺血的治疗和应用提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 通过转录组测序及与网络药理学关联分析黄连总碱在脑缺血中的作用通路和治疗靶点，通过实验来验证。
1.2 时间及地点 实验于2022年9月至2023年5月在中国中医科学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组 成年雄性SPF级SD大鼠56只，体质量280-320 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2014-0004，自由进食水，室温22-26 ℃，湿度55%。适应性喂养3 d后，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、缺血再灌注组、阳性药物组[银杏叶提取物片20 mg/(kg·d)]和黄连总碱组[165 mg/(kg·d)]，每组14只。每天灌胃给药1次，连续5 d，于第5天给药后1 h造模，缺血再灌注24 h后取材。实验中所有操作均得到中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会批准(批准号：IBTCMCACMS21-2109-04)。
1.3.2 药品、试剂与仪器 黄连总碱(西南大学[15])；银杏叶提取物片(德国威玛舒培博士药厂，批号：HJ20140768)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司，货号：P3761-25G)；鱼线线栓(北京西浓科技有限公司，货号：2838-50/A4)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)(美国Sigma公司)；BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermoscientific，货号：23225)；过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为：E-EL-R0792c和E-EL-R1235c)，瞬间受体电位A1 ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号：SEF831Ra)；过氧化物合酶2抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66351-1-Ig)；脑源性神经营养因子(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66292-1-Ig)；瞬间受体电位A1(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：19124-1-AP)；抗小鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00013-3)；抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00013-2)；高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技有限公司公司，型号：SCIENTZ-48)；超高效液相色谱(美国Waters公司，型号：UPLC I-Class)；串联四极杆质谱系统(美国Waters公司，型号：XEVO TQ-XS)；全自动多功能全景组织细胞扫描仪(OLYMPUS公司，型号：VS 120-S6-W)。
1.4 实验方法
1.4.1 黄连总碱中黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量测定 (1)对照品与样品溶液的制备：分别取黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀、表小檗碱对照品适量，精密称定，分别置于10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，精密稀释，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归。取黄连总碱粉末适量，精密称定，加入1 mL的80%甲醇，称质量，超声提取1 h，放冷后补质量，摇匀，取100 μL以3倍甲醇稀释，摇匀，离心，取上清后梯度稀释，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
(2)色谱及质谱条件：Waters UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：A相(水，0.1%甲酸)、B相(乙腈)；洗脱梯度条件：0-1.0 min(98% A)，1.0-11.0 min(98%-0% A)，11.0-14.0 min(0% A)，14.1-16.0 min(98% A)；流速：0.3 mL/min，进样量：2.0 µL，柱温：50 ℃。电喷雾离子源(ESI)，多重反应监测(MRM)模式下正离子测定，离子源温度150 ℃，去溶剂温度500 ℃，锥孔气体流速10 L/h，去溶剂气体流速1 000 L/h，离子源电压3.0 kV、锥孔电压30 V。
1.4.2 黄连总碱潜在作用靶点的筛选 采用中药系统药理学分析平台数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以黄连总碱的化学成分：palmatine(巴马汀)，berberine(小檗碱)，epiberberine
(表小檗碱)，coptisine(黄连碱)，columbamine(非洲防己碱)，jatrorrhizine(药根碱)，magnoflorine(木兰碱)，ferulic acid(阿魏酸)，groenlandicine(格陵兰黄连碱)，berberrubine(小檗红碱)，oxyberberine(氧化小檗碱)，choline(胆碱)，8-oxocoptisine(8-氧代黄连碱)为关键字进行检索，筛选出对应靶点。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，统一在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将化合物作用的蛋白质靶点进行规范，使用Swiss target predicate数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)补充中药系统药理学分析平台数据库未能检索到的成分靶点。
1.4.3 脑缺血相关靶点筛选 通过在GeneCards人类基因数据库(http：//www.genecards.org/，Version 4.13)和人类孟德尔遗传在线数据库(https://www.omim.org/)中分别输入关键词“cerebral ischemic stroke”“cerebral stroke”和“ischemic stroke”为关键字检索与脑缺血相关的靶点。GeneCards数据库所得靶点以≥中位数条件进行筛选，合并疾病数据库靶点后，删除重复值得到脑缺血相关靶点。

1.4.4 脑缺血模型制备 缺血再灌注组、阳性药物组和黄连总碱组均采用改良线栓法制备大脑中动脉阻塞的缺血再灌注模型，大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，剃毛器去除颈部手术区毛发，碘伏消毒，固定于手术台上，经颈正中剪开皮肤、钝性分离皮下结缔组织及肌肉，使颈总动脉和颈外动脉暴露，小心分离血管及迷走神经，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉远心端打一松结作为固定线。在颈总动脉近心端结扎线和颈总动脉上的固定线之间用显微剪刀剪一斜行小口，将线栓由此小口缓慢插入颈内动脉，系紧固定线。松开颈内动脉动脉夹，轻推线栓入颈内动脉，一般插入18-20 mm。90 min后，轻轻拔出线栓，扎紧固定线。假手术组不插入线栓，其余手术操作相同。

1.4.5 神经功能缺损评分 再灌注24 h后，进行Longa 5神经功能缺损评分，具体如下：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。根据Longa评分≥0.5分及TTC染色结果确定是否造模成功，将未成模的大鼠剔除并补齐。
1.4.6 TTC染色 缺血再灌注24 h后取材，大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉处死后，断头取脑，生理盐水冲洗鼠脑，将脑放入脑模具内，依视交叉为基准，远心端切2片，近心端切4片，共切6片，每片2 mm，在37 ℃ 1% TTC中避光孵育20 min后用多聚甲醛固定。梗死区呈白色，正常脑组织呈红色。脑梗死率计算公式如下：脑梗死率=脑梗死面积/脑总面积。
1.4.7 苏木精-伊红染色 缺血再灌注24 h，将大鼠脑组织置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h。常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色：石蜡组织切片烤片1 h后按顺序依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各20 min，体积分数95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各10 min，1×PBS洗3次，每次5 min。苏木精染色5 min。1×PBS洗3次，每次5 min。伊红染色1 min，自来水冲洗1 min。脱水、透明：依次置于体积分数70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各5 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min。封固剂封固，然后电子显微镜下观察染色结果。显微镜下观察、拍照。每张切片选取大脑皮质区、CA1区、CA3区观察神经元，进行统计。
1.4.8 尼氏染色 石蜡组织切片烤片1 h后依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、体积分数95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min，自来水洗3 min，然后置于60 ℃温箱用1%甲苯胺蓝染色40 min；自来水洗净染料后，分别置于体积分数70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇以及无水乙醇中脱水，再用二甲苯透明10 min，中性树胶封固。显微镜下观察、拍照。每张切片选取皮质区、CA1区、CA3区观察尼氏小体，进行统计。
1.4.9 转录组测序 转录组测序样本选取每只大鼠的同一片脑组织。
(1)RNA 提取与检测：Agilent 2100 bioanalyzer精确检测RNA完整性和总量。
(2)文库构建与质检：通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，在Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV反转录酶体系中合成cDNA 第1条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymeraseⅠ体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第2条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads 筛选370-420 bp的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPureXP beads 纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，再使用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。
(3)测序：库检合格后进行Illumina测序，在测序的flow cell中加入4种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
1.4.10 生物信息学分析 测序完成后，将基因数据集进行组间差异表达基因分析，把|log2FC|≥1且P < 0.05作为筛选标准，筛选出的差异表达基因利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)绘制火山图和聚类热图，进行可视化分析。
1.4.11 黄连总碱抗脑缺血靶点基因本体论(gene ontology，GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 将筛选出的差异表达基因上传至Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.)，进行GO和KEGG通路富集分析，运用在线网站微生信对GO与KEGG富集结果进行可视化处理。
1.4.12 网络药理学分析 将筛选出的黄连总碱组与缺血再灌注组的差异表达基因提交至 STRING 11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白-蛋白互作网络，并通过 CytoScape 3.10对蛋白-蛋白互作网络进行可视化分析，按照Degree≥2倍中位数进行筛选，得到核心靶点，计算出各节点的度值(Degree)，根据Degree大小筛选出黄连总碱抗脑缺血的关键靶点，将黄连总碱组与缺血再灌注组的差异表达基因中的关键靶点与黄连总碱经网络药理学预测的潜在作用靶点在STRING 11.0数据库(https://string-db.org)进行数据关联，并通过CytoScape 3.10可视化分析。
1.4.13 BCA法蛋白定量及ELISA检测 用预冷的生理盐水冲洗大鼠脑组织，去除脑组织上的残留血液，切成2 mm的脑片；再加入一定体积(一般按1∶9的质量体积比)的PBS，在高通量组织研磨器中充分研磨，最后将匀浆液低温离心后取上清液，并将所有样本蛋白浓度稀释到推荐浓度，BCA法蛋白定量；按照ELISA试剂盒说明书检测过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的浓度。
1.4.14 免疫荧光法检测大鼠脑组织中过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达 将大鼠脑组织石蜡切片烤片1 h后脱蜡，PBS清洗3次，每次不少于5 min；1% Triton-X-100 溶液中30 min，再用PBS清 3次；滴加5% BSA在37 ℃下封闭1 h；分别滴加一抗(1∶200)，置于4 ℃过夜；次日在室温下放置45 min后，用PBS洗涤3次；向待染区滴加二抗(1∶200)，室温孵育1 h，PBS清洗3次；滴加含DAPI封固剂后封固，在荧光显微镜下拍照采集图像。
1.5 主要观察指标 缺血再灌注24 h后进行Longa 5神经功能缺损评分。取材后进行TTC染色及计算脑梗死面积；苏木精-伊红和尼氏染色分别观察大脑皮质区、CA1区、CA3区的神经元和尼氏小体数量；ELISA及免疫荧光检测过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达水平。

1.6 统计学分析 所有实验数据均使用SPSS 26.0统计软件进行处理分析，数据用x±s表示，两组样本间比较采用独立样本t检验，多组样本比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

此次研究采用以大脑中动脉阻塞模型为基础的脑缺血再灌注大鼠模型，该模型具有稳定性好、重复性高的特点，以评价黄连总碱干预缺血再灌注大鼠的药效。银杏叶提取物是银杏科植物银杏干燥叶的提取物，是临床上使用最为广泛的中药提取物之一，在脑梗死的临床治疗中疗效良好[16]，文献报道银杏叶提取物片对脑缺血大/小鼠有很好的保护作用[17-21]，用来作为阳性药。实验结果表明，与缺血再灌注组比，黄连总碱组和阳性药物组大鼠Longa 5神经功能缺损评分显著降低，脑梗死面积显著减少；脑组织染色病理形态显示，与缺血再灌注组相比，黄连总碱组大鼠皮质轮廓更清晰，空泡数量明显减少，神经元及尼氏小体数量更多；ELISA及免疫荧光结果表明黄连总碱能显著降低缺血再灌注大鼠过氧化物合酶2的表达，升高脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达；表明黄连总碱对缺血再灌注大鼠有显著的保护作用，可能通过干预过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1而发挥抗脑缺血作用。
对黄连总碱组与缺血再灌注组的差异表达基因进行GO、KEGG分析，GO分析结果表明主要富集在炎症反应(inflammatory response)和MAPK级联的正调控(positive regulation of MAPK cascade)等生物学功能上。KEGG分析结果表明主要富集在白细胞介素17信号通路(IL-17 signaling pathway)、神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)和环磷腺苷信号通路(cAMP signal pathway)等通路上。
炎症反应在脑血管疾病的病理生理学中被认为是关键因素，尤其是动脉闭塞引起的卒中或缺血性脑卒中，在脑卒中的发生和发展中起着核心作用。缺血性脑卒中损伤后有大量炎性细胞因子表达和炎性细胞浸润，引起一系列炎症反应[22-23]。MAPK级联包含MAPK激酶激酶(MAPK kinase kinase，MAP3K)、MAPK激酶(MAPK kinase，MAP2K/MEK/MKK)和MAPK3个顺序激活的蛋白激酶，调控细胞生长、参与免疫调节、调控炎症反应等[24]。中枢神经系统内存在的MAPK级联传导途径，可能参与了脑缺血性损害或修复机制，在脑缺血缺氧后，调控神经元的生存与凋亡[25-26]。
白细胞介素17信号通路与脑卒中相关，脑卒中时，γδ T细胞会产生白细胞介素17，白细胞介素17可诱导基质细胞表达促炎性递质，进而导致中性粒细胞的募集和活化，并吸引中性粒细胞到损伤部位，脑卒中后临床相关时间点阻断白细胞介素17通路可显著减少梗死灶的体积并改善患者的临床预后。白细胞介素17来源于Th17细胞，是一种重要的炎症因子，主要生物学作用是促进炎症反应，其过表达预示缺血性脑卒中的治疗效果和预后较差[27-29]。神经活性配体-受体相互作用是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合，涉及信号分子和相互作用，在许多细胞过程中发挥关键功能，如细胞凋亡，在缺血性梗死外围区占重要地位，会促进神经元死亡；并且与神经功能和功能性神经疾病相关，参与缺氧诱导的损伤[30-32]。环磷腺苷信号通路参与脑缺血后的多种神经保护机制，与神经元存活过程、运动功能恢复和轴突再生、细胞凋亡相关，环磷腺苷通过激活PKA介导的信号通路维持神经元的生长，并通过影响下游基因转录引起的分子效应减轻神经元生长抑制因子对轴突生长锥的损伤，从而促进轴突再生[33-35]。
将转录组学与网络药理学关联分析，鉴定出黄连总碱中可能干预过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的9个成分。文献报道，小檗碱对体内外脑卒中模型有显著的神经保护作用[36]，小檗碱对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的活化有关[37]。胆碱可有效减轻永久性大脑中动脉闭塞大鼠脑缺血损伤，其机制可能是通过上调α7 nAChR水平，诱导缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达，促进软膜动脉生成和大脑皮质毛细血管新生[38]。阿魏酸通过抑制缺血诱导的兴奋性毒性、炎症反应和细胞凋亡发挥抗脑缺血作用[39]。药根碱可能通过减少细胞凋亡对缺血性卒中有治疗潜力[40]。木兰花碱通过自噬/sirt1/AMPK信号通路减轻脑缺血神经元损伤[41]。巴马汀通过激活AMPK/Nrf2通路保护脑缺血再灌注损伤[42]，巴马汀具有抗炎作用，对脑梗死、神经元损伤、感觉运动和记忆障碍的作用明显减轻[43]。过氧化物合酶2基因是脑血管缺血性疾病的易感位点，是脑缺血和铁死亡的关键基因和生物标志物，可能是缺血性脑卒中发生发展的危险因素；当缺血性脑卒中发生时，过氧化物合酶2在大脑中过度表达，并使梗死灶扩大，过氧化物合酶2可能是治疗缺血性脑卒中的潜在靶标，其能抑制细胞调亡，对脑缺血小鼠起到保护作用[44-48]。过氧化物合酶2属于白细胞介素17信号通路上的靶点，白细胞介素17会促进过氧化物合酶2的表达[49-50]。脑源性神经营养因子属于神经营养因子家族，主要由神经元合成，响应神经元活动、运动和学习而分泌，能保护缺血半暗带区域的神经元，在大脑发育、记忆、神经元分化和存活以及突触可塑性中发挥关键作用，这对脑卒中后康复至关重要，是脑卒中后康复的关键调节因子[51-55]。脑源性神经营养因子与环磷腺苷在同一条信号通路上，增加环磷腺苷和磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白可以上调脑源性神经营养因子的蛋白表达[56]。瞬间受体电位A1通道存在于内皮细胞，在血管平滑肌细胞近端内皮细胞膜上，是缺氧的早期感受器，展开适应性反应，当瞬间受体电位A1通道被低氧源性活性氧激活后，会启动内皮依赖性超极化、扩张脑动脉、减轻缺血性损伤，而脑血管病与活性氧生成增加和氧化应激有关[57-59]。ELISA检测和免疫荧光染色结果表明，黄连总碱可显著降低缺血再灌注大鼠过氧化物合酶2、升高脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1的表达水平，进一步支持了黄连总碱在抗脑缺血的作用机制。
综上所述，此次研究通过转录组初步揭示了黄连总碱抗脑缺血的潜在作用机制，并采用网络药理学鉴定黄连总碱干预脑缺血潜在有效单体成分。结果表明，黄连总碱对缺血再灌注大鼠有明显的保护作用，可能通过9个化合物调控过氧化物合酶2、脑源性神经营养因子和瞬间受体电位A1发挥抗脑缺血作用，其中6个化合物有文献报道用于抗脑缺血，3个化合物研究较少，这些研究结果为进一步探究黄连总碱在脑缺血中的作用机制提供了一定基础，为基于黄连总碱治疗脑缺血的药物开发和应用提供了一定参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

转录组测序分析黄连总碱抗脑缺血的作用机制

Action mechanism of Coptidis Rhizoma Alkaloids against cerebral ischemia based on transcriptome sequencing

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