基于干性指数模型对肉瘤预后、免疫浸润和铁死亡调控的分析

doi:10.12307/2025.055

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4151-4160.doi: 10.12307/2025.055

• 干细胞相关大数据分析 Stem cell-related big data analysis • 上一篇下一篇

基于干性指数模型对肉瘤预后、免疫浸润和铁死亡调控的分析

魏婧娴1，孟莲1，孙皓1，张田田1，刘春霞1，2

1石河子大学医学院病理学系/石河子大学第一附属医院病理科，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；2广州医科大学附属第二医院病理科，广东省广州市 510260

收稿日期:2023-11-13 接受日期:2024-04-03 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 刘春霞，博士，教授，主任医师，博士生导师，石河子大学医学院病理学系/石河子大学医学院第一附属医院病理科，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；广州医科大学附属第二医院病理科，广东省广州市 510260
作者简介:魏婧娴，女，1996年生，山西省长治市人，在读硕士研究生，主要从事软组织肉瘤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960485)，项目负责人：刘春霞；国家自然科学基金项目(82060487)，项目负责人：孟莲；2022年广州市科技计划市校联合项目(202201020104)，项目负责人：刘春霞

Analysis of regulation of prognosis, immune infiltration, and ferroptosis in sarcoma based on stemness index model

Wei Jingxian1, Meng Lian1, Sun Hao1, Zhang Tiantian1, Liu Chunxia1, 2

1Department of Pathology, Shihezi University School of Medicine/Department of Pathology, The First Affiliated Hospital, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China

Received:2023-11-13 Accepted:2024-04-03 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Liu Chunxia, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Pathology, Shihezi University School of Medicine/Department of Pathology, The First Affiliated Hospital, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
About author:Wei Jingxian, Master candidate, Department of Pathology, Shihezi University School of Medicine/Department of Pathology, The First Affiliated Hospital, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960485 (to LCX); National Natural Science Foundation of China, No. 82060487 (to ML); City-School Joint Fund Project of Guangzhou Science and Technology Plan in 2022, No. 202201020104 (to LCX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肿瘤干细胞：肿瘤中的一小群具有无限增殖潜能、能促进肿瘤发生的细胞被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞通常处于相对静止的细胞周期，对放疗和化疗药物不敏感，但会在某些刺激因子作用下重新进入细胞周期并快速增殖。肿瘤干细胞是肿瘤耐药性和复发的主要原因之一。
铁死亡：是新发现的一种细胞程序性死亡形式，有别于细胞凋亡、细胞焦亡和自噬等细胞死亡方式，铁死亡的特征是铁依赖性的细胞主动性程序化死亡，研究认为铁死亡失调可能是肿瘤细胞化疗耐药的重要机制之一。

摘要
背景：干性指数可能与肉瘤预后、免疫浸润有关，但具体调控机制与特征基因尚不清楚。
目的：利用基因干性指数模型探究肉瘤干细胞与患者预后和免疫浸润的关系，并识别肉瘤干细胞铁死亡特征基因。
方法：从癌症基因组图谱(TCGA)中获取肉瘤RNA测序数据及相关临床信息。利用肉瘤干性指数，对获取的肉瘤RNA测序数据进行分组。利用生存数据进行组间预后情况分析，获取组间差异表达基因后进行通路富集和免疫浸润分析。获得铁死亡相关差异基因，构建蛋白互作网络并进行预后相关性分析。培养横纹肌肉瘤细胞系，分为贴壁细胞组和干细胞组，贴壁细胞组不予任何干预，干细胞组通过无血清培养处理以诱导横纹肌肉瘤干细胞富集，qRT-PCR验证干细胞相关标志物、铁死亡相关差异基因以及铁死亡相关标志物的mRNA表达。
结果与结论：①以干性指数中位数为界将患者分成高干性指数组和低干性指数组，通过患病风险预测显示高干性指数组患者的无进展生存期低于低干性指数组，提示预后不佳；②GO、KEGG分析显示肉瘤高、低干性指数组差异表达基因参与不同的细胞通路；高干性指数组和低干性指数组之间免疫浸润存在差异；差异基因中有23个铁死亡相关基因，其中9个可构成相关性较强的蛋白互作网络，其中IDO1、IFNG、AQP5高表达的肉瘤患者预后更好，CA9高表达的肉瘤患者预后不佳；③qRT-PCR结果显示，与贴壁细胞组相比，干细胞组干细胞相关标志物NANOG、SOX2和OCT4 mRNA表达显著升高(P < 0.05)；与贴壁细胞组相比，干细胞组铁死亡相关标志物SLC7A11的mRNA表达显著降低(P < 0.05)，ACSL4、GPX4、FTH1和COX2的mRNA表达显著升高(P < 0.05)；与贴壁细胞组相比，干细胞组差异基因CA9的mRNA表达显著降低，IDO1、IFNG、AQP5的mRNA表达显著升高(P < 0.05)。经上述生物信息学分析与实验验证，干细胞与肉瘤生存、铁死亡过程密切相关，CA9、IDO1、IFNG、AQP5在肉瘤干细胞中异常表达，可能成为肉瘤诊断标志物和治疗新靶点。

https://orcid.org/0009-0008-1353-3486 (魏婧娴)；https://orcid.org/0000-0002-7687-5917 (刘春霞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肉瘤, 干细胞, 干性指数, 铁死亡, 生存预后, 免疫浸润

Abstract: BACKGROUND: The stemness index may be associated with the prognosis and immune infiltration of sarcoma, but the specific regulatory mechanism and characteristic genes have yet to be fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the correlation between stem cells and prognosis as well as immune infiltration in sarcoma employing the gene stemness index model and to identify the ferroptosis signature genes associated with sarcoma stem cells.
METHODS: The sarcoma RNA sequencing data and related clinical information were obtained from the Cancer Genome Atlas (TCGA). The sarcoma RNA sequencing data were grouped using the sarcoma stemness index. Survival data were used to analyze prognosis between groups. Differentially expressed genes were obtained for pathway enrichment and immune infiltration analysis. Ferroptosis-related differential genes were used to construct a protein interaction network and analyze prognostic correlation. Rhabdomyosarcoma cell lines were cultured and divided into adherent cell group and stem cell group. The adherent cell group received no intervention, while the stem cell group was treated with serum-free culture to enrich stem cells in rhabdomyosarcoma cells. qRT-PCR was used to evaluate stemness markers, ferroptosis-related genes, and mRNA expression of ferroptosis-related markers in the cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Patients were divided into high and low stemness index groups based on the median stemness index. The progression-free survival of patients in the high stemness index group was lower than that in the low stemness index group by disease risk prediction, suggesting poor prognosis. (2) According to GO and KEGG analysis, the groups with high and low stemness indices differed from one another. There were differences in immune infiltration between the high and low stemness index groups. Nine of the 23 ferroptosis-related genes in the differential genes have the potential to establish a highly correlated network of protein interactions. Patients with high expression of IDO1, IFNG, and AQP5 have a better prognosis, while those with high expression of CA9 have a poor prognosis. (3) The qRT-PCR results demonstrated a significant upregulation of stem cell-related markers NANOG, SOX2, and OCT4 mRNA expressions in the stem cell group compared to the adherent cell group (P < 0.05). Compared to the adherent cell group, the stem cell group exhibited decreased mRNA expression level of ferroptosis-related marker SLC7A11 (P < 0.05) while showing increased levels of ACSL4, GPX4, FTH1, and COX2 (P < 0.05). Compared to the adherent cell group, the stem cell group displayed decreased mRNA expression level of differentially expressed gene CA9 alongside elevated levels of IDO1, IFNG, and AQP5 (P < 0.05). Stem cells were strongly associated with sarcoma survival and ferroptosis by bioinformatics analysis and experimental verification. Sarcoma stem cells have aberrant expression of CA9, IDO1, IFNG, and AQP5, which may serve as new targets for sarcoma therapy as well as diagnostic indicators.

Key words: ">sarcoma, stem cell, stemness index, ferroptosis, survival prognosis, immune infiltration

中图分类号:

魏婧娴, 孟莲, 孙皓, 张田田, 刘春霞. 基于干性指数模型对肉瘤预后、免疫浸润和铁死亡调控的分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4151-4160.

Wei Jingxian, Meng Lian, Sun Hao, Zhang Tiantian, Liu Chunxia. Analysis of regulation of prognosis, immune infiltration, and ferroptosis in sarcoma based on stemness index model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4151-4160.

图/表（结果） 5

2.1 肉瘤中mRNAsi高低组间生存差异分析与差异基因的获取 从TCGA数据库选取259例肉瘤患者信息与临床数据，结合mRNAsi与患者临床信息绘制指数分布图，见图1A。生存分析显示，高mRNAsi组与低mRNAsi组间无进展生存期存在统计学差异(P=0.024 3)，见图1B，但总生存期无统计学差异(P=0.409 6)，见图1C。说明可能存在一些肉瘤差异基因影响肿瘤干细胞，进而影响患者疾病进展。进一步对mRNAsi进行受试者工作特征曲线分析得到1，3，5年曲线下面积分别为0.604，0.623，0.578，见图1D，证明mRNAsi对预后评估有一定准确性，具有潜在的诊断价值，但需要进一步分类分析相关差异基因的功能和通路以及对预后的影响。通过R “DESeq”包对高、低mRNAsi组间差异表达基因进行筛选，以P < 0.05且|log2FC|≥1为标准，共筛选出1 537个差异表达基因，其中737个上调基因，800个下调基因，见图1E。

2.2 高、低mRNAsi组间差异基因的功能注释和通路分析 采用GO和KEGG分别对高、低mRNAsi组间差异基因进行功能注释和通路分析，结果表明不同干性评分的队列在富集方向上有所区别。GO富集分析表明上调基因在中性粒细胞趋化性、有丝分裂、染色体结合及细胞干性上富集，与细胞干性相关的过程包括核裂变、有丝分裂核分裂以及细胞器裂变，见图2A。KEGG通路分析表明上调基因参与细胞周期、T细胞受体信号通路、p53信号通路、趋化因子受体结合、细胞因子活性等，见图2B。
GO分析表明下调基因主要富集在感觉器官形态发生、结缔组织发育、细胞外基质组织、受体配体活性、跨膜转运复合物等过程，见图2C；KEGG通路分析表明下调基因主要参与神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、糖酵解、Wnt信号通路和PI3K-Akt信号通路，见图2D。

2.3 高、低mRNAsi组免疫浸润特征分析 通过CIBERSORT算法分析高、低mRNAsi样本中免疫浸润特征，绘制高、低mRNAsi组免疫细胞组成及免疫细胞之间关系图，见图3A，B。免疫细胞浸润分析显示，mRNAsi与活化的CD4+ T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆B细胞、初始B细胞、静息肥大细胞相关(P < 0.05)，且高mRNAsi组与初始B细胞的表达负相关，低mRNAsi
组与CD4 T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞呈正相关，见图3C，D。这提示mRNAsi不同的肉瘤细胞可能具有不同的免疫微环境，通过调节不同免疫细胞参与肉瘤的进展。mRNAsi可能成为潜在的诊断肉瘤的生物标志物。

2.4 高、低mRNAsi组间差异基因与铁死亡相关性分析 将在线数据库FerrDb下载的铁死亡相关基因与高、低mRNAsi组间差异基因取交集，见图4A，得到肉瘤组织中铁死亡相关差异表达基因23个(8个上调基因，15个下调基因)，并绘制热图，见图4B。
利用STRING在线工具分析铁死亡相关差异表达基因间的蛋白质互作关系，将结果导入Cytoscape软件进行可视化处理，使用CytoHubba插件分析铁死亡相关差异表达基因相互作用网络中的每个基因节点的相互作用程度，筛选出由EGRI、IDO1、AQP5、CA9、MDM2、EZH2、TERT、CDH1、NOS2、IFNG构成的蛋白互作网络，其中EZH2和CDH1的相关性最高，见图5A。
在筛选出的9个铁死亡相关基因中使用Kaplan-Meier Plotter数据库寻找肉瘤患者生存相关的基因，以既影响总生存期又影响无进展生存期为筛选标准。结果显示， IDO1(HR=0.47，P=0.000 14)、IFNG(HR=0.54，P=0.003)、AQP5(HR=0.54，P=0.012)在肉瘤组织中低表达，与高表达组相比预后更差；CA9(HR=1.95，P=0.013)在肉瘤组织中高表达，与低表达组相比预后更差，见图5B。

2.5 铁死亡相关肉瘤干性关键基因的表达验证 qRT-PCR实验结果表明，干细胞组的干性基因NANOG、SOX2和OCT4的mRNA表达量均显著高于贴壁细胞组(P < 0.05)，表明培养出富集干细胞的微球体细胞。随后验证铁死亡特征基因，与RD贴壁细胞组相比，RD干细胞组SLC7A11 mRNA表达水平降低，GPX4 mRNA表达水平升高(P < 0.05)，在RH30细胞系无统计学意义；RD、RH30干细胞组ACSL4、FTH1、COX2 mRNA表达量均较贴壁细胞组显著升高(P < 0.05)。最后验证筛选出的4个铁死亡相关基因，在RD和RH30细胞系中，与贴壁细胞组相比，铁死亡相关基因CA9在干细胞组中低表达，IDO1、IFNG、AQP5在干细胞组中高表达(P < 0.05)，见图6。

参考文献

[1] DANCSOK AR, ASLEH-ABURAYA K, NIELSEN TO. Advances in sarcoma diagnostics and treatment. Oncotarget. 2017;8(4):7068-7093.
[2] GRÜNEWALD TG, ALONSO M, AVNET S, et al. Sarcoma treatment in the era of molecular medicine. EMBO Mol Med. 2020; 12(11):e11131.
[3] DOS SANTOS RP, ROESLER R, GREGIANIN L, et al. Cancer Stem Cells and Chemoresistance in Ewing Sarcoma. Curr Stem Cell Res Ther. 2023;18(7):926-936.
[4] REYA T, MORRISON SJ, CLARKE MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001;414(6859):105-111.
[5] ANDRIQUE C, MORARDET L, LINARES LK, et al. Calpain-6 controls the fate of sarcoma stem cells by promoting autophagy and preventing senescence. JCI Insight. 2018;3(17):e121225.
[6] MALTA TM, SOKOLOV A, GENTLES AJ, et al. Machine Learning Identifies Stemness Features Associated with Oncogenic Dedifferentiation. Cell. 2018;173(2): 338-354.e15.
[7] STOCKWELL BR, FRIEDMANN ANGELI JP, BAYIR H, et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 2017;171(2): 273-285.
[8] WANG Y, ZHAO G, CONDELLO S, et al. Frizzled-7 Identifies Platinum-Tolerant Ovarian Cancer Cells Susceptible to Ferroptosis. Cancer Res. 2021;81(2):384-399.
[9] NI H, QIN H, SUN C, et al. MiR-375 reduces the stemness of gastric cancer cells through triggering ferroptosis. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):325.
[10] ZHANG H, WANG M, HE Y, et al. Chemotoxicity-induced exosomal lncFERO regulates ferroptosis and stemness in gastric cancer stem cells. Cell Death Dis. 2021;12(12):1116.
[11] WANG Z, OUYANG L, LIU N, et al. The DUBA-SLC7A11-c-Myc axis is critical for stemness and ferroptosis. Oncogene. 2023; 42(36):2688-2700.
[12] SIEGEL RL, MILLER KD, JEMAL A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018; 68(1):7-30.
[13] PANAGI M, PILAVAKI P, CONSTANTINIDOU A, et al. Immunotherapy in soft tissue and bone sarcoma: unraveling the barriers to effectiveness. Theranostics. 2022;12(14): 6106-6129.
[14] ZHENG H, SONG K, FU Y, et al. An absolute human stemness index associated with oncogenic dedifferentiation. Brief Bioinform. 2021;22(2):2151-2160.
[15] GU HY, QU WQ, PENG HH, et al. Stemness Subtypes and Scoring System Predict Prognosis and Efficacy of Immunotherapy in Soft Tissue Sarcoma. Front Immunol. 2022;13:796606.
[16] COSIALLS E, EL HAGE R, DOS SANTOS L, et al. Ferroptosis: Cancer Stem Cells Rely on Iron until “to Die for” It. Cells. 2021;10(11):2981.
[17] CHEN X, ZHANG T, SU W, et al. Mutant p53 in cancer: from molecular mechanism to therapeutic modulation. Cell Death Dis. 2022;13(11):974.
[18] TANG D, CHEN X, KANG R, et al. Ferroptosis: molecular mechanisms and health implications. Cell Res. 2021;31(2):107-125.
[19] JIANG X, STOCKWELL BR, CONRAD M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021; 22(4):266-282.
[20] CHEN X, KANG R, KROEMER G, et al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18(5):280-296.
[21] SUN Y, CHEN P, ZHAI B, et al. The emerging role of ferroptosis in inflammation. Biomed Pharmacother. 2020;127:110108.
[22] YANG F, XIAO Y, DING JH, et al. Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy. Cell Metab. 2023;35(1):84-100.e8.
[23] CHEONG JE, SUN L. Targeting the IDO1/TDO2-KYN-AhR Pathway for Cancer Immunotherapy - Challenges and Opportunities. Trends Pharmacol Sci. 2018; 39(3):307-325.
[24] ZHAI L, LADOMERSKY E, LENZEN A, et al. IDO1 in cancer: a Gemini of immune checkpoints. Cell Mol Immunol. 2018;15(5): 447-457.
[25] SHI D, WU X, JIAN Y, et al. USP14 promotes tryptophan metabolism and immune suppression by stabilizing IDO1 in colorectal cancer. Nat Commun. 2022;13(1):5644.
[26] CHIN YC, YANG LX, HSU FT, et al. Iron oxide@chlorophyll clustered nanoparticles eliminate bladder cancer by photodynamic immunotherapy-initiated ferroptosis and immunostimulation. J Nanobiotechnology. 2022;20(1):373.
[27] CHEN S, CRABILL GA, PRITCHARD TS, et al. Mechanisms regulating PD-L1 expression on tumor and immune cells. J Immunother Cancer. 2019;7(1):305.
[28] DYKEMA AG, ZHANG J, CHEUNG LS, et al. Lung tumor-infiltrating Treg have divergent transcriptional profiles and function linked to checkpoint blockade response. Sci Immunol. 2023;8(87):eadg1487.
[29] BENCI JL, JOHNSON LR, CHOA R, et al. Opposing Functions of Interferon Coordinate Adaptive and Innate Immune Responses to Cancer Immune Checkpoint Blockade. Cell. 2019;178(4):933-948.e14.
[30] LI Z, JIANG L, CHEW SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant mesothelioma under hypoxia. Redox Biol. 2019;26:101297.
[31] TATARI N, ZHANG X, CHAFE SC, et al. Dual Antigen T Cell Engagers Targeting CA9 as an Effective Immunotherapeutic Modality for Targeting CA9 in Solid Tumors. Front Immunol. 2022;13:905768.
[32] ZHAO R, HE B, BIE Q, et al. AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):322.

引言

肉瘤是一类来源于软组织和骨的异质性较强的恶性肿瘤，占儿童和青少年癌症相关死亡病例的19%-21%[1]。肉瘤可发生于全身各个部位，其病理学特征繁复多样，且存在多种亚型，当出现复发和转移时，患者的治疗效果往往欠佳[2]。研究表明，肿瘤干细胞是导致肉瘤发生、转移和多重耐药的主要原因[3]。与癌细胞相比，肿瘤干细胞具有更强的自我更新和增殖能力[4]，目前认为肿瘤干细胞促进了肉瘤的发生，但仍缺乏可供靶向治疗的特异性标志物，肉瘤的治疗仍面临挑战[5]。2018年，MALTA等[6]为了更好地描述肿瘤干细胞基因的特点，根据肿瘤干细胞的去分化特征，从PCBC、TCGA数据库中获得胚胎干细胞和肿瘤细胞的基因表达数据，使用单分类线性回归算法(one class linear regression，OCLR)提出了一个新的评分指标——mRNA干性指数(mRNA stemness index，mRNAsi)。mRNAsi已被用于对乳腺癌和神经胶质瘤的分子分型进行评分分析，然而在肉瘤中mRNAsi尚未有相关研究。
目前铁死亡在肿瘤干细胞中的作用成为研究热点，铁死亡作为一种依赖于铁离子并受细胞内外信号严格调控的新型细胞死亡方式，其特征为铁依赖性的过量脂质过氧化物累积[7]。近年来，研究发现铁死亡参与肿瘤耐药、免疫微环境浸润和癌症干性维持等过程[8]。研究发现miR-375通过触发溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)依赖的铁死亡可在体内外降低胃癌干细胞的干性[9]。此外，硬脂酰辅酶去饱和酶(stearyl coenzyme A desaturated enzyme，SCD1)的高表达能抑制胃癌干细胞的铁死亡，促进胃癌进展，并且通过诱导胃癌细胞外泌体的分泌，增强癌细胞的干性及耐药性[10]。WANG等[11]发现肿瘤干细胞相较于肿瘤细胞对铁死亡诱导剂更敏感，SLC7A11的蛋白水平在诱导分化的细胞中明显上调，使用索拉非尼和c-Myc转录活性抑制剂联合可诱导肝癌细胞铁死亡及抑制其干性。因此，靶向诱导铁死亡为癌症治疗提供了新的研究方向。但是关于肉瘤干细胞与铁死亡之间关系的研究较少，铁死亡在肉瘤干细胞中的作用机制还有待研究。
该研究旨在通过生物信息学手段，分析mRNAsi在肉瘤中的潜在作用，进而构建与铁死亡相关的干性基因分子调控网络，为肉瘤中铁死亡机制的研究提供新的见解，为肉瘤的诊断、治疗和预后提供新的思路和免疫治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 mRNAsi预测模型的构建；功能注释和通路富集分析；免疫浸润分析；铁死亡关键基因调控网络的构建；生存分析；qRT-PCR实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年6-9月在石河子大学医学院病理学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 数据资料 从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库下载259个肉瘤样本的RNA测序(RNA Sequencing，RNA-Seq)表达数据，以及相应患者的临床信息，从祖细胞生物学协会(Progenitor Cell Biology Consortium，PCBC)数据库下载人类干细胞RNA-seq数据。
1.3.2 实验细胞系 胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞系、腺泡状横纹肌肉瘤RH30细胞系均为课题组保存提供，用无血清培养法培养富含横纹肌肉瘤干细胞的微球体。
1.3.3 主要试剂及仪器 DMEM培养基(C3103-0500，上海Vivacell公司)；胎牛血清(C04001-500，上海Vivacell公司)；B27(17504044，美国GIBCO公司)；Neurobasal™无血清培养基(21103049，美国GIBCO公司)；重组人表皮细胞生长因子(100-15，英国Peprotech公司)；重组人碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，英国Peprotech公司)；青链霉素混合液(BL505A，北京Biosharp公司)；细胞培养箱(美国 Thermo Scientific公司)；荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
1.4 方法
1.4.1 mRNAsi的获取 使用R“synGet”包获取PCBC数据库中干细胞类群及其分化的外胚层、中胚层和内胚层祖细胞信息作为初始数据集，通过基因注释后获取干细胞和祖细胞的基因表达值，采用OCLR算法计算每个基因的权重，对数据进行均值中心化，将样本分为干细胞组和非干细胞组，使用“gelnet”包的gelnet函数构建模型，该函数主要传入4个参数：行为样本，列为基因；使用单类模型；正则化惩罚系数范围设置为0-1，得到每个基因的权重，运用R软件对TCGA每个样本的RNA-Seq数据转换基因名称，mRNA原始表达数据由Counts转化为FPKM，提取交叠基因的表达谱及权重，随后根据基因计算权重模型与表达值之间的相关性来衡量样本的指数，将干性指数映射到0-1范围，并封装成函数保存，得到肉瘤患者mRNAsi。与临床信息结合起来进行下一步分析。
1.4.2 生存分析及差异表达基因的筛选 以mRNAsi中位数为界将259例患者分成高mRNAsi组和低mRNAsi组，分析高、低mRNAsi与生存预后的关系，绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线。运用R“DESeq”包对差异表达基因进行筛选。选择符合统计学差异P < 0.05且|log2FC|≥1的差异表达基因并绘制火山图。
1.4.3 基于不同mRNAsi亚型间的功能注释和通路富集分析 使用R“clusterProfiler”包进行基因本体(gene ontology，GO)功能注释及京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，进一步探究mRNAsi相关基因的生物学功能并可视化，P < 0.05为差异有显著性意义。
1.4.4 基于不同mRNAsi亚型间的免疫分析 使用R“CIBERSORT”包，通过CIBERSORT算法进行分析，评估高、低mRNAsi组免疫细胞浸润情况，观察高、低mRNAsi组免疫细胞的差异表达情况，分析免疫浸润特征，P < 0.05为差异有显著性意义。
1.4.5 肉瘤干细胞相关基因与铁死亡基因分析 通过在线数据库FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb)获取铁死亡相关基因，将高、低mRNAsi组差异表达基因与铁死亡相关基因取交集，并做Venn图，得到肉瘤干细胞的铁死亡相关差异表达基因。
1.4.6 关键基因的共表达分析 利用STRING数据库(https://string-db.org/)分析铁死亡相关差异表达基因之间的蛋白质-蛋白质相互作用。将数据导入Cytoscape3.9.1软件进行可视化分析，使用CytoHubba插件根据节点相关性构建铁死亡相关差异表达基因蛋白质-蛋白质相互作用网络。
1.4.7 生存分析 利用Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)评估蛋白网络中各基因与肉瘤患者预后之间的相关性，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
1.4.8 细胞培养 从液氮罐中取出课题组保存的人胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞系、人腺泡状横纹肌肉瘤RH30细胞系，在37 ℃水浴锅内迅速振荡一两分钟，待细胞溶液融化后迅速喷洒体积分数75%乙醇放入超净台内。将细胞溶液移至离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，加入1 mL完全培养基(DMEM完全培养基的配置：每900 mL DMEM基础培养基中加入100 mL胎牛血清和10 mL青链霉素混合液，三者比例为9∶1∶0.1)，然后移至含有3 mL完全培养基的培养瓶中，细胞混匀后放入培养箱内，次日观察细胞状态，显微镜下观察细胞融合度达80%-90%且形态良好无污染即可传代，弃培养基，用PBS轻轻漂洗两三次，洗掉失去活性的细胞和细胞残渣，吸尽残留液体弃之，加1 mL胰蛋白酶消化1 min，观察细胞处于悬浮状态后，加入完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶身，使贴壁细胞吹下后制成细胞悬液，移入离心管，800 r/min离心5 min，收集细胞。
1.4.9 微球体细胞培养 在第20-30代横纹肌肉瘤细胞中加入无血清培养基(49 mL Neurobasal™培养基中加入1 mL B27、10 μL 20 ng/mL 表皮细胞生长因子、10 μL 20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和0.5 mL青链霉素配置形成50 mL无血清培养基)，重悬细胞，调整细胞浓度为2×105个/瓶，摇晃细胞均匀地平铺于低黏附培养瓶中，标记后置于培养箱中培养，每3 d换液1次，待微球体细胞生长10 d左右，吸出至离心管，800 r/min离心5 min，弃上清液，加1 mL胰蛋白酶消化3 min，加入完全培养基终止消化，制成细胞悬液，移入离心管，800 r/min离心5 min，收集细胞。

1.4.10 实时荧光定量qRT-PCR检测各组细胞特征基因和铁死亡相关蛋白mRNA表达 选取横纹肌肉瘤RD、RH30细胞系，用无血清培养法培养横纹肌肉瘤干细胞，采用TRLzol法提取总RNA。通过检测横纹肌肉瘤微球体细胞中干性标志物的表达，验证微球体细胞中存在干细胞富集。通过检测铁死亡相关标志物的表达量，验证干细胞中存在铁死亡发生，并且细胞干性影响铁死亡相关进程，最后验证筛选出干性相关铁死亡基因的准确性与可靠性。使用thermo scientific™ cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，反应条件为37 ℃，60 min，85 ℃，5 min。引物合成后，使用KANGWEI™ SYBR® Green qPCR mix试剂盒行PCR扩增，以GAPDH为内参，反应条件为变性：95 ℃，10 s；退火：60 ℃，20 s；延伸：72 ℃，15 s；进行40个循环。最后，采用2-ΔΔCt法计算相关mRNA表达量，通过Graphpad软件对数据进行统计分析。引物由上海生工生物科技有限公司构建，序列如表1所示。

1.5 主要观察指标 ①mRNAsi模型的构建；②不同mRNAsi组间生存差异分析；③通路富集分析；④免疫浸润分析；⑤铁死亡相关差异基因调控网络的构建；⑥铁死亡相关差异基因与预后相关性分析；⑦干性标志物、铁死亡相关标志物和潜在核心靶点相关基因在横纹肌肉瘤细胞及其干细胞中的表达。

1.6 统计学分析 采用R软件绘图并进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法(Log-rank检验)进行生存分析并绘制生存曲线图，P < 0.05为差异有显著性意义。两组间数据比较采用两样本 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。GraphPad Prism 8软件对组织相关mRNA表达水平进行作图分析。文章采用的统计学方法已通过石河子大学医学院统计学专家审核。

讨论

肉瘤是一种异质性强的间充质肿瘤，由100多种亚型组成，虽然肉瘤在成人中少见，但在儿童和青少年中相当普遍，肉瘤占儿童肿瘤病例的15%[12]。尽管目前有化疗联合手术治疗，但由于肉瘤易转移、肿瘤内异质性高，导致预后和生存率仍然较差[13]。在肿瘤内有一群细胞表现出多能胚胎干细胞特征，称为肿瘤干细胞，它们参与肿瘤的起始、增殖、复发、转移和耐药。ZHENG等[14]应用mRNAsi分析癌症和正常组织样本时，在mRNAsi评分上呈现显著差异，且发现较高mRNAsi与致癌性强、预后差以及细胞去分化有关。尽管肉瘤存在异质性，但在不同的肉瘤类型中，干性的一些分子机制可能非常相似，并且肉瘤发生相关的遗传和表观遗传变化深刻影响肉瘤干细胞的发生发展。
在该研究中，首先获得肉瘤患者的mRNAsi，以mRNAsi中位数为界将患者分成高mRNAsi组和低mRNAsi组，患病风险预测显示，与低mRNAsi组相比，高mRNAsi组的无进展生存期更短，提示高mRNAsi患者预后不佳，表明该模型对临床诊断具有一定参考意义。基于此结果，通过GO和KEGG分析揭示了高、低mRNAsi组间差异基因在细胞通路和细胞因子层面上发挥不同的功能，上调差异基因在中性粒细胞趋化性、有丝分裂、染色体结合及细胞干性上富集，上述过程大多与细胞周期通路有一定关联，细胞周期运行方式与干细胞的自我更新、多向分化潜能等特性和功能有关，参与T细胞受体信号通路、趋化因子受体结合等通路，提示肿瘤免疫可能影响肉瘤微环境；下调差异基因主要富集在感觉器官形态发生、结缔组织发育、细胞外基质组织、受体配体活性、跨膜转运复合物等过程，主要参与神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、糖酵解、Wnt信号通路和PI3K-Akt信号通路，这些结果提示肉瘤干细胞分化的方向受到能量代谢方式的影响。
GU等[15]研究团队基于免疫浸润特征与干细胞相关基因联合开发的评分系统预测免疫治疗肉瘤的预后和疗效。此评分系统在肉瘤的科研与诊治方面具有重要意义，但未能客观地反映免疫微环境与肉瘤干细胞的分子机制。该研究使用CIBERSORT算法分析高、低干性样本中免疫浸润特征，发现不同mRNAsi肉瘤患者具有不同的免疫微环境，并影响了肉瘤干细胞的进展，另一方面证实了mRNAsi亦可作为肿瘤微环境免疫原性高低的预测因素，高mRNAsi组在多种免疫细胞中呈高表达状态且预后不佳，表明机体可能处于炎症微环境中，这提示高mRNAsi患者联合使用免疫抑制剂可能会有更好的疗效。
研究发现铁代谢与最近发现的铁死亡相关基因在抗肿瘤干细胞治疗领域发挥重要作用[16-17]，铁死亡是由多种氧化还原活性酶异常表达而引发的一种铁依赖性的细胞死亡形式。铁死亡过程可在表观遗传、转录、转录后和翻译后等多个过程中受到调控[18]。此外，铁死亡还参与线粒体活性调节和氨基酸、脂质、糖代谢以及多种疾病发生发展过程。耐药癌细胞，特别是处于间充质状态且容易转移的癌细胞，非常容易受到铁死亡影响[19]。在肿瘤微环境中铁蛋白代谢失调引发与炎症相关的免疫抑制，从而有利于肿瘤生长[20]，已证明几种铁死亡抑制剂在急性肾损伤、神经退行性疾病(包括帕金森病、运动神经元疾病和阿尔茨海默病)、肺纤维化等实验模型中发挥抗炎作用[21]。临床报道铁死亡抑制剂和抗PD1联合治疗三阴性乳腺癌的疗效好于单药治疗[22]。然而铁死亡在肉瘤干细胞中的调控机制尚未明确，因此该研究试图将铁死亡与肉瘤干细胞联系起来，并预测肉瘤中可能影响干细胞铁死亡的分子靶点。将高、低mRNAsi组间差异表达基因与铁死亡相关基因联合分析后，获得铁死亡相关差异基因。经蛋白-蛋白互作和生存预后分析发现IDO1、IFNG、AQP5、CA9与肉瘤患者预后密切相关。
研究表明，IDO1通过色氨酸代谢与免疫抑制影响肿瘤微环境，有促癌作用[23-24]。SHI等[25]发现敲低蛋白酶体相关去平衡酶(ubiquitin specific peptidase 14，USP14)后，会降低IDO1的表达并逆转细胞毒性T细胞的抑制作用，使大肠癌细胞对抗PD-1治疗敏感，USP14有望成为大肠癌新的治疗靶点和直接抑制IDO1的替代免疫治疗方法。由于逃逸免疫监视导致单药治疗疗效不佳，CHIN等[26]团队开发了一种由铁和叶绿素光敏剂组装的纳米粒子，可以通过诱导减弱铁介导的脂质过氧化，通过减少PD-L1、转化生长因子β和M2样巨噬细胞，诱导杀伤膀胱癌细胞，联合治疗后肿瘤微环境从免疫抑制重编程为免疫刺激，诱导细胞毒性、铁死亡以提高治疗效果。IFNG是干扰素家族的一员，干扰素家族是抑制性受体细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4和PD1的免疫检查点阻断的常见生物标志物，IFNG可增强免疫功能，通过PD-L1促进T细胞衰竭。IFNG在黑色素瘤和肺癌患者体内会影响免疫检查点的阻断，对肿瘤有抑制作用[27-28]，BENCI等[29]研究团队发现CD8 T 细胞释放的IFNG下调了谷氨酸-胱氨酸逆向转运蛋白系统中2个亚基的表达，抑制了肿瘤细胞的胱氨酸摄取，从而促进了肿瘤细胞脂质过氧化和铁死亡。在体内外模型中，IFNG通过结合免疫检查点阻断，协同增强T细胞介导的抗肿瘤免疫并诱导肿瘤细胞铁死亡。该研究中，IDO1、IFNG在高mRNAsi组上调，通过qRT-PCR实验验证其在横纹肌肉瘤干细胞中高表达，表明通过mRNAsi模型实验筛选肉瘤干细胞铁死亡特征基因具有一定的准确性和诊断价值，提示对于IDO1、IFNG高表达的肉瘤患者，铁死亡抑制剂和免疫治疗联合使用可能效果更好。
CA9是一种缺氧诱导的细胞表面酶，在维持干细胞存活和癌症耐药方面起重要作用[30]。TATARI等[31]团队证明CA9在患者衍生的脑瘤启动细胞中高度表达。肾透明细胞癌或胶质母细胞瘤中靶向CA9和T细胞的联合治疗导致T细胞活化，使得促炎因子的释放增加，并以CA9依赖性方式增强细胞毒性。该研究显示CA9在高mRNAsi组上调，高表达CA9患者预后差，在横纹肌肉瘤中干性增强而CA9的表达降低，提示在横纹肌肉瘤中CA9可能通过其他方式调控肿瘤发生发展。AQP5是水通道蛋白家族的一员，ZHAO等[32]团队发现其在胃癌干细胞中特异性高表达，与富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，LGR5)共表达，LGR5是各种癌症干细胞的生物标志物，研究表明LGR5过表达肠道干细胞通过激活WNT通路增强异种移植物的生长，该研究中低mRNAsi组AQP5表达高于高mRNAsi组，且AQP5表达升高，患者的生存率更高，但在横纹肌肉瘤干细胞中检测到AQP5高表达，提示在横纹肌肉瘤中AQP5可能通过干细胞调控肿瘤发生发展，对于转移性强的患者，针对AQP5研制相关靶向治疗药物或许更能受益，也展现了肉瘤队列间存在较强异质性，应对肉瘤的诊断与治疗开展进一步个性化诊疗。
该实验检测无血清干性条件处理后横纹肌肉瘤细胞系中SLC7A11、ACSL4、GPX4、FTH1、COX2铁死亡相关分子的表达，与贴壁细胞组相比，干细胞组SLC7A11 mRNA的表达降低，表明了干细胞发生了脂质过氧化，ACSL4、FTH1、COX2 mRNA表达升高，表明了干细胞通过触发磷脂过氧化促进铁死亡发生。对于转移性强、常规治疗效果不佳的患者，联合使用铁死亡抑制剂，通过靶向ACSL4、FTH1、COX2来诱导铁死亡，有望成为诱导癌症细胞死亡达到治疗癌症的策略。与贴壁细胞组相比，干细胞组FTH1、COX2、ACSL4 mRNA表达升高，AQP5 mRNA 表达也升高，提示干细胞可能通过铁失调和氧化应激调控AQP5，促进铁死亡发生。然而上述分子如何通过铁死亡过程继而参与肿瘤免疫微环境调控来发挥治疗作用有待进一步探讨，通过深入研究铁死亡相关的机制，可为诊断和治疗肉瘤提供新思路。
综上所述，该研究通过生物信息学方法对肉瘤干细胞的调控网络进行分析，为研究肉瘤干细胞在肉瘤发生发展中的作用提供新思路，为后续的实验研究提供参考，并筛选出4个铁死亡基因，对早期诊断和个体化治疗具有一定的借鉴意义。当然该研究还存在一定的不足，首先TCGA数据库中肉瘤样本相应的临床资料信息因缺乏肿瘤类型、病理分期等数据，未能进行进一步分类分析；其次根据生存时间分组后，可以采用统计学方法联合治疗及免疫治疗等将此模型应用于更大数据量的样本进行进一步分析；此外，进行进一步基础实验和临床研究，以明确关键基因如何参与肿瘤干细胞中铁死亡介导的病理过程。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

基于干性指数模型对肉瘤预后、免疫浸润和铁死亡调控的分析

Analysis of regulation of prognosis, immune infiltration, and ferroptosis in sarcoma based on stemness index model

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[1]	袁维勃, 刘婵, 余丽梅. 肝脏类器官在肝脏疾病模型与移植治疗中的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1684-1692.
[2]	喻婷, 吕冬梅, 邓浩, 孙涛, 程钎. 淫羊藿苷预处理增强人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1328-1335.
[3]	杨治航, 孙祖延, 黄文良, 万喻, 陈仕达, 邓江. 神经生长因子促进兔骨髓间充质干细胞软骨分化并抑制肥大分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1336-1342.
[4]	胡涛涛, 刘兵, 陈诚, 殷宗银, 阚道洪, 倪杰, 叶凌霄, 郑祥兵, 严敏, 邹勇. 过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1343-1349.
[5]	金凯, 唐婷, 李美乐, 谢裕安. 人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1350-1355.
[6]	李帝均, 酒精卫, 刘海峰, 闫磊, 李松岩, 王斌. 明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1356-1362.
[7]	娄国, 张敏, 付常喜. 8周运动预适应增强脂肪干细胞治疗心肌梗死大鼠的效果[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1363-1370.
[8]	刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.
[9]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[10]	赵楠楠, 李彦杰, 秦合伟, 朱博超, 丁慧敏, 徐振华. 通脉开窍丸治疗血管性痴呆模型大鼠海马区神经元的铁死亡变化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1401-1407.
[11]	章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.
[12]	张昊军, 李泓毅, 张辉, 陈浩然, 张力中, 耿杰, 侯传东, 于琦, 贺培凤, 贾金鹏, 卢学春. 间充质细胞源性骨肉瘤中关键分子标志物鉴定及药物敏感性分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1448-1456.
[13]	王咪, 马书杰, 刘杨, 齐瑞. 缺血性脑卒中铁死亡特征基因NFE2L2的鉴定与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1466-1474.
[14]	谢刘刚, 崔书克, 郭楠楠, 李遨宇, 张菁瑞. 干细胞治疗阿尔茨海默病的研究热点与前沿[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1475-1485.
[15]	李佳林, 张耀东, 娄艳茹, 于洋, 杨蕊. 间充质干细胞分泌组发挥作用的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1512-1522.