理筋手法减轻兔损伤骨骼肌纤维化的作用机制

doi:10.12307/2025.625

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (14): 2914-2921.doi: 10.12307/2025.625

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

理筋手法减轻兔损伤骨骼肌纤维化的作用机制

李开颖1，2，3，魏晓歌1，赵振宁1，2，3，宋斐1，杨楠1，王燕1，穆静1，马惠昇1，2，3

1宁夏医科大学中医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医科大学宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏区域高发病中西医结合防治研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2024-06-03 接受日期:2024-07-27 出版日期:2025-05-18 发布日期:2024-09-28
通讯作者: 马惠昇，博士，教授，博士研究生导师，宁夏医科大学中医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏区域高发病中西医结合防治研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004 共同通讯作者：穆静，博士，副教授，宁夏医科大学中医学院，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:李开颖，女，宁夏医科大学中医学院在读硕士，主治医师，主要从事筋伤疾病基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82160944)，项目负责人：马惠昇

Lijin manipulation alleviates fibrosis of injured skeletal muscle in rabbits

Li Kaiying1, 2, 3, Wei Xiaoge1, Zhao Zhenning1, 2, 3, Song Fei1, Yang Nan1, Wang Yan1, Mu Jing1, Ma Huisheng1, 2, 3

1School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2024-06-03 Accepted:2024-07-27 Online:2025-05-18 Published:2024-09-28
Contact: Li Kaiying, Master candidate, Attending physician, School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Huisheng, MD, Professor, Doctoral supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Co-corresponding author: Mu Jing, MD, Associate professor, School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160944 (to MHS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
理筋手法：是以筋伤理论为依据，对筋伤部位进行针对性理筋推拿手法操作，达到舒筋活络、理筋止痛的目的。
骨骼肌损伤：多由剧烈运动所引起，临床表现为肌肉肿胀、疼痛、紧张、痉挛、僵硬、硬结，甚至会出现皮下淤青、按压时疼痛明显加重、损伤肌肉活动受限、拉伸时疼痛加剧等症状。骨骼肌损伤属于软组织损伤，中医称之为“筋伤”。

背景：理筋手法能够减少纤维化瘢痕增生，促进骨骼肌修复。但不恰当的激活Wnt/β-catenin信号通路，能加剧损伤骨骼肌纤维化，对骨骼肌修复过程产生不利影响。开展理筋手法对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用研究，有利于阐述理筋手法减少纤维化瘢痕增生、促进骨骼肌损伤修复的相关机制。
目的：探讨理筋手法促进兔骨骼肌损伤修复的作用机制。
方法：45只普通级健康成年日本大耳兔随机分为空白组、模型组和理筋组，每组15只。模型组和理筋组均进行腓肠肌打击造模，理筋组于造模后第3天开始进行理筋手法治疗，1次/d，15 min/次。各组在造模后第7，14，21天分别取5只进行取材。苏木精-伊红染色观察腓肠肌一般形态结构，Masson染色观察腓肠肌胶原纤维含量，Western blot检测腓肠肌Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达，RT-PCR检测腓肠肌Wnt3a、β-catenin、TCF mRNA表达，免疫荧光法检测腓肠肌β-catenin的表达，免疫组化法检测腓肠肌Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达。
结果与结论：①苏木精-伊红染色及Masson染色结果显示：与模型组比较，理筋组各观察点炎性细胞浸润减少，胶原纤维量减少(P < 0.001)，肌纤维逐渐愈合；②Western blot结果显示：与模型组比较，理筋组各观察点Wnt3a、β-catenin、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达量均显著降低(P < 0.05)，而p-GSK3β/GSK3β比值较模型组则明显升高(P < 0.05)；③RT-PCR结果显示：与模型组比较，理筋组各观察点Wnt3a、β-catenin、TCF的mRNA表达量均显著降低(P < 0.001)；④免疫荧光结果显示：与模型组比较，理筋组各观察点β-catenin核表达荧光强度明显降低，且逐渐与空白组相近(P < 0.001)；⑤免疫组化结果显示：理筋组各观察点Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达量相较于模型组均显著降低(P < 0.01)。结果表明：理筋手法能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，减少纤维化瘢痕增生，从而达到促进损伤骨骼肌修复的目的。
https://orcid.org/0009-0005-6835-562X(李开颖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 理筋手法, 筋伤, 骨骼肌损伤, 腓肠肌, 纤维化, 瘢痕, 修复, Wnt/β-catenin信号通路

Abstract: BACKGROUND: Lijin manipulation can reduce fibrosis scar hyperplasia and promote skeletal muscle repair. However, improper activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway can aggravate the fibrosis of injured skeletal muscle and adversely affect the repair process of skeletal muscle. To study the regulatory effect of Lijin manipulation on the Wnt/β-catenin signaling pathway is conducive to elucidate the related mechanisms of Lijin manipulation in reducing fibrosis scar hyperplasia and promoting skeletal muscle injury repair.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Lijin manipulation in promoting the repair of skeletal muscle injury in rabbits.
METHODS: Forty-five healthy adult Japanese white rabbits were randomly divided into blank group, model group and Lijin group with 15 rabbits in each group. Gastrocnemius muscle percussion modeling was performed in both model group and Lijin group. Lijin manipulation was performed in the Lijin group on the 3rd day after modeling, once a day, 15 minutes once. Five animals in each group were selected and killed on the 7th, 14th and 21st days after modeling. The general morphological structure of gastrocnemius was observed by hematoxylin-eosin staining and the content of collagen fiber was observed by Masson staining. Western blot was used to detect the protein expression of Wnt3a, β-catenin, GSK3β, p-GSK3β, TCF, type I collagen and type III collagen in gastrocnemius muscle, and RT-PCR was used to detect the mRNA expression of Wnt3a, β-catenin and TCF. The expression of β-catenin was detected by immunofluorescence, and the expression of type I collagen and type III collagen was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of hematoxylin-eosin staining and Masson staining showed that compared with the model group, inflammatory cell infiltration and collagen fiber amount decreased in the Lijin group (P < 0.001), and muscle fibers gradually healed. Western blot results showed that compared with the model group, the protein expression levels of Wnt3a, β-catenin, TCF, type I collagen and type III collagen were significantly decreased in the Lijin group at all observation time points (P < 0.05), while the ratio of P-GSK3β/GSK3β was significantly increased in the Lijin group at all observation time points compared with the model group (P < 0.05). RT-PCR results showed that compared with the model group, the mRNA expression levels of Wnt3a, β-catenin and TCF were significantly decreased in the Lijin group at all observation time points (P < 0.001). Immunofluorescence results showed that compared with the model group, the fluorescence intensity of β-catenin expression in the Lijin group was significantly decreased at each observation time point and gradually became similar to that in the blank group (P < 0.001). Immunohistochemical results showed that the expression levels of type I collagen and type III collagen in the Lijin group were significantly lower than those in the model group (P < 0.01). To conclude, Lijin manipulation could inhibit the abnormal activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway, reduce fibrotic scar hyperplasia, and promote the repair of injured skeletal muscle.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Lijin manipulation, injury of muscle and tendon, musculoskeletal injuries, gastrocnemius muscle, fibrosis, scar, repair, Wnt/β-catenin signaling pathway

中图分类号:

李开颖, 魏晓歌, 赵振宁, 宋斐, 杨楠, 王燕, 穆静, 马惠昇 . 理筋手法减轻兔损伤骨骼肌纤维化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(14): 2914-2921.

Li Kaiying , Wei Xiaoge, Zhao Zhenning , Song Fei, Yang Nan, Wang Yan, Mu Jing, Ma Huisheng . Lijin manipulation alleviates fibrosis of injured skeletal muscle in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(14): 2914-2921.

图/表（结果） 9

2.1 各组兔腓肠肌形态学改变如图1所示，空白组腓肠肌组织结构完整，肌细胞排列整齐，无炎性细胞浸润及出血。造模后第7天，模型组肌组织损伤严重，肌纤维排列紊乱，大量肌细胞坏死，组织间隙可见较多红细胞及大量炎性细胞浸润；理筋组较模型组损伤减轻，肌细胞数量增多，轻度炎性细胞浸润。造模后第14天，模型组可见新生肌纤维融合，炎性细胞浸润减轻；理筋组肌组织损伤较轻，少量炎性细胞浸润。造模后第21天，模型组肌组织仍有轻微损伤，肌细胞排列略整齐，仍存在少量炎性细胞浸润；理筋组肌组织已基本愈合，肌细胞排列整齐，组织间隙未见明显炎性细胞浸润。

2.2 各组兔腓肠肌胶原纤维变化如图2，3所示，空白组腓肠肌组织间隙均未见明显胶原纤维；造模后第7天，模型组肌组织间隙出现大量胶原纤维，理筋组较模型组有明显好转(P < 0.001)；第14天时，模型组肌间隙仍有较多胶原纤维，而理筋组已有很大程度改善(P < 0.001)；第21天时，模型组肌间隙仍有部分胶原纤维沉积，而理筋组仅剩少量胶原纤维(P < 0.001)，肌组织基本愈合。

2.3 各组兔腓肠肌Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达比较如图4所示，与空白组比较，模型组造模后第7天时Wnt3a、β-catenin、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达量显著升高，随后逐渐降低(P<0.001)；而p-GSK3β/

GSK3β蛋白表达量比值显著降低，随后逐渐升高(P < 0.001)。与模型组比较，理筋组各观察点Wnt3a、β-catenin、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达量均显著降低(P < 0.001)，且逐渐与空白组相近；p-GSK3β/GSK3β蛋白表达量比值显著升高(P < 0.05)。
2.4 各组兔腓肠肌Wnt3a、β-catenin、TCF的mRNA表达比较如图5所示，与空白组比较，模型组造模后第7天时Wnt3a、β-catenin、TCF mRNA表达量显著升高，随后逐渐降低(P < 0.001)；与模型组比较，理筋组各观察点Wnt3a、β-catenin、TCF mRNA表达量明显降低(P < 0.001)，且逐渐与空白组相近。

2.5 各组兔腓肠肌β-catenin在免疫荧光中的表达比较如图6，7所示，与空白组比较，模型组造模后第7天时β-catenin核表达荧光强度显著升高，随后逐渐降低(P < 0.001)；与模型组比较，理筋组各观察点β-catenin核表达荧光强度明显降低(P < 0.001)，且逐渐与空白组相近。

2.6 各组兔腓肠肌Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达如图8，9所示，与空白组相比，模型组造模后第7天时Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达量显著升高(P < 0.001)，随后有降低趋势(P < 0.001)；与模型组相比，理筋组各观察点Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达量显著降低(P < 0.001)。

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引言

骨骼肌损伤是运动中最常发生的损伤，发病率可达35%-55%[1]，主要临床表现为疼痛和运动功能障碍等[2]，是临床极为常见的一类疼痛性疾病[3]，属中医“筋伤”范畴。中医认为，“筋”是对人体骨骼肌、肌腱、关节囊、韧带等组织的高度概括[4]。《素问•长刺节论》云：“病在筋，筋挛节痛，不可以行。”筋伤可影响肢体的运动功能。《医宗金鉴》中提到：“凡跌打损伤坠堕之证，恶血留内，则不分何经，皆以肝为主血也，故败血凝滞。”说明了筋伤的主要病机是气血瘀滞。而《素问•举痛论篇》认为：“按之则气血散，故按之痛止。”不通则痛，手法能使气血散行，使疼痛消散。理筋手法是中医治疗筋伤的一种常用推拿手法，能够舒筋活络、理筋止痛，针对筋伤病灶有很好的临床疗效[5-6]。理筋手法治疗筋伤，主要是运用“以痛为输”的治疗原则，通过对病变的经筋进行松解，最终达到“筋松则顺、筋顺则动、筋动则通”的治疗目的[7]。
骨骼肌的损伤修复是一个复杂的过程[8]，且与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关。Wnt/β-catenin信号通路是机体调控骨骼肌功能的重要通路，它能通过影响胞质中信号转运分子β-catenin水平，进而影响靶基因的表达[9]，在骨骼肌损伤修复过程中发挥重要作用[10]。骨骼肌损伤修复过程中纤维化瘢痕增生严重影响其修复质量[11-12]，而过度地激活Wnt/β-catenin信号通路，能使胞质中的β-catenin得以累积并转运入核，与细胞因子TCF相结合，促进靶基因的表达[13]，最终加剧损伤骨骼肌纤维化，影响骨骼肌损伤后再生[14]。课题组前期研究发现，三步理筋法的“捋筋、揉筋、擦筋” 能够通过增强胰岛素样生长因子1等细胞因子表达水平来促进兔损伤骨骼肌的修复[15]，证明了理筋手法能通过抑制炎症、促进肌卫星细胞的增殖分化，继而减少纤维化瘢痕的形成，提高骨骼肌损伤的修复质量[16]。但其并未阐明理筋手法是否能通过调控Wnt/β-catenin信号通路，减少纤维化瘢痕增生，从而促进损伤骨骼肌的修复。为此，该研究通过建立兔腓肠肌急性损伤模型，以“捋筋、揉筋、擦筋”为干预手段，损伤后7，14，21 d为动态观察点，基于Wnt/β-catenin信号通路探索理筋手法减少纤维化瘢痕增生、促进损伤骨骼肌修复的机制，为临床治疗“筋伤”提供更多科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年10-12月在宁夏医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物和分组 6月龄普通级健康成年日本大耳兔45只，雌性各半，体质量(2.0±0.5) kg，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(宁)2020-0001，饲养于宁夏医科大学实验动物中心，保持室温为15-20 ℃，湿度为50%-60%，自由进食兔饲料和水。适应环境1周后，按随机数字表法随机分为空白组(n=15)和造模组(n=30)。其中空白组正常饲养，不做处理；造模组全部进行腓肠肌打击造模，造模后再次随机分为模型组(n=15)和理筋组(n=15)。模型组自然恢复，不予治疗；理筋组于造模后第3天开始进行理筋手法治疗，直至处死取材。
实验由宁夏医科大学实验动物伦理审查委员会批准(批准编号：IACUC-NYLAC-2021-124)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要仪器自制造模打击器，推拿手法参数测定仪(上海中医大尚新医学科技有限公司，型号：TPA-Ⅱ)，石蜡包埋机(Leica，型号：HistoCore Arcadia H)，切片机(Leica，型号：RM2255)，烘片机(Leica，型号：HI1220)，切片扫描仪(Leica，型号：Aperio LV1)，离心机(Sartorius，型号：A-14C)，电泳仪(北京六一公司，型号：DYCZ-24DN)，荧光定量PCR仪(BIO-RAD，型号：CFX ConnectTM)。
1.3.3 主要试剂苏木精-伊红染色液(北京博奥拓达科技有限公司，货号：Top0446)，Masson染色液(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1340)，DAPI染色液(博士德生物公司，货号：AR1177)，二甲苯、乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)，DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9018)，山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB2301、ZF0516、PV-6000)，Wnt3a、β-catenin、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)抗体(BIOSS，货号：BS-23278R、BS-1165R、BS-0023R)，p-GSK3β、TCF7、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、GAPDH抗体(Affinity，货号：AF2016、DF3168、AF7001、AF5457、AF7018)，Trizol(Invitrogen，货号：15596-026)，荧光定量PCR试剂盒(莫纳生物，货号：MQ00401S)。
1.4 实验方法
1.4.1 模型制备方法使用自制造模打击器，进行兔腓肠肌急性损伤造模。造模使用的打击锤2 kg，将兔俯卧位固定在解剖台上，左后肢褪毛，选定腓肠肌肌腹中段作为打击中心，打击锤自50 cm高处自由落体下落致一次打击伤，打击面积约5.5 cm2，动能为9.8 J，造成腓肠肌中重度急性损伤模型[15-16]。

1.4.2 模型评估造模后打击处大体可见红肿、瘀血，但无皮肤破损及骨折；苏木精-伊红染色显示肌纤维扭曲断裂，可见密集的红细胞并有炎性细胞浸润；Masson染色可见肌纤维间隙大量胶原纤维增生，肌纤维扭曲或有断裂情况；透射电镜下可见肌纤维排列紊乱，大量断裂，肌丝结构稀疏、松散，肌节呈对称性分布，明暗带结构

不清晰，线粒体(M)略肿胀，膜内基质变浅，Z线(Z)、H带(H)结构略模糊，较多断裂、错位。说明此次实验模型制作成功[16]。

1.4.3 理筋手法治疗依据筋伤理论，参考马惠昇的《回医理筋-肩部筋伤》，选用三步理筋法早期筋伤活血散筋的捋筋、揉筋、擦筋手法为治疗手法。作者在推拿手法参数测定仪上进行手法训练后，从造模后第3天开始对理筋组进行理筋手法治疗[16]。将兔固定在手法测定仪测力平台上，在兔小腿损伤腓肠肌处依次进行捋筋、揉筋、擦筋手法操作，理筋手法治疗1次/d，15 min/次，直至处死取材。
捋筋：以大拇指和示指指腹着力于跟键，向腘窝方向进行直线来回捋筋，力量2 kg，频率80次/min，持续5 min；揉筋：以拇指指腹着力于损伤部位，做连续不断的环旋揉动，力量2 kg，频率100次/min，持续5 min；擦筋：用示、中二指做跟腱与腘窝间的均匀往返摩擦操作，力量2 kg，频率80次/min，持续5 min。
1.4.4 取材各组分别在造模后第7，14，21天于麻醉状态下使用空气栓塞法随机处死5只兔，随后充分暴露并剥离左侧腓肠肌，取肌腹中段(约1 cm×1 cm×0.5 cm)，按需进行处理。
1.5 主要观察指标
1.5.1 苏木精-伊红染色法观察腓肠肌一般形态结构多聚甲醛固定液固定的腓肠肌组织经流水冲洗、脱水、石蜡包埋，使用切片机切3 μm厚石蜡切片，65 ℃烤片4 h，切片脱蜡至水，入苏木精染液染3 min，分化液分化10 s，返蓝液返蓝5 s，流水冲洗后，切片依次入体积分数85%，95%梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min；二甲苯透明，中性树胶封固；使用切片扫描仪(Leica，型号：Aperio LV1)采集图像。
1.5.2 Masson染色观察腓肠肌中胶原纤维含量切片经脱蜡、复水后，用Masson丽春红酸性品红染液染色10 min；以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化5 min，不经水洗，稍沥干再用苯胺蓝染液染1 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，二甲苯透明5 min，中性树胶封固；使用切片扫描仪(Leica，型号：Aperio LV1)采集图像，Image J软件对腓肠肌胶原纤维含量进行分析。
1.5.3 Western blot检测Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的蛋白表达量将0.1 g冰冻腓肠肌组织剪碎并加入1 000 μL裂解液和10 μL PMSF，研磨后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，经核酸蛋白定量仪进行蛋白定量。然后配制10%分离胶，快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置，立即用去离子水覆盖胶面，室温放置约40 min至分离胶凝固，配制5%浓缩胶，倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液，插入样品梳，室温放置约40 min后，轻轻拔去梳子。将蛋白样品轻轻加至凝胶孔中，接通电泳仪电源，将电压调至80 V。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。取下电泳板，小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗1次，将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为3层滤纸→样品胶→PVDF膜→3层滤纸，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中，连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1 h，用Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、TCF、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜、山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温孵育60 min，洗膜后曝光，用Image J软件分析灰度值。

1.5.4 RT-PCR检测Wnt3a、β-catenin、TCF mRNA转录水平将0.1 g冰冻腓肠肌组织经过液氮充分研磨，加入含有1 mL Trizol的离心管中，充分振荡混匀，静置5-10 min，加入0.2 mL氯仿上下剧烈混匀15-30 s，然后静置3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取水相到新的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，冰浴10 min，离心10 min，倾倒上层液体，用1 mL体积分数75%冰乙醇重悬沉淀，混匀，再次离心5 min，干燥，加入DEPC处理水溶解RNA，测浓度，-80 ℃保存。取2 μL RNA检测RNA的浓度和质量，用CWbio RT KIT进行反转录，使用荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。目的基因引物序列见表1。

1.5.5 免疫荧光法检测β-catenin表达量切片脱蜡至水，放入3%柠檬酸修复液高压修复，将高压锅放入自来水冷却至室温，加入体积分数3%双氧水20 min灭活内源性过氧化物酶活性，5% BSA室温孵育30 min，甩去BSA，滴加β-catenin 抗体(1∶120)工作液4 ℃孵育过夜，滴加山羊抗兔荧光二抗(1∶100)37 ℃孵育30 min，DAPI室温孵育10 min，自来水冲洗，水溶性封片剂封固，荧光显微镜观察，用Image J软件分析β-catenin荧光强度。

1.5.6 免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达量切片常规脱蜡至水，放入3%柠檬酸修复液高压修复，将高压锅自然冷却至室温，加入3%甲醇双氧水20 min，滴加5% BSA，室温孵育30 min弃掉，滴加稀释好的Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白抗体(1∶90)，4 ℃孵育过夜，PBS洗去一抗，滴加二抗(即用型)37 ℃孵育20 min，PBS洗去二抗，依次进行DAB显色，苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明及中性树胶封固，使用切片扫描仪(Leica，型号：Aperio LV1)采集图像，Image J软件分析Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达量。
1.6 统计学分析采用SPSS 27.0软件对实验数据进行统计分析，用Graphpad Prism 8.0作图。结果以x±s表示，符合正态分析及方差齐性检验的多组间样本均数比较采用双因素方差分析，两组内比较采用t检验，不满足上述条件的数据采用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

骨骼肌在人体生命活动中发挥着不可或缺的作用，其损伤也极为常见，大多由机械创伤所引起[17]。骨骼肌损伤后自身具有一定的修复能力，但若得不到有效的临床干预，损伤部位常因形成瘢痕组织而影响最终愈合质量，损害生理功能[18]。因此，有效减少瘢痕形成、提高骨骼肌的修复质量成为医学领域研究的热点。目前西医在临床上对骨骼肌损伤的治疗方法，主要是口服或外敷消炎药物以及手术干预等[19-21]，尽管这些方法对骨骼肌损伤有一定的疗效，但是大多价格昂贵、安全性低，存在不良反应，且不能有效减少瘢痕形成。中医推拿手法能抑制损伤后瘢痕的过度形成，从而促进肌肉功能的恢复，且安全有效、毒副作用小，对比于西医有明显优势[22]。理筋手法能够松筋活络、散瘀止痛，是中医临床治疗筋伤的重要方法[7]。近年来，课题组对理筋手法治疗骨骼肌损伤进行了系列研究，初步证实了理筋手法能够促进受损肌组织微循环重建和细胞骨架重构增强，对骨骼肌损伤修复有一定的促进作用[23]。筋伤早期的主要病机为筋脉瘀阻[24]，治疗应以“活血舒筋”为要，选用三步理筋法早期筋伤活血舒筋的“捋筋、揉筋、擦筋”手法，“以痛为输”为治疗原则，针对筋伤局部，先来回捋筋，有消瘀散结、通经理筋之效；再做连续不断的揉筋，能活血散瘀、消肿止痛；最后均匀往返擦筋，使行气活血、温经止痛，共同达到“调经理筋”的目的。
骨骼肌的修复过程受Wnt/β-catenin信号通路的调控。而过度地激活Wnt/β-catenin信号通路，能加剧损伤骨骼肌纤维化，抑制骨骼肌的修复。Wnt配体是一种富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，可以将膜外信号传导至细胞膜内，进而激活Wnt/β-catenin信号通路[25-26]；β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键调节因子，能参与Wnt信号的传导[27]；GSK3β是Wnt/β-catenin信号通路中的负调控因子，能使β-catenin磷酸化[28]；转录因子TCF是DNA的一种结合蛋白，可以与β-catenin发生作用后，激活转录[29]。Wnt/β-catenin信号通路的激活始于Wnt配体(如Wnt1、Wnt3a等)与Fzd受体的结合，这种结合会影响胞质中信号转运分子β-catenin水平，进而影响靶基因的表达[30]。Wnt/β-catenin信号通路的一个主要效应者是调节因子β-Catenin[31]。在缺乏Wnt配体的情况下，β-catenin被招募到由中心支架蛋白Axin与APC及GSK3β组成的“破坏复合体”中，该复合体能将β-Catenin磷酸化，导致β-Catenin被胞浆内的蛋白酶体降解[32]；当细胞接收到Wnt信号时，Wnt配体与Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LDL-receptor-related proteins 5/6，Lrp5/6)共受体结合，Wnt/β-catenin信号通路被激活，Dvl被招募激活以抑制“破坏复合物”并使β-catenin去磷酸化，GSK3β因磷酸化失活，去磷酸化且稳定的β-catenin不能被降解，使得胞质中β-catenin得以累积并转运入核，与淋巴因子TCF/LEF结合，启动转录，调节靶基因的表达[33-34]。由此可见，β-catenin能否累积入核是体现Wnt/β-catenin信号通路是否被激活的关键。Wnt/β-Catenin信号通路的过度激活可以刺激成纤维细胞的增殖分化，活化的成纤维细胞作为创面愈合和结缔组织重塑过程中的关键细胞[35]，促进了Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质的过度沉积，最终形成瘢痕组织影响损伤骨骼肌的愈合质量[36]。而Wnt3a能诱导Wnt/β-catenin信号通路激活，导致肌祖细胞过早的分化成熟，生成瘢痕组织，损害骨骼肌的再生[37]。Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白是骨骼肌主要的间质型胶原蛋白，其过度沉积在纤维化发展中起重要作用[38]。研究发现，给予小鼠体外注射Wnt3a重组蛋白后，损伤肌组织间隙胶原纤维增加，加剧了骨骼肌的纤维化程度；而注射Wnt蛋白抑制剂后，可有效降低胶原纤维沉积，减少骨骼肌纤维化[39]。研究还发现，骨骼肌损伤后Wnt/β-catenin信号通路被激活，导致骨骼肌纤维化；而推拿能有效抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，减少纤维化从而促进肌肉功能恢复[40]。这与此研究的结果基本一致，模型组相较于空白组，损伤后第7天Wnt3a、β-catenin、TCF的蛋白及mRNA表达量显著升高，随后逐渐降低，而p-GSK3β/GSK3β蛋白表达量比值在第7天时降低，随后逐渐升高，说明骨骼肌损伤后诱导了Wnt/β-catenin信号通路的激活，GSK-3β被抑制，使β-catenin数量增多，随后骨骼肌自然恢复使β-catenin数量有所降低；而理筋组相较于模型组，各观察点Wnt3a、β-catenin、TCF的蛋白及mRNA表达量均明显降低，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达量比值在各观察点较模型组则明显升高，说明理筋手法能抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，GSK-3β增多导致β-catenin降解。模型组相较于空白组，损伤后第7天β-catenin核表达荧光强度显著升高，随后逐渐降低，说明骨骼肌损伤后胞质中β-catenin得以累积并转运入核，与细胞因子TCF结合，最终激活转录，随后骨骼肌自然恢复使β-catenin核表达荧光强度有所降低；而理筋组相较于模型组，各观察点β-catenin核表达荧光强度明显降低，说明理筋手法可以抑制β-catenin的表达，使其不能进入细胞核与TCF结合。模型组相较于空白组，损伤后第7天Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的表达量均显著升高，随后呈降低趋势；而理筋组相较于模型组，各观察点Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的表达量很大程度降低，且逐渐与空白组接近。结合Masson染色结果，损伤后第7天模型组相较于空白组胶原纤维含量显著升高，随后略有减少；理筋组各观察点与模型组比较均有很大程度改善，肌组织逐渐愈合。苏木精-伊红染色结果显示，模型组与空白组比较，损伤后第7天肌细胞损伤严重，随后减轻，但肌纤维仍有损伤；理筋组相较于模型组肌细胞损伤程度很大程度改善，肌组织基本愈合。说明骨骼肌损伤后Wnt/β-catenin信号通路的异常激活加剧了纤维化的程度，随后虽然可以自然恢复，但仍有胶原沉积存在；而理筋手法可以有效抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，减少胶原纤维的生成，降低纤维化，加快肌组织的修复进程，最终促进损伤骨骼肌的修复。
综上所述，理筋手法能够通过上调Wnt3a、β-catenin、TCF的表达，下调负调控因子p-GSK3β的表达来抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，减少纤维化瘢痕组织的生成，最终促进损伤骨骼肌的修复。然而，由于资金及技术的不足，此研究未设置Wnt/β-catenin信号通路抑制剂组，存在局限性。课题组在接下来的实验中将考虑加入抑制剂，进一步论证理筋手法对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。另外，研究表明Wnt/PCP信号通路对损伤骨骼肌的修复也有调控作用，且能与Wnt/β-catenin信号通路相配合[41]。课题组接下来将致力于这一方向进行更深入的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

理筋手法减轻兔损伤骨骼肌纤维化的作用机制

Lijin manipulation alleviates fibrosis of injured skeletal muscle in rabbits

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