成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

doi:10.12307/2025.028

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2728-2735.doi: 10.12307/2025.028

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

上官泽宇，陈婵娟，李琦哲，谭伟，颜海健，王春庆，豆晓伟，李青

贵州医科大学附属医院，1创伤骨科，3 临床研究中心，贵州省贵阳市 550004；2 贵州医科大学临床医学院，贵州省贵阳市 550025

收稿日期:2023-12-21 接受日期:2024-02-05 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 李青，博士，教授，博士生导师，贵州医科大学附属医院创伤骨科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:上官泽宇，男，1993年生，贵州省赤水市人，白族，贵州医科大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓损伤方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82160249，81960234)，项目负责人：李青

Isolation and culture of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro and characterization of self-renewal capacity

Shangguan Zeyu1, 2, Chen Chanjuan2, Li Qizhe1, Tan Wei1, Yan Haijian1, Wang Chunqing1, Dou Xiaowei3, Li Qing1

1Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 3Clinical Research Center, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2023-12-21 Accepted:2024-02-05 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Li Qing, PhD, Professor, Doctoral supervisor, Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Shangguan Zeyu, Master candidate, Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160249, 81960234 (to LQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

触液神经元：又名接触脑脊液神经元，其胞体位于脑室或脊髓中央管周围，因其突起穿过室管膜伸入脑脊液而得名。近期课题组的研究证明，触液神经元在体内外均具有神经干细胞特性，此发现为定义神经干细胞身份、利用内源性神经干细胞治疗脊髓损伤带来新的希望。
自我更新能力：神经干细胞具有自我更新能力，即不断地进行细胞分裂生成与母细胞性质相同的子代干细胞。神经干细胞的自我更新能力使其能稳定存在并满足身体对细胞的需求。

摘要
背景：课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元，尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法，且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究。
目的：建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法，并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。
方法：从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞，通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞，在完全培养基中悬浮培养。通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况，观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力；将同等数量(5×103)的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组，分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中，在体积分数5%CO2，37°C恒温箱悬浮培养，通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力。
结果与结论：①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元，在体外表达Nestin及SOX2，能形成神经球并连续传代。②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱，细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150 μm的神经球，而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40 μm(P < 0.000 1)。③CCK8增殖实验结果表明，成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P < 0.000 1)。④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P < 0.000 1)和蛋白表达量(P < 0.01)较乳鼠显著下降。⑤上述结果证实，成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠。

https://orcid.org/0009-0002-7998-3347 (上官泽宇)；https://orcid.org/0000-0002-2338-150X (李青)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 成年小鼠触液神经元, 内源性神经干细胞, 自我更新能力, 体外培养, 细胞提纯, 融合多模态成像基因的慢病毒, 干细胞潜能鉴定

Abstract: BACKGROUND: We have successfully isolated and cultured neonatal mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro, but there is no study that reports an effective method for isolating and culturing high-purity adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons. There is no study on whether the self-renewal ability of cerebrospinal fluid-contacting neurons changes with age.
OBJECTIVE: To establish a method for isolating and culturing high-purity adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro, and to characterize the self-renewal ability of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons and neonatal mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro.
METHODS: Primary cells containing cerebrospinal fluid-contacting neurons were isolated from the cervical medulla of adult mouse (3 months of age) in adherent culture and transfected with lentivirus fused with multimodal imaging genes. High-purity adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons were obtained by puromycin screening in suspension culture in complete medium. The expression of neural stem cell markers Nestin and SOX2 was detected by immunofluorescence in adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons, and the ability of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons to form spheres and pass on in vitro was observed. An equal number (5×103/mL) of passage 3 adult mouse and neonatal mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons were divided into two groups under the same conditions and inoculated into ultra-low adhesion plates containing complete medium in suspension culture at 5% CO2, 37°C thermostat, respectively. The self-renewal capacity of adult mouse and neonatal mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons was characterized by in vitro spheroid formation, CCK8 assay, qPCR, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) High-purity cerebrospinal fluid-contacting neurons were successfully isolated from adult mouse, which expressed Nestin and SOX2 in vitro, and were able to form neurospheres and pass on continuously. (2) The in vitro self-renewal ability of cerebrospinal fluid-contacting neurons in adult mouse was significantly weaker than that of neonatal mouse, and the neurospheres formed by day 4 of cell culture in neonatal mouse were about 150 μm in diameter, whereas the neurospheres formed by adult mouse tactile neurons were only 40 μm in diameter (P < 0.000 1). (3) CCK8 proliferation assay showed that the proliferative activity of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons was significantly weaker than that of neonatal mouse at all time points after culture (P < 0.000 1). (4) qPCR and western blot assay revealed that the mRNA (P < 0.000 1) and protein expression levels (P < 0.01) of Nestin and SOX2 in cerebrospinal fluid-contacting neurons of adult mouse were significantly decreased compared with those of neonatal mouse. (5) The above results indicated that the self-renewal ability of cerebrospinal fluid-contacting neurons in adult mouse was significantly weaker than that of neonatal mouse in vitro.

Key words: spinal cord injury, adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neuron, endogenous neural stem cell, self-renewal capacity, culture in vitro, cell purification, lentiviruses incorporating multimodal imaging genes, stem cell potential identification

中图分类号:

上官泽宇, 陈婵娟, 李琦哲, 谭伟, 颜海健, 王春庆, 豆晓伟, 李青. 成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2728-2735.

Shangguan Zeyu, , Chen Chanjuan, Li Qizhe, Tan Wei, Yan Haijian, Wang Chunqing, Dou Xiaowei, Li Qing. Isolation and culture of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro and characterization of self-renewal capacity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2728-2735.

图/表（结果） 4

2.1 触液神经元位于成年小鼠脊髓干细胞巢并表达神经干细胞标记物 成年哺乳动物脊髓中神经干细胞主要存在于脊髓中央管的室管膜及室管膜下区，在该区域由中央管结构、脑脊液及各种神经细胞构成了一个特殊的微环境被称作神经干细胞巢[5]。触液神经元位于干细胞巢，可见其突起穿过室管膜伸入脊髓中央管，见图1A。成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物Nestin及SOX2，见图1B，C。

2.2 融合多模态成像基因的慢病毒可以纯化并在体外示踪成年小鼠触液神经元 课题组以往的研究证实，根据触液神经元特异性标记物Pkd2l1启动子构建的小鼠多模态成像基因的慢病毒可以在体外筛选纯化乳鼠触液神经元[12]，因此理论上该慢病毒同样可以筛选出同源的成年小鼠触液神经元，该实验结果证实了课题组的推测。将3月龄成年C57BL/6小鼠颈髓组织经Accutase消化得到的含有原代触液神经元的细胞进行贴壁培养24 h后，利用多模态成像基因慢病毒转染细胞48 h，见约6%贴壁细胞表达绿色荧光蛋白，见图2A，B，D。用嘌呤霉素筛选72 h后仅有少量细胞存活，将存活的细胞换液后更换到完全培养基中进行悬浮培养，荧光显微镜下检查发现几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白(约98%)，见图2C，D免疫荧光检测发现经嘌呤霉素筛选后表达绿色荧光蛋白的细胞与Pkd2l1共定位，见图2E，F，证明经嘌呤霉素筛选后存活的细胞为成年小鼠的触液神经元，并且绿色荧光蛋白可以替代Pkd2l1在体外示踪成年小鼠的触液神经元。

2.3 成年小鼠触液神经元在体外表达神经干细胞标记物，能形成神经球并连续传代 为了验证成年小鼠触液神经元具有神经干细胞特性，选取第3代成年小鼠触液神经元进行相关实验。免疫荧光检测发现成年小鼠触液神经元在体外表达神经干细胞标记物Nestin及SOX2，见图3A，B。自我更新能力是神经干细胞的特有能力之一，在体外表现为神经球的形成[19]，课题组接下来检测成年小鼠触液神经元在体外的成球能力。成年小鼠触液神经元在完全培养基中悬浮培养到第3天可见较小神经球形成，继续培养到第10天见较大神经球形成，直径约200 μm，达到传代标准，见图3C。将神经球转移到离心管中用Accutase酶消化为单细胞后继续同前培养方式，成年小鼠触液神经元可连续传代，见图3D。

2.4 成年小鼠触液神经元较乳鼠自我更新能力显著降低 既往研究报道，神经干细胞的自我更新能力随着年龄的增长而下降[16-18]，课题组在培养成年小鼠触液神经元的过程中证实这一结论。乳鼠的触液神经元在从单细胞扩增到200 μm的神经球一般仅需三四天[12]，而成年小鼠触液神经元需要10 d才能形成和乳鼠一样大的神经球，见图3C。为了更客观地评价成年小鼠和乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力，课题组预先调整细胞数量为5×103/孔接种在96孔板中，以同等条件在体外扩增成年小鼠和乳鼠触液神经元，到第4天时乳鼠的触液神经元已形成直径约150 μm的神经球，而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅约50 μm(P < 0.000 1)，见图4A，B。CCK8实验结果再次证实了这一观点，成年小鼠触液神经元的增殖活性在所有时间节点均弱于乳鼠(P < 0.000 1)，见图4C，D。随后，课题组通过qPCR和Western blot检测了Nestin和SOX2在成年小鼠或乳鼠触液神经元中mRNA和蛋白的相对表达水平，课题组观察到Nestin和SOX2在成年小鼠触液神经元中mRNA(P < 0.000 1)及蛋白(P < 0.01)的相对表达量均明显低于乳鼠，见图4E-G。

参考文献

[1] ZIPSER CM, CRAGG JJ, GUEST JD, et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 2022;21(7):659-670.
[2] GILBERT EAB, LAKSHMAN N, LAU KSK, et al. Regulating endogenous neural stem cell activation to promote spinal cord injury repair. Cells. 2022;11(5):846.
[3] CHAKER Z, CODEGA P, DOETSCH F. A mosaic world: puzzles revealed by adult neural stem cell heterogeneity. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2016;5(6):640-658.
[4] WYART C, CARBO-TANO M, CANTAUT-BELARIF Y, et al. Cerebrospinal fluid-contacting neurons: multimodal cells with diverse roles in the CNS. Nat Rev Neurosci. 2023;24(9):540-556.
[5] BECKER CG, BECKER T, HUGNOT JP. The spinal ependymal zone as a source of endogenous repair cells across vertebrates. Prog Neurobiol. 2018;170:67-80.
[6] ORTS-DEL’IMMAGINE A, TROUSLARD J, AIRAULT C, et al. Postnatal maturation of mouse medullo-spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. Neuroscience. 2017;343:39-54.
[7] PETRACCA Y L, SARTORETTI M M, DI BELLA D J, et al. The late and dual origin of cerebrospinal fluid-contacting neurons in the mouse spinal cord. Development. 2016;143(5):880-891.
[8] STERNBERG JR, PRENDERGAST AE, BROSSE L, et al. Pkd2l1 is required for mechanoception in cerebrospinal fluid-contacting neurons and maintenance of spine curvature. Nat Commun. 2018;9(1):3804.
[9] GERSTMANN K, JURČIĆ N, BLASCO E, et al. The role of intraspinal sensory neurons in the control of quadrupedal locomotion. Curr Biol. 2022;32(11):2442-2253.e4.
[10] CAO L, HUANG M Z, ZHANG Q, et al. The neural stem cell properties of Pkd2l1(+) cerebrospinal fluid-contacting neurons in vivo. Front Cell Neurosci. 2022;16:992520.
[11] WANG S, HE Y, ZHANG H, et al. The neural stem cell properties of PKD2L1(+) cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro. Front Cell Neurosci. 2021;15:630882.
[12] 罗张荣,曹亮,张毅,等.多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性[J].中国组织工程研究,2023,27(34):5505-5509.
[13] HE Y Q, SHI XX, CHEN L, et al. Cerebrospinal fluid-contacting neurons affect the expression of endogenous neural progenitor cells and the recovery of neural function after spinal cord injury. Int J Neurosci. 2021;131(6):615-624.
[14] JABBOUR P, FEHLINGS M, VACCARO AR, et al. Traumatic spine injuries in the geriatric population. Neurosurg Focus. 2008;25(5):E16.
[15] ELI I, LERNER DP, GHOGAWALA Z. Acute traumatic spinal cord injury. Neurol Clin. 2021;39(2):471-488.
[16] ADAMS PD, JASPER H, RUDOLPH KL. Aging-induced stem cell mutations as drivers for disease and cancer. Cell Stem Cell. 2015;16(6):601-612.
[17] BAILEY KJ, MASLOV AY, PRUITT SC. Accumulation of mutations and somatic selection in aging neural stem/progenitor cells. Aging Cell. 2004;3(6):391-397.
[18] NICAISE AM, WILLIS CM, CROCKER SJ, et al. Stem cells of the aging brain. Front Aging Neurosci. 2020;12:247.
[19] REYNOLDS BA, WEISS S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 1992;255(5052):1707-1710.
[20] JAMES S, THEADOM A, ELLENBOGEN R. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol. 2019;18(1):56-87.
[21] MCDONALD JW, SADOWSKY C. Spinal-cord injury. Lancet. 2002; 359(9304):417-425.
[22] FOUAD K, POPOVICH PG, KOPP MA, et al. The neuroanatomical-functional paradox in spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 2021;17(1): 53-62.
[23] SOFRONIEW MV. Dissecting spinal cord regeneration. Nature. 2018; 557(7705):343-350.
[24] LIU S, CHEN Z. Employing endogenous NSCs to promote recovery of spinal cord injury. Stem Cells Int. 2019;2019:1958631.
[25] BARNABÉ-HEIDER F, GÖRITZ C, SABELSTRÖM H, et al. Origin of new glial cells in intact and injured adult spinal cord. Cell Stem Cell. 2010; 7(4):470-482.
[26] MALIK SC, CHU YH, SCHACHTRUP C. Pointing fingers at blood contact: mechanisms of subventricular zone neural stem cell differentiation. Neural Regen Res. 2023;18(1):137-138.
[27] OBERNIER K, ALVAREZ-BUYLLA A. Neural stem cells:origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 2019;146(4):dev156059.
[28] JOHANSSON CB, MOMMA S, CLARKE DL, et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 1999;96(1):25-34.
[29] MORENO-MANZANO V. Ependymal cells in the spinal cord as neuronal progenitors. Curr Opin Pharmacol. 2020;50:82-87.
[30] STENUDD M, SABELSTRÖM H, LLORENS-BOBADILLA E, et al. Identification of a discrete subpopulation of spinal cord ependymal cells with neural stem cell properties. Cell Rep. 2022;38(9):110440.
[31] SHAH PT, STRATTON JA, STYKEL MG, et al. Single-cell transcriptomics and fate mapping of ependymal cells reveals an absence of neural stem cell function. Cell. 2018;173(4):1045-1057.e9.
[32] BAKER DJ, PETERSEN RC. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases:evidence and perspectives. J Clin Invest. 2018;128(4):1208-1216.
[33] MARIN NAVARRO A, PRONK RJ, VAN DER GEEST AT, et al. p53 controls genomic stability and temporal differentiation of human neural stem cells and affects neural organization in human brain organoids. Cell Death Dis. 2020;11(1):52.
[34] SCAHILL RI, FROST C, JENKINS R, et al. A longitudinal study of brain volume changes in normal aging using serial registered magnetic resonance imaging. Arch Neurol. 2003;60(7):989-994.
[35] TERRY DM, DEVINE SE. Aberrantly high levels of somatic LINE-1 expression and retrotransposition in human neurological disorders. Front Genet. 2019;10:1244.
[36] CARRASCO-GARCIA E, MORENO-CUGNON L, GARCIA I, et al. SOX2 expression diminishes with ageing in several tissues in mice and humans. Mech Ageing Dev. 2019;177:30-36.
[37] MUOTRI AR, CHU VT, MARCHETTO MC, et al. Somatic mosaicism in neuronal precursor cells mediated by L1 retrotransposition. Nature. 2005;435(7044):903-910.
[38] CODEGA P, SILVA-VARGAS V, PAUL A, et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 2014;82(3):545-559.

引言

利用内源性神经干细胞治疗脊髓损伤是一种理想的方法，并具有独特优势[1-2]。然而，成年哺乳动物体内神经干细胞数量有限、来源尚无定论[3]，因此明确内源性神经干细胞的身份是利用其治疗脊髓损伤的关键。
触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)是中枢神经系统中发挥多功能的多模式细胞[4]。触液神经元存在于脊髓干细胞巢[5]，既往文献报道触液神经元具有不成熟神经元特性，并且长期保持低分化状态[6-7]。
此外，触液神经元具有机械感应作用，在维持脊柱稳定性及小鼠精细运动中发挥重要作用[8-9]。在以往的研究中，课题组在成年小鼠体内证实触液神经元具有神经干细胞特性，表达神经干细胞标记物如巢蛋白(Nestin)、性别决定区Y框蛋白2(Sex Determining Region Y Box Protein 2，SOX2)及双皮质素[10]。随后课题组成功从乳鼠延髓和颈髓分离出触液神经元，发现触液神经元在体外能形成神经球，通过分化诱导可以分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞 [11-12]。课题组以往的研究证实，触液神经元是内源性神经干细胞，并在脊髓损伤后的恢复进程中起重要作用[13]。因此，进一步对触液神经元的研究对于利用其治疗脊髓损伤具有重要现实意义。
脊髓损伤的平均发病年龄为43岁，呈双峰分布，青壮年为第一个高峰，老年人口为第二个高峰[14-15]。此外，大量研究证实干细胞的自我更新能力随着年龄的增长逐渐下降[16-18]，因此，研究成年小鼠触液神经元更符合实际临床价值需求。然而，由于分离培养成年小鼠的触液神经元相对于乳鼠具有较大难度，以往对触液神经元的体外研究均以乳鼠为供体。因此，建立分离纯化成年小鼠触液神经元的方法是研究成鼠触液神经元治疗脊髓损伤的基础。
在此文中，课题组在以往研究的基础上，利用融合了多模态成像基因的慢病毒(Lentivirus-Pkd2l1-GFP-puromycin-luciferase)建立了一种以成年小鼠为供体[12]，分离纯化及培养触液神经元的方法。同时，课题组鉴定了出生72 h内乳鼠与3月龄成年小鼠触液神经元在体外的自我更新能力，发现成年小鼠触液神经元自我更新能力明显弱于乳鼠。课题组的研究旨在为利用触液神经元治疗脊髓损伤提供更客观、更可靠的细胞来源，并为进一步研究年龄因素对触液神经元干细胞潜能的影响奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 从成年小鼠颈髓组织分离含有触液神经元的原代细胞，利用根据多囊肾病2型1通道(polycystic kidney disease 2 like 1，Pkd2l1)启动子构建的融合多模态成像基因的慢病毒转染示踪成年小鼠触液神经元，通过嘌呤霉素筛选纯化得到高纯度成年小鼠触液神经元，通过免疫荧光和成球实验鉴定成年小鼠触液神经元的干细胞特性；通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。重复测量方差分析和Sidak法进行校正。
1.2 时间及地点 实验于2023年6-12月在贵州医科大学附属医院临床研究中心完成。
1.3 材料 SPF级C57BL/6成年小鼠(3月龄，雌雄不限，体质量19-21 g)6只用于脊髓组织切片进行免疫荧光检测，3只SPF级C57BL/6成年(3月龄，雌雄不限，体质量19-21 g)及10只乳鼠(出生72 h，雌雄不限)用于提取成年小鼠及乳鼠触液神经元细胞。所有实验动物均由贵州医科大学实验动物中心提供，饲养在贵州医科大学附属医院临床研究中心SPF级动物研究平台，许可证号：SCXK(黔)2018-0001。
所有动物实验操作均符合贵州医科大学动物伦理委员会要求和规定，得到贵州医科大学动物伦理委员批准，批准号：2100560，批准时间：2021-03-02。
1.4 实验方法
1.4.1 成年小鼠触液神经元分离培养 3月龄成年C57BL/6小鼠(n=3)予以体积分数1.25%阿弗丁腹腔注射，麻醉后剔除背部毛发，将小鼠头以下身体浸泡在体积分数75%乙醇中5 min消毒，在生物安全柜逐层剪开皮肤肌肉组织，暴露棘突，用椎板咬骨钳摘除椎板。显微剪刀离断神经根后用显微镊子小心取下整条脊髓组织放入预冷好的解剖液中[DMEM-HG(美国Gibco公司)、体积分数1% L-谷氨酰胺(美国Gibco公司)、体积分数5%青链霉素(美国HyClone公司)]。将小鼠颈髓组织剪成1 cm长短，并在解剖显微镜下仔细剔除残余神经根，完全剥离硬脊膜，并尽量剪掉白质与灰质组织，留下中央管区和紧挨中央管周围的少量灰质。将上述组织用无菌显微剪刀反复剪碎成均匀的约0.5 mm3的碎块后转移到含有预热到37 ℃ Accutase(美国Gibco公司)的15 mL离心管中消化30 min，期间每10 min反复吹打30-50次。消化完成后1 000 r/min离心5 min，去上清，添加2 mL筛选培养基[Neurobasal-A 培养基(美国Gibco公司)、体积分数1% L-谷氨酰胺、体积分数2% B-27(美国Gibco公司)、体积分数1%青链霉素]重悬细胞悬液。静置2 min待未消化完全的脊髓组织块沉底后，吸取上清液，经200目滤网过滤后调整细胞悬液浓度为2.5×108 L-1接种在预先经D型多聚赖氨酸(美国Sigma公司)处理过的6孔板贴壁培养。

1.4.2 成年小鼠触液神经元筛选纯化 含有触液神经元的原代细胞贴壁24 h后，向培养基中加入筛选触液神经元专用的融合了多模态成像基因的慢病毒(上海吉凯基因公司)转染48 h后在倒置荧光显微镜下(德国Carl Zeiss AG公司)观察绿色荧光蛋白表达情况，可见5%-8%细胞表达绿色荧光蛋白。细胞换液后加入5 μmol/L嘌呤霉素筛选72 h后再次观察绿色荧光蛋白表达情况，见几乎所有存活的细胞表达绿色荧光蛋白。用胰酶将贴壁的触液神经元消化脱底，将细胞悬液1 000 r/min离心5 min后去上清，用触液神经元完全培养基[Neurobasal-A 培养基、体积分数1%L-谷氨酰胺、体积分数2% B-27、体积分数1%青链霉素、体积分数0.2%肝素钠(北京Solarbio公司)、20 ng/mL 表皮生长因子(美国Gibco公司)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(美国Gibco公司)]重悬细胞后转移到超低黏附6孔板中在37 ℃恒温箱中悬浮培养。

1.4.3 成年小鼠触液神经元传代 成年小鼠触液神经元在培养过程中会逐渐形成神经球，当大多数神经球直径达到150-200 μm进行传代，将需要传代的触液神经元神经球1 000 r/min离心5 min去上清，加入2 mL预热到37 ℃的Accutase酶消化30 min，期间每10 min涡旋细胞悬液5-10 s。当触液神经元神经球消化成单细胞后终止消化。
1.4.4 细胞免疫荧光染色 将第3代成年小鼠触液神经元单细胞接种在预先经PDL包被处理过的共聚焦培养皿中，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min。室温封闭60 min，去掉封闭液，分别加入一抗[兔抗Pkd2l1(美国Millipore公司，AB9084)1∶700、小鼠抗Nestin(美国Abcam公司，ab18102)1∶200、小鼠抗SOX2 (美国Abcam公司，ab171380)1∶200]后4 ℃冰箱过夜。第2天复温60 min后吸去一抗，用PBS洗3次，每次5 min。加入相应二抗[山羊抗兔IgG(H+L) 488，美国CST公司；山羊抗鼠IgG (H+L) 555，美国CST公司]在室温下孵育1 h。吸去二抗，PBS洗3次，每次5 min，加入DAPI(北京Solarbio公司)染核15 min，吸去DAPI加入封固剂后在共聚焦激光显微镜(德国Carl Zeiss AG公司)下图像采集。用ImageJ软件(美国National Institutes of Health)对所有免疫荧光图片加工处理，观察绿色荧光蛋白与Pkd2l1，Nestin及SOX2的共表达情况。
1.4.5 组织免疫荧光染色 3月龄小鼠(n=6)予以体积分数1.25%阿弗丁腹腔内麻醉后，分别用生理盐水和40 g/L多聚甲醛溶液进行心脏灌注，采集颈髓组织(2.0 cm)。将组织在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后包埋在石蜡中。脱蜡后，将切片与一抗(兔抗Pkd2l1 1∶700、鼠抗Nestin 1∶200、鼠抗SOX2 1∶200)在4 ℃下孵育过夜。第2天复温1 h后加入相应二抗孵育1 h，DAPI进行核染色15 min。使用共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss AG公司)进行图像采集。用Image J软件对所有免疫荧光图片加工处理，观察Pkd2l1与Nestin和SOX2共表达情况。
1.4.6 乳鼠触液神经元培养 从乳鼠(出生72 h内)颈髓提取含有触液神经元的原代细胞，贴壁培养24 h后转染融合了多模态成像基因的慢病毒，继续培养48 h后予以细胞换液，加入5 μmol/L嘌呤霉素筛选72 h后获得高纯度乳鼠触液神经元。调整乳鼠触液神经元浓度为2.5×108 L-1接种在含有完全培养基的超低黏附6孔板中继续悬浮培养。每隔一两天视细胞生长情况予以补液及换液，待乳鼠触液神经元所形成的神经球直径达到150-200 μm进行传代，传代方式同成年小鼠触液神经元。
1.4.7 触液神经元成球能力鉴定 将第3代成年小鼠和乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组，分别接种在含有完全培养基的无粘连培养板中扩增培养，2组细胞初始数量均调整为5×103，培养到第4天时在倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss AG公司)下观察成年小鼠及乳鼠触液神经元所形成的神经球直径大小。
1.4.8 CCK8细胞增殖实验 选取第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元进行CCK8增殖实验，调整两组触液神经元细胞浓度为5×107 L-1接种在含有完全培养基的在96孔板中进行扩增培养(100 μL/孔，每孔细胞数量为5×103)，每组3个复孔。在接种后第0，1，2，3，4天相应时间点每孔加入10 μL的CCK8溶液后继续在培养箱中孵育2 h，用多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)测定紫外线450 nm处的吸光值，将吸光度值(A)归一化后分别计算两组细胞的增殖活性。计算方法如下：各时间点增殖活性=(A实验-A空白对照)/(A Day0实验组-A Day0空白对照组)。
1.4.9 实时定量PCR 选取第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元进行qPCR实验。①RNA提取：收集成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元，用PBS洗3遍，每个样品加入300 μL Trizol，吹打。完全裂解后吸入到新的EP管中，加入100 μL氯仿，涡旋15-20 s后冰上静置，待液面分层后予以4 ℃、13 000 r/min离心 15 min，吸上清至新EP管中，加入同等体积的异丙醇，充分进行混匀，冰上静置15 min后4 ℃、13 000 r/min离心15 min，弃去上清，用体积分数75%的乙醇洗涤2次，向EP管中加入30 μL DEPC溶解RNA，55 ℃加热5 min。②反转录：取500 ng RNA用反转录试剂盒(上海碧云天生物技术公司)反转录。③在超净工作台中配置定量PCR反应体系，设置标准程序：预变性，95℃，2 min；变性，95℃，退火/延伸，60 ℃，30 s，进行40个循环；溶解曲线阶段，仪器默认设置。实验结果采用∆∆CT法和归一化分析计算Nestin和SOX2在成年小鼠和乳鼠的触液神经元的mRNA相对表达量。基因引物序列见表1。

1.4.10 Western blot检测 选取第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元进行Western blot实验。①细胞蛋白提取：成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元，PBS洗3遍后收集在EP管，置于冰上，加入适量RIPA裂解液，置于冰上充分裂解30 min后超声波裂解1 min，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，收集上清液至EP管中，再向EP管中加入1/4体积的5×Protein loading buffer，混匀后95 ℃金属浴上煮5 min，将样品置于冰上。②凝胶电泳：将配制好的10% PAGE胶安装至电泳槽中。上样后，浓缩胶电泳电压设置80 V，样品进入分离胶后再调整电压到120 V。③转膜：电泳结束后，切去浓缩胶，将胶转移至转膜液中。无水甲醇激活PVDF (美国Millipore公司)膜后转移至转膜液中。组装好PAGE胶、PVDF膜和滤纸后，在转膜槽中恒流230 mA转膜90 min。④封闭和抗体孵育：体积分数5%脱脂奶粉室温封闭60 min，TBST洗膜3次，4 ℃下摇床孵育一抗[单克隆鼠抗Nestin 1∶5 000、单克隆鼠抗SOX2 1∶500、单克隆鼠抗GAPDH(武汉三鹰公司，60004-1-lg) 1∶50 000]过夜，第二天用TBST洗膜3次，二抗室温孵育60 min，最后用ECL(美国Thermo Fisher公司)化学发光液显色，化学发光成像仪(上海勤翔公司)采集图像。以Nestin/GAPDH、SOX2/GAPDH比值分别表示目的蛋白的相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①经融合了多模态成像基因的慢病毒转染后及嘌呤霉素筛选后成年小鼠触液神经元的绿色荧光蛋白表达，以及绿色荧光蛋白与触液神经元特异性生物标记物Pkd2l1荧光共表达情况；②成年小鼠触液神经元的体外表达神经干细胞标记物Nestin及SOX2的表达情况，成年小鼠触液神经元在体外成球能力及传代能力；③成年小鼠与乳鼠触液神经元在体外成球能力对比、Nestin、SOX2 mRNA及蛋白相对表达水平对比。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9.0软件(美国GraphPad Software公司)对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，组内两两比较采用配对t检验分析，两组间比较采用独立样本t检验，对包含2个因素(其中一个因素为重复测量因素)的正态分布的连续变量采用重复测量方差分析，方差齐性用Sidak法进行校正，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计方法已通过贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤是高发生率、高致残率疾病，目前尚无有效治疗方法[20]。神经元大量死亡、轴突再生和神经回路重建失败是脊髓损伤后永久性残疾的病理基础[21-23]。中枢神经系统再生能力有限，研究表明神经干细胞可以产生中间神经元，中间神经元进一步分化为成熟神经元并重建神经回路[24-26]。然而，由于缺乏用于评估的特异性标记物和选择标准，以及细胞谱系转换期间表达的标记物的频繁重叠，成体神经干细胞的身份尚不清楚[27]。已有研究证实，神经干细胞存在于哺乳动物的室管膜下区，该区存在室管膜细胞和触液神经元两种细胞。研究发现室管膜细胞在脊髓损伤后增殖急剧增加，并具有分化成星形胶质细胞的能力，这表明室管膜细胞是神经干细胞[28-30]。然而，使用靶向标记室管膜细胞的转基因小鼠模型证实室管膜细胞在体外没有形成神经球的能力，这推翻了室管膜细胞是神经干细胞的结论[31]。课题组以往的研究表明，小鼠触液神经元能形成神经球，并在体外具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力[11-12]，在小鼠脊髓损伤或将神经营养因子血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子注射到侧脑室可促进触液神经元在体内增殖[10]，这些结果表明，触液神经元是神经干细胞，进一步研究触液神经元的功能对于激活触液神经元的神经干细胞潜能治疗脊髓损伤是必要的。
体外细胞实验研究对于探索细胞的功能十分重要，课题组在之前的研究中成功分离出了乳鼠触液神经元，然而，脊髓损伤多发生在成年或老年时期[14-15]，因此研究乳鼠的触液神经元显然不能客观反映成年小鼠触液神经元的生物学特征。而成年小鼠脊髓组织相比乳鼠结构复杂，且在分离提取过程中易污染，加上触液神经元存在的特殊位置以及在中央管周围细胞占比仅约5%，导致成年小鼠触液神经元提取难度较大。通过流式荧光分选的触液神经元损伤重，筛选后难以存活，因此课题组构建了一种针对触液神经元的融合了多模态成像基因的慢病毒用以体外筛选纯化并长时间示踪触液神经元，在乳鼠触液神经元分离纯化中验证了该成像分子的可行性[12]。课题组研究证实该慢病毒同样适用于成年小鼠的触液神经元筛选和纯化。
该课题组在培养成年小鼠触液神经元的过程中发现其在体外成球能力显著弱于乳鼠触液神经元，表明随着年龄的增长触液神经元的自我更新能力下调。既往研究报道，哺乳动物神经干细胞在生态位内保持包括静止、增殖和分化的不同状态，然而，这些状态下的细胞比例随着生物年龄的增加而急剧变化[27]。大量证据表明，衰老会对神经干细胞产生负面影响，这是一个细胞增殖能力下降并经历深刻变化的过程，这些变化内在地改变了神经干细胞的正常功能，并影响周围细胞，最终会影响再生功能并导致与年龄相关的器官功能障碍[32-33]，造成此结果最主要的原因是DNA的损伤和修复的平衡随着年龄的增长被打破[34]。有研究证据表明，反转录转座元件是从一个位置复制并粘贴到另一个位置的DNA元件，可以通过突变和双链断裂引起基因组不稳定，进而影响基因调控[35]。研究发现，在老年人大脑中观察到反转录转座元件活性增加，而这一结果导致神经干细胞基因组不稳定，例如长散布核元件1，它通常受到SOX2的抑制，而SOX2是维持神经干细胞所需的基因，随着年龄的增长，海马神经干细胞中SOX2的表达会减少[36-37]。在该课题组的研究中同样发现SOX2和Nestin在乳鼠触液神经元的mRNA以及蛋白的相对表达量显著高于成年小鼠触液神经元，而Nestin作为神经干细胞标记物，同样是激活态神经干细胞的标记物[38]。总之，该课题组的研究表明成年小鼠触液神经元自我更新能力显著低于小鼠，这也许是机体的再生能力随着年龄的增长逐渐下降的原因。
实验建立了一种分离、纯化以及培养成年小鼠触液神经元的简便、可重复及可操作性强的方法，这为研究成年小鼠触液神经元的功能奠定了基础。此外，未来有必要进行进一步的研究探明成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元自我更新能力存在差异的具体原因，这对将来利用触液神经元治疗脊髓损伤或其他神经系统退行性疾病至关重要。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

Isolation and culture of adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neurons in vitro and characterization of self-renewal capacity

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	迟文鑫, 张存鑫, 高凯, 吕超亮, 张科峰. 川陈皮素抑制BV2小胶质细胞炎症反应的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1321-1327.
[2]	赵瑞华, 陈思娴, 郭杨, 石磊, 吴承杰, 吴毛, 杨光露, 张昊恒, 马勇. 温肾通督方促进小鼠脊髓损伤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1118-1126.
[3]	王荣荣, 黄玉珊, 李湘淼, 白金柱. 创伤性脊髓损伤急性期前列腺素E1对血管相关因子的调节和微循环功能的保护[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 958-967.
[4]	杨彬, 陶广义, 杨顺, 许俊杰, 黄俊卿. 人工智能在脊髓神经损伤与修复领域研究热点的可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 761-770.
[5]	郭佳, 任亚锋, 李冰, 黄靖, 尚文雅, 杨溢珂, 刘慧瑶. 负载miRNA间充质干细胞源外泌体改善脊髓损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7827-7838.
[6]	郑伊桐, 汪永新, 刘文, 阿木吉特, 秦虎. 神经内镜下人脐带间充质干细胞外泌体鞘内移植修复脊髓损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7743-7751.
[7]	徐彪, 董玉珍, 路坦. 二氢槲皮素对脊髓损伤大鼠炎症反应标志物表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6843-6850.
[8]	王子恒, 吴霜. 脊髓损伤后氧化应激相关基因及分子机制：基于GEO数据库的数据分析及验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6893-6904.
[9]	张学三, 张政, 沈乐, 耿晴晴, 谭树森, 娄纯彪, 韩康. 天然产物调控细胞焦亡治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(30): 6520-6528.
[10]	徐振华, 李彦杰, 秦合伟, 刘昊源, 朱博超, 王煜普. 中药单体治疗脊髓损伤后神经炎症：核转录因子κB信号通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(3): 590-598.
[11]	官镇洁, 李文媛, 耿瑞, 王莹. 脊髓损伤后皮质脊髓束调控机制：靶向转录因子及信号通路联合治疗策略[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(24): 5158-5170.
[12]	于庆贺, 蔡子鸣, 田禾, 李翩, 阮烨, 梁金柱, 林淑惠, 林文平. 血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4931-4938.
[13]	林慧洁, 黄云, 黄志华, 江丽霞. 载药外泌体在中枢神经系统疾病中的热点问题[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 5013-5021.
[14]	陶紫晗, 赛吉拉夫. 环黄芪醇促进脊髓损伤小鼠运动功能恢复及皮质神经元再生的相关机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(20): 4258-4265.
[15]	朱博超, 李彦杰, 秦合伟, 赵楠楠, 刘昊源, 徐振华, 王煜普. 加味春泽汤调控内质网应激凋亡治疗脊髓损伤大鼠的尿潴留[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 371-378.