枸杞多糖调节线粒体动力学改善过氧化氢诱导 SH-SY5Y 细胞的凋亡

doi:10.12307/2025.049

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2736-2743.doi: 10.12307/2025.049

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

枸杞多糖调节线粒体动力学改善过氧化氢诱导 SH-SY5Y 细胞的凋亡

王记委1，2，李雁冰1，2，郭敏芳2，孟涛2，于婧文2，刘晓琴2，穆秉桃2，贾思玮1，2，马存根1，2，尉杰忠1，2，3

1山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；2山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009；3大同市第五人民医院，山西省大同市 037009

收稿日期:2023-12-05 接受日期:2024-03-14 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 尉杰忠，教授，博士生导师，山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009；大同市第五人民医院，山西省大同市 037009；共同通讯作者：马存根，博士生导师，山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009
作者简介:王记委，男，1995年生，河南省驻马店市人，汉族，山西中医药大学在读硕士，主要从事神经变性疾病的基础研究。共同第一作者：李雁冰，女，1996年生，广东省梅州市人，汉族，山西中医药大学在读硕士，主要从事神经变性疾病的基础研究。
基金资助:
山西省 2022年度“四个一批”科技兴医创新计划项目(2022XM33)，项目负责人：尉杰忠；山西省自然科学研究面上项目(202303021211244)，项目负责人：尉杰忠；山西省中医药管理局科研课题项目(2023ZYYB2042)，项目负责人：尉杰忠；山西省中医重点实验室建设项目(zyyyjs2024027)，项目负责人：尉杰忠；山西省基础研究计划项目(20210302123476，20210302123478)，项目负责人：郭敏芳；山西省卫健委医学科技领军团队(2020TD05)，项目负责人：马存根；山西大同大学大学生创新创业训练计划项目(XDC2022174)，项目负责人：郭敏芳；山西大同大学基础研究项目(2022K17)，项目负责人：于婧文；山西省基础研究计划青年科学研究项目(20210302124276)，项目负责人：刘晓琴

Lycium barbarum polysaccharide regulates mitochondrial dynamics to improve H2O2-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

Wang Jiwei1, 2, Li Yanbing1, 2, Guo Minfang2, Meng Tao2, Yu Jingwen2, Liu Xiaoqin2, Mu Bingtao2, Jia Siwei1, 2, Ma Cungen1, 2, Yu Jiezhong1, 2, 3

1Research Center of Neurobiology/Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; 3Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China

Received:2023-12-05 Accepted:2024-03-14 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Yu Jiezhong, Professor, Doctoral supervisor, Research Center of Neurobiology/Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China; Co-corresponding author: Ma Cungen, Doctoral supervisor, Research Center of Neurobiology/Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
About author:Wang Jiwei, Master candidate, Research Center of Neurobiology/Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China Li Yanbing, Master candidate, Research Center of Neurobiology/Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China Wang Jiwei and Li Yanbing contributed equally to this article.
Supported by:
“Four Batches” Science and Technology Innovation Project of Shanxi Province in 2022, No. 2022XM33 (to YJZ); Shanxi Province Natural Science Research General Project No. 202303021211244 (to YJZ); Shanxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Scientific Research Project No.2023ZYYB2042 (to YJZ); Shanxi Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Construction project No. zyyyjs2024027 (to YJZ); Shanxi Basic Research Plan Project, No. 20210302123476, 20210302123478 (to GMF); Medical Science and Technology Leader Team of Shanxi Health Commission, No. 2020TD05 (to MCG); College Students Innovation Entrepreneurship Training Program of Shanxi Datong University, No. XDC2022174 (to GMF); Basic Research Project of Shanxi Datong University, No. 2022K17 (to YJW); Youth Scientific Research Project of Shanxi Basic Research Program, No. 20210302124276 (to LXQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

枸杞多糖：是从枸杞中提取而得的一种水溶性多糖，是枸杞子中的主要功效成分，具有抗氧化活性、抗肿瘤特性、免疫调节和神经保护等多种作用。
线粒体动力学：指在相关蛋白质的调控下，线粒体不断进行动态融合及分裂，从而完成形态变化进而维持线粒体网络结构整体稳定性的过程。线粒体结构的完整性是细胞生理活动及病理调控的功能基础。

摘要
背景：大量研究结果证明，神经退行性疾病与氧化应激损伤和线粒体动力学失衡密切相关。课题组前期研究表明枸杞多糖具有神经保护作用，但其能否通过调控线粒体动力学异常来改善氧化应激损伤引发的细胞凋亡尚不明确。
目的：研究枸杞多糖对过氧化氢诱导人源神经母瘤细胞SH-SY5Y凋亡的影响。
方法：将SH-SY5Y细胞分3组培养：对照组常规培养24 h，过氧化氢组加入过氧化氢处理24 h，枸杞多糖组加入枸杞多糖处理2 h后再加入过氧化氢处理24 h。处理结束后，采用试剂盒检测细胞沉淀中丙二醛、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平，JC-1试剂盒检测线粒体膜电位，MTT法检测细胞活力，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫荧光染色与Western Blot检测线粒体动力学相关蛋白(磷酸化启动蛋白1、线粒体分裂蛋白1、线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、视神经萎缩症蛋白1)与凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)表达。
结果与结论：①与对照组相比，过氧化氢组丙二醛水平升高(P < 0.05)，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平降低(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，枸杞多糖组丙二醛水平降低(P < 0.05)，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平升高(P < 0.05)；②过氧化氢组线粒体膜电位低于对照组(P < 0.05)，枸杞多糖组线粒体膜电位高于过氧化氢组(P < 0.05)；③与对照组相比，过氧化氢组细胞凋亡率与Bax、Caspase-3蛋白表达升高(P < 0.05)，细胞活力与Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，枸杞多糖组细胞凋亡率与Bax、Caspase-3蛋白表达降低(P < 0.05)，细胞活力与Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)；④与对照组相比，过氧化氢组磷酸化启动蛋白1、线粒体分裂蛋白1的蛋白表达升高(P < 0.05)，线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、视神经萎缩症蛋白1的蛋白表达降低(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，枸杞多糖组磷酸化启动蛋白1、线粒体分裂蛋白1的蛋白表达降低(P < 0.05)，线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、视神经萎缩症蛋白1的蛋白表达升高(P < 0.05)；⑤结果表明，枸杞多糖可通过调节线粒体动力学来改善氧化应激损伤诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

https://orcid.org/0009-0000-6086-1855 (王记委)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: lycium barbarum polysaccharides, oxidative stress, mitochondrial dynamics, neurodegenerative disease, apoptosis

Abstract: BACKGROUND: A large number of studies have shown that neurodegenerative diseases are closely related to oxidative stress injury and the imbalance of mitochondrial dynamics. Lycium barbarum polysaccharides have a neuroprotective effect. However, it is not clear whether lycium barbarum polysaccharides can ameliorate apoptosis induced by oxidative stress injury by regulating abnormal mitochondrial dynamics.
OBJECTIVE: To study the effect of lycium barbarum polysaccharides on apoptosis induced by H2O2 in SH-SY5Y human neuroblastoma cells.
METHODS: SH-SY5Y cells were cultured in three groups. The control group was cultured for 24 hours. The hydrogen peroxide group was treated with H2O2 for 24 hours, and the lycium barbarum polysaccharide group was treated with lycium barbarum polysaccharide for 2 hours and then treated with H2O2 for 24 hours. After treatment, the levels of malondialdehyde, glutathione, and superoxide dismutase in the precipitation of the cells were detected by kit. Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 kit. Cell viability was detected by MTT assay. Apoptosis was detected by TUNEL. The expression levels of mitochondrial dynamics-related proteins (phosphorylated promoter protein 1, mitochondrial fission protein 1, mitochondrial fusion protein 1, mitochondrial fusion protein 2, and optic atrophy protein 1) and apoptotic proteins (Bax, Bcl-2, and Caspase-3) were detected by immunofluorescence staining and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the levels of malondialdehyde were increased (P < 0.05), and the levels of superoxide dismutase and glutathione were decreased (P < 0.05) in the H2O2 group. Compared with the H2O2 group, the malondialdehyde level was decreased (P < 0.05), and the superoxide dismutase and glutathione levels were increased (P < 0.05) in the lycium barbarum polysaccharide group. (2) The mitochondrial membrane potential in the H2O2 group was lower than that in the control group (P < 0.05), and that of lycium barbarum polysaccharide group was higher than that of the H2O2 group (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the apoptosis rate and the expression of Bax and Caspase-3 protein were increased (P < 0.05), while the cell viability and the expression of Bcl-2 protein were decreased (P < 0.05) in the H2O2 group. Compared with the H2O2 group, the apoptosis rate and the expression of Bax and Caspase-3 protein were decreased (P < 0.05), while the cell viability and the expression of Bcl-2 protein were increased (P < 0.05) in the lycium barbarum polysaccharide group. (4) Compared with the control group, the protein expression levels of phosphorylated promoter protein 1 and mitochondrial fission protein 1 were increased (P < 0.05), and the protein expression levels of mitochondrial fusion protein 1, mitochondrial fusion protein 2, and optic atrophy protein 1 were decreased (P < 0.05) in the H2O2 group. Compared with the H2O2 group, the protein expression levels of phosphorylated promoter protein 1 and mitochondrial fission protein 1 were decreased (P < 0.05), and the protein expression levels of mitochondrial fusion protein 1, mitochondrial fusion protein 2, and optic atrophy protein 1 were increased (P < 0.05) in the lycium barbarum polysaccharide group. (5) These results indicate that lycium barbarum polysaccharide can improve SH-SY5Y cell apoptosis caused by oxidative stress damage by regulating mitochondrial dynamics.

Key words: 枸杞多糖, 氧化应激, 线粒体动力学, 神经退行性疾病, 细胞凋亡

中图分类号:

王记委, 李雁冰, 郭敏芳, 孟涛, 于婧文, 刘晓琴, 穆秉桃, 贾思玮, 马存根, 尉杰忠. 枸杞多糖调节线粒体动力学改善过氧化氢诱导 SH-SY5Y 细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2736-2743.

Wang Jiwei, Li Yanbing, Guo Minfang, Meng Tao, Yu Jingwen, Liu Xiaoqin, Mu Bingtao, Jia Siwei, Ma Cungen, Yu Jiezhong. Lycium barbarum polysaccharide regulates mitochondrial dynamics to improve H2O2-induced apoptosis of SH-SY5Y cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2736-2743.

图/表（结果） 2

2.1 枸杞多糖浓度和过氧化氢浓度筛选结果 MTT法检测结果显示，与对照组比较，0.5，1 g/L枸杞多糖处理后细胞活力提高(P < 0.05，P < 0.01)，1 g/L以上枸杞多糖处理后的细胞活力则降低(P < 0.001，P < 0.000 1)，见图1。因此，后续实验选择1 g/L枸杞多糖处理细胞。
MTT法检测结果显示，与对照组比较，200 μmol/L过氧化氢处理后细胞活力已降低到75%左右(P < 0.01)，200 μmol/L以上过氧化氢处理后细胞活力已降到70%以下(P < 0.01)，见图2，因此，后续实验选择250 μmol/L过氧化氢处理细胞。
2.2 枸杞多糖保护过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞活力 MTT检测结果显示，与对照组比较，过氧化氢组细胞活力降低(P < 0.000 1)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组细胞活力升高(P < 0.01)，见图3。
2.3 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞氧化应激指标的影响 与对照组比较，过氧化氢组谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平减少(P < 0.001，P < 0.000 1)，丙二醛水平增加(P < 0.01)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平增加(P < 0.001，P < 0.000 1)，丙二醛水平减少(P < 0.05)，见图4。
2.4 枸杞多糖保护过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞线粒体膜电位水平 观察免疫荧光染色结果显示，过氧化氢组绿色荧光最强而红色最弱，说明在细胞凋亡初期线粒体膜电位呈现减小的趋势；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组红色荧光强度升高而绿色荧光强度却降低；定量分析结果显示，对照组线粒体膜电位大于过氧化氢组(P < 0.000 1)，枸杞多糖组线粒体膜电位大于过氧化氢组(P < 0.001)，见图5，说明枸杞多糖治疗后对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位有保护作用。
2.5 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示，与对照组比较，过氧化氢组细胞凋亡数量增加(P < 0.000 1)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组细胞凋亡数量减少(P < 0.000 1)，见图6，表明枸杞多糖能够有效地抵御由过氧化氢引发的细胞凋亡现象。
2.6 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Western Blot检测结果显示，与对照组比较，过氧化氢组蛋白Bax和Caspase-3表达增加(P < 0.01，P < 0.000 1)，蛋白Bcl-2表达减少(P < 0.000 1)；与过氧化氢组相比，枸杞多糖组蛋白Bax和Caspase-3表达减少(P < 0.05，P < 0.001)，蛋白Bcl-2 表达增加(P < 0.01)，见图7。
免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，过氧化氢组Caspase-3 蛋白表达升高(P < 0.01)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组Caspase-3蛋白表达降低 (P < 0.05)，见图8，说明枸杞多糖能够改善过氧化氢诱导细胞凋亡蛋白的表达。
2.7 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞线粒体动力学相关蛋白表达的影响 免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，过氧化氢组分裂蛋白p-Drp1表达增加(P < 0.001)，融合蛋白Mfn1和OPA1表达减少(P < 0.000 1，P < 0.01)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组分裂蛋白p-Drp1表达减少 (P < 0.001)，Mfn1和OPA1表达增加(P < 0.001，P < 0.05)，见图9。
Western Blot检测结果显示，与对照组比较，过氧化氢组蛋白分裂蛋白p-Drp1和Fis1(P < 0.01，P < 0.001)，融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1表达减少(P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)；与过氧化氢组比较，枸杞多糖组p-Drp1和Fis1表达减少(P < 0.01)，Mfn1、Mfn2和OPA1(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.01)，见图10。通过免疫荧光染色和 Western Blot检测结果得出，枸杞多糖可以影响过氧化氢诱导细胞线粒体分裂和融合蛋白的表达。

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引言

氧化应激在各种神经退行性疾病的发病过程中扮演了关键角色，而且氧化应激与神经炎症、神经细胞坏死和凋亡密切有关[1-2]。在受到氧化应激损伤的神经元中，几乎线粒体功能的所有方面都发生了改变，包括参与呼吸链关键酶的活性降低、线粒体动力学和能量代谢的变化等[3-5]。
线粒体通过分裂和融合过程(线粒体动力学)改变其形状和大小，从而对外部损伤和代谢状态的变化做出反应[6-7]。而线粒体动力学失衡是线粒体功能障碍的主要途径[8-10]。当线粒体过度分裂的同时伴随线粒体融合的减少，可以导致活性氧产生增加，从而诱导氧化应激[11-12]。有研究表明，活性氧诱导的氧化应激可以导致神经元的凋亡和死亡[13-15]。也有研究表明，在线粒体的融合过程中可以观察到线粒体DNA的交换以及线粒体嵴的重新构建，这种现象有助于维护细胞的健康状态，防止其走向死亡[16-17]。然而，线粒体的分裂则被视为细胞凋亡和破碎的标志[18-19]。在多种神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿舞蹈病神经元中发现了线粒体分裂和/或融合过程的破坏[20-21]，因此，改善线粒体动力学和功能、抑制氧化应激可以预防和治疗神经退行性疾病。
枸杞，一种广受赞誉的中草药，具备众多药理及生物学特性，如神经系统的保护、抗氧化能力、延缓衰老进程、抑制细胞凋亡以及免疫系统的调控等[22-23]。枸杞多糖是从植物枸杞子中获得的一种生物活性成分，对多种细胞组织的氧化损伤具有保护作用[24-25]，还可以改善神经炎症、氧化应激、细胞死亡和细胞凋亡等，并且不良反应极小[26-27]。作者团队前期发现枸杞多糖可以减轻神经炎症反应，具有神经保护作用[28] ，但其能否通过调节细胞线粒体动力学来改善氧化应激损伤引起的细胞凋亡尚不清楚。此次实验采用适用于神经退行性疾病已分化的人神经母瘤细胞SH-SY5Y[29-30]，以过氧化氢为刺激的氧化应激损伤模式，探讨枸杞多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞对比观察实验，采用单因素方差分析来比较不同组之间的差异，进一步运用Dunnet-t检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年6月至2023年5月在大同大学脑科学研究所进行。
1.3 材料 已分化的人神经母瘤细胞SH-SY5Y由山西大同大学脑科学研究所提供；枸杞多糖(成都乐美天医药科技有限公司)；过氧化氢利尔康公司；MTT及丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、TUNEL试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；JC-1线粒体膜电位试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司)；RIPA 裂解液(博士德生物工程有限公司)；鼠抗 GAPDH (北京博奥森生物科技有限公司)；兔抗Bcl-2(美国Abclonal公司)；线粒体融合蛋白1)、山羊抗小鼠 IgG 、山羊抗兔 IgG(Alex Flour® 594)(美国 Abcam公司)；Bax、Caspase-3、兔抗磷酸化启动蛋白1、线粒体分裂蛋白1、线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、视神经萎缩症蛋白1抗体(美国CST公司)；二氧化碳培养箱和酶标仪(赛默飞世尔科技公司)；凝胶成像仪(美国 Bio-Rad 公司)；共聚焦显微镜(日本 Olympus 公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 在37 ℃的恒温水浴中复苏冷冻的SH-SY5Y细胞。将悬浮细胞置于包含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，700 r/min离心5 min，去上清，在10 mL培养基中进行细胞融合过程，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内。当细胞融合度达到80%时进行下一步繁殖，以便进行后续研究。
1.4.2 枸杞多糖质量浓度与过氧化氢浓度的筛选 枸杞多糖质量浓度筛选：采用96孔板培养SH-SY5Y细胞(100 μL)，细胞浓度为4×107 L-1，分7组处理：空白组只含有细胞培养液不含细胞，对照组不加入任何药物，实验组分别加入0.5，1，1.5，2，4 g/L的枸杞多糖，放入细胞培养箱中培育24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液继续孵育4 h，将100 μL Formazan溶液注入孔内充分混合。接下来，继续孵化4 h，利用酶标仪测量其吸光度的读数。使用软件Graphpad Prism 9.0计算细胞活力。
过氧化氢浓度筛选：采用96孔板培养SH-SY5Y细胞(100 μL)，细胞浓度为4×107 L-1，分8组处理：空白组只含有细胞培养液不含细胞，正常对照组不加入任何药物，实验组分别加入200，250，300，400，450 μmol/L的过氧化氢，处理24 h后，采用MTT法检测细胞活力，方法同上。
1.4.3 实验分组 将SH-SY5Y细胞悬液分3组处理：对照组常规培养24 h(不加入任何药物)，过氧化氢组加入250 μmol/L过氧化氢处理24 h[31-32]，枸杞多糖组加入1 g/L枸杞多糖处理2 h后再加入250 μmol/L过氧化氢处理24 h。
1.4.4 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞活力的影响 采用96孔板培养SH-SY5Y细胞，体积100 μL，细胞浓度为4×107 L-1，按1.4.3实验分组处理24 h，采用MTT法检测细胞活力，方法同上。
1.4.5 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响 采用6孔板培养SH-SY5Y细胞，细胞密度为1×105/孔，按1.4.3实验分组处理24 h，10 000 r/min离心10 min，弃上清，使用超微量分光光度计测量蛋白浓度。按照试剂盒说明书操作来测量谷胱甘肽、超氧化物歧化酶以及丙二醛的水平。
1.4.6 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 采用共聚焦培养皿培养SH-SY5Y细胞，细胞密度为1×104/皿，按1.4.3实验分组处理24 h，用PBS清洗1次，加入1 mL细胞培养液，再加入1 mL JC-1试剂盒经过20 min的工作液孵化过程后，使用特定的缓冲液进行清洗操作。接着，将2 mL细胞培养液加入其中，利用激光共聚焦显微镜进行详细的观测。
1.4.7 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响 采用24孔板培养SH-SY5Y细胞，细胞密度为1×104/孔，先加入0.1 mL细胞培养液放置爬片，随后加入0.9 mL细胞液，按1.4.3实验分组处理24 h，经过3次PBS清洗操作后，采用40 g/L的多聚甲醛固定，持续时间为30 min。然后，再次进行3次PBS清洗。接下来，将0.3%Triton X-100的PBS放入样本中，并在室温环境下孵育5 min。接着，再进行2次PBS清洗。加入TUNEL染色试剂盒专用检测溶液室温下继续孵育1 h。最后，使用含有DAPI的封固液进行封固处理，并在共聚焦显微镜下进行观察。
1.4.8 枸杞多糖对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡蛋白与线粒体动力学相关蛋白的影响

Western Blot检测凋亡和线粒体动力学相关蛋白表达：采用6孔板培养SH-SY5Y细胞，细胞密度为1×106/孔，按1.4.3实验分组处理24 h，加入RIPA溶液裂解细胞，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，测量蛋白质含量。将蛋白加热煮沸，通过电泳转膜处理，利用1×TBST溶液在摇床上洗膜3次，5 min/次；使用5%脱脂奶粉密封膜片2 h，在膜片上涂抹相应的抗体：线粒体融合蛋白1(1∶200)、线粒体融合蛋白2(1∶1 000)、视神经萎缩症蛋白(1∶1 000)、磷酸化启动蛋白(1∶1 000)、线粒体分裂蛋白1(1∶1 000)；Caspase3(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)将样本置于4 ℃环境下并进行过夜孵育。接着，采用1×TBST溶液在摇床上清洗膜3次，每次持续5 min。然后，按照一抗浓度加入相应的二抗室温下孵育2 h。再次使用1×TBST溶液在摇床上清洗膜3次，每次5 min。加入显影液，通过凝胶成像仪来观察蛋白的表达情况。同时，利用ImageLab软件进行定量分析。

免疫荧光染色检测凋亡和线粒体动力学相关蛋白表达：采用24孔板来培养SH-SY5Y细胞，细胞密度为1×104/孔，按1.4.3实验分组处理24 h，用40 g/L多聚甲醛进行30 min的固定处理，用PBS进行3次清洗。接着，将含有1%牛血清白蛋白和0.3%TritonX-100加入样本中，并进行1 h的封闭操作，分别加入线粒体融合蛋白1(1∶200)、视神经萎缩症蛋白(1∶1 000)、磷酸化启动蛋白(1∶1 000)及Caspase3(1∶500)抗体4 ℃孵育过夜，用PBS进行3次清洗。接在室温下将相应二抗加入样本中持续 2 h，加入DAPI封固液，共聚焦显微镜下观察。为了评估蛋白的荧光强度，使用Image-Pro Plus软件进行分析。
1.5 主要观察指标 各组SH-SY5Y细胞活力指数，细胞上清丙二醛、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的浓度，线粒体膜电位检测，细胞凋亡与凋亡相关蛋白表达，以及线粒体相关分裂与融合蛋白的表达。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9.0软件对所有的数据进行了统计学分析，每个实验都进行了3次独立的重复。为了对比不同组间的差异采用单因素方差分析，进一步组间比较运用Dunnet-t检验。当P < 0.05时认为差异有显著性的意义。该文统计方法已经过山西大同大学的统计专家团队的审查并获得批准。

讨论

神经退行性疾病是造成全球残疾的主要原因之一，由于其对老龄化社会的巨大影响而受到广泛关注[33-34]，这些疾病主要是基于神经元功能的不断恶化，导致脑萎缩，进而使人出现认知、行为和运动功能障碍，迄今为止，依然未能有特别好的方法预防和治疗[35]。在神经退行性疾病中，氧化应激可以通过多种途径使神经元功能改变促进疾病的发展[36]。氧化应激主要是自由基和抗氧化剂失衡所致，而自由基和活性氧的生成与线粒体关系密切[37-38]：线粒体功能障碍会导致活性氧和自由基大量生成，产生氧化应激，而氧化应激又可以导致线粒体的功能和形态被破坏，形成恶性循环，导致细胞凋亡或死亡，进而损伤神经元，诱发多种神经退行性疾病的发生[39-41]。目前临床治疗神经退行性疾病的药物效果不佳，而围绕线粒体功能和氧化应激治疗神经退行性疾病在近年来成为了焦点。
枸杞在传统中药中使用或作为烹饪食材已有1 000多年的历史，其能平衡体内的“阴”“阳”，养肝、明目和补肾等，自然生长在西北各省，尤以宁夏回族自治区的枸杞最优质。枸杞中的天然多糖被称作枸杞多糖，它具备多种生物活性，如抗炎、抗细胞凋亡以及抗氧化能力，这些特性使得枸杞多糖在预防和治疗各种疾病方面展现出显著的效果[42-50]。为进一步明确枸杞多糖对神经系统损伤的影响机制，作者使用SH-SY5Y细胞并利用了过氧化氢刺激构建氧化应激损伤模型，研究枸杞多糖如何影响氧化应激反应并提供保护，以及其潜在的生物学原理。在评估氧化应激的过程中，此次实验主要依赖于3个关键指标：丙二醛、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶。研究发现当面临氧化应激时，过氧化氢组引发丙二醛浓度的上升，同时，谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的浓度则呈现下降趋势；然而，当枸杞多糖处理后，观察到丙二醛浓度有所下降，而谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的浓度却有上升的迹象，证明枸杞多糖能够改变过氧化氢刺激所导致的氧化应激损伤。线粒体膜电位检测和TUNEL染色结果显示，过氧化氢诱导的氧化应激损伤能够诱导细胞凋亡，并且免疫荧光染色和 Western Blot检测结果也可看出过氧化氢刺激后细胞促凋亡蛋白如Bax和Caspase-3的表达量会显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低；而枸杞多糖治疗后，与过氧化氢组比较却恰恰相反，Bax、Caspase-3下降，Bcl-2上升，证明枸杞多糖能够抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡。
经过免疫荧光染色和Western blot分析，相较于对照组，过氧化氢组磷酸化启动蛋白1和线粒体分裂蛋白1表达升高，线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2和视神经萎缩症蛋白1表达降低，说明氧化应激损伤可能会引发线粒体的动力学失衡。而枸杞多糖治疗后能有效抑制线粒体分裂蛋白1和磷酸化启动蛋白1的表达，提升线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2 和视神经萎缩症蛋白1的蛋白表达，说明枸杞多糖可能通过调控线粒体动力学抵抗氧化应激损伤，防止细胞凋亡。
综上所述，枸杞多糖可通过调节线粒体动力学来改善氧化应激损伤诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，但枸杞多糖对于保护氧化应激造成损害过程以及其神经系统保护效应的研究仍有待深入挖掘。

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枸杞多糖调节线粒体动力学改善过氧化氢诱导 SH-SY5Y 细胞的凋亡

Lycium barbarum polysaccharide regulates mitochondrial dynamics to improve H2O2-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

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