Hopx 报告基因小鼠谱系示踪乳腺干细胞

doi:10.12307/2025.088

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2720-2727.doi: 10.12307/2025.088

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

Hopx 报告基因小鼠谱系示踪乳腺干细胞

石建云1，李文静1，彭映1，贾振华1，张书锦1，谭露露1，原一桐2，杜若琛2

1山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室，内分泌代谢病山西省重点实验室，山西医科大学生理学系，山西省太原市 030001；2山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室，山西医科大学动物中心，山西省太原市 030001

收稿日期:2024-01-02 接受日期:2024-05-16 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 杜若琛，博士，讲师，硕士生导师，山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室，山西医科大学动物中心，山西省太原市 030001
作者简介:石建云，女，1988年生，山西省太原市人，汉族，中国农业大学毕业，博士，副教授，硕士生导师，主要从事组织损伤修复再生的机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82002063)，项目负责人：石建云；山西省青年科学基金项目(201901D211316， 201901D211319，20210302124172)，项目负责人：石建云，原一桐，杜若琛；山西省级博士启动基金项目(SD1809)，项目负责人：石建云；山西医科大学校级博士启动基金项目(XD1809)，项目负责人：石建云；内分泌代谢病山西省重点实验室开放基金项目(202104010910009)，项目负责人：石建云

Lineage tracing for mammary stem cells using Hopx reporter mice

Shi Jianyun1, Li Wenjing1, Peng Ying1, Jia Zhenhua1, Zhang Shujin1, Tan Lulu1, Yuan Yitong2, Du Ruochen2

1Key Laboratory of Cellular Physiology at Shanxi Medical University, Ministry of Education, Endocrine and Metabolic Diseases Key Laboratory of Shanxi Province, and Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Key Laboratory of Cellular Physiology at Shanxi Medical University, Ministry of Education, and Laboratory Animal Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2024-01-02 Accepted:2024-05-16 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Du Ruochen, MD, Lecturer, Master’s supervisor, Key Laboratory of Cellular Physiology at Shanxi Medical University, Ministry of Education, and Laboratory Animal Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Shi Jianyun, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Cellular Physiology at Shanxi Medical University, Ministry of Education, Endocrine and Metabolic Diseases Key Laboratory of Shanxi Province, and Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82002063 (to SJY); Shanxi Province Science Foundation for Youths, No. 201901D211316, 201901D211319, 20210302124172 (to SJY, YYT, DRC); Shanxi Provincial Doctoral Start-up Fund Project, No. SD1809 (to SJY); a grant from Science Research Start-up Fund for Doctor of Shanxi Medical University, No. XD1809 (to SJY); a grant from Endocrine and Metabolic Diseases Key Laboratory of Shanxi Province, No. 202104010910009 (to SJY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

乳腺干细胞：属于成体干细胞的一种，是指处于静止状态但能够进行自我更新且具有分化形成有功能乳腺的一种细胞类型，在乳腺组织的发育和稳态维持过程中发挥十分重要的功能。
细胞谱系示踪：是指利用包含诱导性重组酶Cre/loxp系统在内的各种方式对细胞进行标记，从而对包括其后代所有的细胞增殖与分化情况以及细胞迁移等活动实现定时定点的追踪和观察。

摘要
背景：乳腺干细胞对于乳腺组织的发育和稳态维持十分重要。乳腺癌的发生与乳腺干细胞有着紧密联系。最新研究表明，Hopx作为形态发生和细胞分化的重要转录调节因子已被证实在神经、肠道、毛囊等多种成体干细胞中表达，然而其在乳腺中的作用至今尚未见报道。
目的：探究Hopx是否可以作为乳腺干细胞的特异性标志物。
方法：①选取8周龄雌性Hopx-LacZ转基因小鼠，利用β-半乳糖苷酶染色检测Hopx在乳腺组织中的本底表达情况。②选取4周龄、6周龄、8周龄及妊娠14.5 d的雌性野生型小鼠，分别进行乳腺全组织洋红染色及K14、K8免疫荧光染色。③选取8周龄与妊娠17.5 d的雌性Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠，进行乳腺β-半乳糖苷酶染色。④选取4周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠，通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次，注射3次)来激活Cre/loxp系统，注射后4周进行乳腺β-半乳糖苷酶染色；选取8周龄雌性Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠，通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次，注射3次)来激活Cre/loxp系统，末次注射后4，10周进行乳腺β-半乳糖苷酶染色。⑤选取8周龄雌性Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠，通过腹腔注射他莫昔芬(隔天注射1次，注射3次)来激活Cre/loxp系统，注射后2周使Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠怀孕，对第1次妊娠17.5 d、第3次妊娠17.5 d的小鼠乳腺组织进行β-半乳糖苷酶染色。
结果与结论：①β-半乳糖苷酶染色结果显示，8周龄Hopx-LacZ转基因小鼠的乳腺导管内确实含有Hopx阳性细胞且位于基底上皮，数量较少。②乳腺全组织染色及免疫荧光染色结果显示，野生型小鼠的乳腺在青春期、成熟期及妊娠期等不同发育阶段具有各自相应时期依赖性的特征，并且经历了一系列复杂的上皮重塑过程。③β-半乳糖苷酶染色结果显示，与8周龄雌性Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠相比，妊娠17.5 d的Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠乳腺导管内Hopx标记阳性细胞增多。④β-半乳糖苷酶染色结果显示，4，8周龄雌性Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠他莫昔芬注射后的乳腺Hopx标记阳性细胞位于基底上皮，数量较少。⑤β-半乳糖苷酶染色结果显示，第1次妊娠17.5 d、第3次妊娠17.5 d的小鼠乳腺内的Hopx标记阳性细胞位于腺泡周围的基底上皮，数量较多，并且第3次妊娠17.5 d的Hopx标记阳性细胞数量更多。⑥结果表明，Hopx报告基因标记的细胞为休眠乳腺干细胞，负责妊娠期间乳腺的生长，对腺泡形成有贡献。

https://orcid.org/0000-0001-7520-9237 (石建云)；https://orcid.org/0000-0002-3221-0083 (杜若琛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: Hopx, 乳腺干细胞, 谱系追踪, 妊娠期, 腺泡形成

Abstract: BACKGROUND: Mammary stem cells are vital for the development and homeostasis of mammary gland tissue. The occurrence of breast cancer has a close relationship with the mammary stem cells. Recent studies have shown that Hopx, as an important transcriptional regulator of morphogenesis and cell differentiation, has been confirmed to be expressed in a variety of adult stem cells such as nerves, intestines, hair follicles and lungs. However, its role in mammary stem cells has not been reported so far.
OBJECTIVE: To investigate whether Hopx expression marks mammary stem cells.
METHODS: (1) Female Hopx-LacZ transgenic mice aged 8 weeks were selected to detect the background expression of Hopx in breast tissue by β-galactosidase staining. (2) Female wild-type mice at 4, 6, and 8 weeks of age and 14.5 days of gestation were selected for whole-tissue magenta staining and K14 and K8 immunofluorescence staining, respectively. (3) Female Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ transgenic mice aged 8 weeks and 17.5 days of gestation were selected and stained with breast β-galactosidase. (4) The 4-week-old female Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ transgenic mice were selected. The Cre/loxp system was activated by intraperitoneal injection of tamoxifen (once every other day, three times), and breast β-galactosidase staining was performed 4 weeks after injection. The 8-week-old female Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ transgenic mice were selected. The Cre/loxp system was activated by intraperitoneal injection of tamoxifen (once every other day, three times), and breast β-galactosidase staining was performed 4 and 10 weeks after the last injection. (5) Female Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ transgenic mice aged 8 weeks were selected. The Cre/loxp system was activated by intraperitoneal injection of tamoxifen (once every other day, three times). Hopx-CreERT2;Rosa26LacZ transgenic mice were pregnant 2 weeks after injection. The mammary tissue of mice at 17.5 days of the first pregnancy and 17.5 days of the third pregnancy was stained with β-galactosidase.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of β-galactosidase staining showed that the mammary ducts of Hopx-LacZ transgenic mice at 8 weeks of age did contain Hopx-positive cells and were located in the basal epithelia, with a small number. (2) Whole-mount staining of mammary glands and immunofluorescence staining results exhibited that the mammary glands of mice had different characteristics with corresponding developmental stages such as puberty, maturity, and pregnancy, and underwent a series of complex epithelial remodeling processes. (3) The results of β-galactosylase staining showed that Hopx-labeled positive cells in the mammary duct of Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ transgenic mice at 17.5 days of gestation increased compared with female Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ transgenic mice at 8 weeks of age. (4) The results of β-galactosylase staining showed that the Hopx-labeled positive cells in the mammary glands of 4- and 8-week-old female Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ transgenic mice after tamoxifen injection were located in the basal epithelium with a small number. (5) The results of β-galactosidase staining showed that Hopx-labeled positive cells in the mammary glands of mice at 17.5 days of the first and third gestation were located in the basal epithelia around the alveoli, and the number of Hopx-labeled positive cells at 17.5 days of the third gestation was more. (6) In conclusion, Hopx reporter-marked basal epithelial cells belong to dormant mammary stem cells, which are responsible for the growth of the mammary glands during pregnancy and contribute to acinar formation.

Key words: Hopx, mammary stem cell, lineage tracing, gestational period, acinar formation

中图分类号:

石建云, 李文静, 彭映, 贾振华, 张书锦, 谭露露, 原一桐, 杜若琛. Hopx 报告基因小鼠谱系示踪乳腺干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2720-2727.

Shi Jianyun, Li Wenjing, Peng Ying, Jia Zhenhua, Zhang Shujin, Tan Lulu, Yuan Yitong, Du Ruochen. Lineage tracing for mammary stem cells using Hopx reporter mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2720-2727.

图/表（结果） 3

2.1 不同发育时期的乳腺结构 如图1A所示，青春期(4-6周龄)野生型小鼠的乳腺导管末端为膨大的末端乳芽结构，并且导管刚延伸至淋巴结附近并未布满整个脂肪垫；成熟期时(8周)，野生型小鼠的乳腺导管分支变多并出现大量次级分支，且并能够布满整个脂肪垫；妊娠期时，野生型小鼠乳腺进一步发育形成腺泡结构。K14标记的为基底上皮细胞，K8标记的为腔上皮细胞。实验进一步通过免疫荧光染色分析观察基底上皮细胞和腔上皮细胞分别在乳腺导管(来源于4周龄和8周龄小鼠)、末端乳芽结构(来源于6周龄小鼠)和腺泡结构(来源于妊娠期小鼠)中的分布情况，见图1B。综合以上结果表明，小鼠乳腺在青春期、成年期及妊娠期等不同发育阶段经历了一系列复杂的上皮重塑过程，并且具有各自相应时期依赖性的特征。
2.2 Hopx的表达标记了一小群乳腺干细胞 8周龄雌性Hopx-LacZ转基因小鼠腹股沟处第四对乳腺β-半乳糖苷酶染色结果显示，乳腺导管中确实含有Hopx阳性细胞(蓝色)且大多数位于基底上皮，但数量较少，见图2。
采用雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠模型来示踪Hopx在乳腺组织中的表达情况，小鼠构建方式如图3A所示。8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠肠道β-半乳糖苷酶染色结果显示，肠道中出现了Hopx报告基因标记的细胞，见图3B，表明雌性Hopx报告基因小鼠可以作为有效的谱系追踪工具小鼠。8周龄及妊娠17.5 d的雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠乳腺β-半乳糖苷酶染色结果显示，妊娠期小鼠乳腺导管蓝色着色较深，表明Hopx阳性细胞数量较多，见图3C。以上结果表明Hopx标记了一种少见的乳腺上皮细胞群，并且可能在妊娠期时数量增多。

2.3 稳态下Hopx报告基因标记的基底上皮细胞对乳腺上皮作用有限 8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠他莫昔芬诱导后4 周和10 周的乳腺β-半乳糖苷酶染色结果显示，Hopx报告基因标记的细胞属于基底上皮细胞，但数量较少，见图4A-D。4周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因雌性小鼠他莫昔芬诱导4周后的乳腺β-半乳糖苷酶染色结果显示，Hopx报告基因标记的细胞同样位于基底上皮，数量也较少，见图4E，F。综合以上结果表明，稳态时Hopx阳性基底上皮细胞对于乳腺上皮细胞的更替作用局限。

2.4 Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在妊娠期显著促进乳腺腺泡的形成和发育 Hopx报告基因标记的基底上皮细胞对于稳态时乳腺上皮细胞的作用局限，进一步试图探索Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在妊娠期间的作用。8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠他莫昔芬诱导后第1次妊娠17.5 d时，β-半乳糖苷酶染色结果显示Hopx报告基因标记的阳性细胞大多位于腺泡周围的基底上皮，数量大幅度增加，并且他莫昔芬诱导后第3次妊娠17.5 d的Hopx阳性细胞比第1次妊娠17.5 d更多，
见图5。
综合以上结果表明，Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在妊娠期被激活，并参与促进妊娠期乳腺腺泡的形成和发育过程。

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引言

近年来，成体干细胞在肠道、神经、乳腺、皮肤等组织中的功能相继被发现，并且成体干细胞对于组织器官的发育和组织稳态的维持十分重要。在生命过程中，组织特异性干细胞能够保持自我复制的能力，并且具有分化成为该组织所有细胞类型的潜能，因此这类细胞自我更新能力强且具有多向分化的特点。乳腺作为出生后发育的组织在成体干细胞的研究应用中具有很大优势。小鼠的乳腺干细胞已经被证实能够重建形成完整的乳腺[1]。对于雌性哺乳动物来讲，乳腺干细胞在青春期、妊娠期、泌乳期和泌乳退化期的不同发育时期中均有着重要生理作用[2-3]，因此乳腺干细胞对于乳腺的发育、分化和生理功能维持十分重要。此外越来越多的研究发现，乳腺癌的发生与乳腺干细胞有着紧密联系，已有研究报道指出乳腺干细胞是导致乳腺癌发生的罪魁祸首[4-5]。因此，探究乳腺干细胞的特异性标记物对于更好地了解乳腺干细胞的特征，以及对于乳腺癌的防治具有重要意义，然而乳腺干细胞的特异性标记物截止到目前仍是比较局限的。
从胚胎期、青春期发育到成年期及生殖期等生命过程中的不同阶段，乳腺组织经历了一系列复杂的上皮重塑[6]。出生时，腺体只是停留于一个基本的结构，直到青春期；随着青春期开始，雌激素和生长激素水平增加，从而促进乳腺上皮细胞的快速增殖，形成填充脂肪垫的乳腺导管树，并且导管末端具有高度增殖的末端乳芽结构[6]；成熟期时，乳腺组织布满整个脂肪垫且具有多级分支的导管结构，主要由外层基底上皮细胞和内层管腔上皮细胞组成；妊娠期时，在孕酮和泌乳素的作用下乳腺上皮细胞逐渐形成腺泡芽，进而分化为腺泡结构，在哺乳期分泌乳汁。在这个过程中，基底上皮细胞和管腔上皮细胞在导管分支和发育中的腺泡内迅速分裂，管腔腺泡细胞形成球形单层结构，周围是基底收缩性肌上皮细胞的篮状结构[7]。虽然ASSELIN-LABAT等[8]已报道妊娠期时基底肌上皮细胞的数量显著增加，但基底乳腺干细胞如何驱动腺泡周围收缩篮状结构发挥生物学功能的分子机制仍有待进一步探究。
Homebox(Hopx)基因是形态发生和细胞分化的重要转录调节因子[9]，已经被证实在胚胎和多种组织的成体干细胞中有表达。ASANOMA等[10]的研究证实Hopx在胎盘发育中发挥作用，并且在E8.5-E9.5野生型小鼠胎盘滋养细胞干细胞中检测到Hopx的表达。Hopx在体内被证实通过CXCL12途径维持造血干细胞的静息态[11]。除此之外，Hopx还被证实在神经、肠道、毛囊和肺等多种成体干细胞中均有表达[12-15]，这也预示着Hopx在外胚层、中胚层和内胚层组织中均发挥着重要功能。然而，Hopx在乳腺干细胞中的表达及其发挥的生物学作用至今仍尚未阐明。此外，Hopx在头颈部鳞癌、胃癌、结肠癌、肺癌以及食管癌等多种类型肿瘤的发生与进展中起着重要作用，Hopx被认为是肿瘤抑制基因，并且其启动子甲基化是其作为抑癌基因下调的主要分子机制[16-22]。KIKUCHI等[23]发现Hopx的表观沉默有作为临床上治疗乳腺癌预后标志的潜力。因此，此次实验利用Hopx-LacZ及Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ转基因小鼠，采用谱系示踪的方法，旨在探究Hopx报告基因标记的细胞在乳腺发育过程中的功能，为乳腺干细胞的新型特异性标记物的发现及乳腺癌的防治提供新的理论依据和研究思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物实验，多组间差异比较采用单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验。
1.2 时间及地点 实验于2021年1月至2023年3月在山西医科大学基础医学院生理学教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 雌性野生型小鼠，4周龄7只，体质量(15±2) g，其中3只小鼠取腹股沟第四对乳腺(一侧用于做全组织洋红染色，一侧用于免疫荧光染色)，2只用于乳腺全组织洋红染色，2只用于乳腺组织免疫荧光染色；6周龄5只，体质量(17±1) g，取腹股沟第四对乳腺，一侧用于全组织洋红染色，一侧用于免疫荧光染色；8周龄10只，体质量(20±2) g，其中5只用于乳腺全组织洋红染色，5只用于乳腺免疫荧光染色；妊娠期14.5 d小鼠9只(源自8周龄，与野生型小鼠交配)，其中1只小鼠取腹股沟第四对乳腺(一侧用于全组织洋红染色，一侧用于免疫荧光染色)，4只用于乳腺全组织洋红染色，4只用于乳腺免疫荧光染色。
雌性Hopx-LacZ转基因小鼠，8周龄3只，体质量(20±2) g。
雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠，4周龄3只，体质量(15±2) g；8周龄9只，体质量(20±2) g；妊娠期小鼠9只(源自8周龄，与野生型小鼠交配)。
以上小鼠均购自江苏集萃药康(Gempharmatech Co.，Ltd.)生物科技有限公司，许可证号：SCXK(苏)2023-0009。所有动物研究均严格依据国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的标准开展，在山西医科大学动物中心屏障环境中饲喂和进行[SYXK(晋)2019-0007]。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家相关法规。实验方案通过山西医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号：SYDL2021018)。
1.3.2 实验试剂与仪器设备 基因组 DNA 提取试剂饱和酚、乙醇、SDS、戊二醛、EGTA、MgCl2、脱氧胆酸钠等购自国药集团有限公司；他莫昔芬(T5648)和β-半乳糖苷酶(V900468)购自Sigma；蛋白酶K(P1120)、DNA 聚合酶(M1665S)、琼脂糖试剂均购自索莱宝(Solarbio)科技有限公司；PCR相关试剂(CW0682)、核酸染料(CW2635)、DNA Marker(CW2583)购自康为世纪(Cwbiotech)有限公司；免疫染色相关试剂购自中杉金桥(Zsbio)有限公司；基因型鉴定引物与定量引物均由生工生物工程(Sangon)有限公司合成；凝胶成像仪购自美国的Bio-rad公司；PCR 扩增仪购自中国的东胜创新公司；核酸电泳仪购自中国的北京六一仪器厂；超纯水机购自美国的Millipore公司；荧光倒置显微镜购自OLYMPUS公司。
1.4 方法
1.4.1 引物设计及合成 利用Primer 5软件设计引物，所有基因型鉴定引物以及定量PCR引物均由生工生物工程有限公司负责合成，基因型鉴定引物序列见表1。

1.4.2 基因组提取与基因型鉴定 剪取一小段小鼠尾巴置于离心管中，采用酚-氯仿抽提方法对小鼠尾尖全基因组DNA进行提取，详细实验操作的方法按照试剂盒相应说明书进行。随后以提取的小鼠基因组DNA来作为模板，使用Taq酶进行 PCR 扩增反应，从而鉴定小鼠基因型[24]。

1.4.3 不同发育时期的乳腺结构 乳腺细胞在出生时就存在，在激素的作用下青春期乳腺中高度增殖的末端乳芽结构主导使得上皮导管细胞向乳腺脂肪垫不断扩张。成年小鼠的乳腺上皮由多分支导管结构所形成，导管又包含外层基底上皮细胞和内层管腔上皮细胞。妊娠期伴随着不同的激素变化使得乳腺导管分支末端的管腔细胞进一步分化，从而形成能够分泌乳汁的腺泡状细胞。断奶后，乳腺结构经过细胞死亡和基质重塑又退化成为类似于成年乳腺静止状态的结构。
取雌性野生型小鼠，4周龄7只，6周龄5只，8周龄10只，妊娠14.5 d小鼠9只，异氟烷吸入性麻醉后获取乳腺组织，分别进行全组织洋红染色与K14/K8免疫荧光染色。
1.4.4 Hopx表达标记一小群乳腺干细胞 为了更好地探究Hopx基因是否能够作为标记乳腺干细胞的特异性标志物，首先采用Hopx-LacZ转基因小鼠模型，该小鼠组织细胞中LacZ报告基因的表达是稳定的，不会受到区域位置的影响而随机表达，因此以8周龄雌性Hopx-LacZ转基因小鼠作为研究对象来检测乳腺组织中Hopx基因的本底表达情况。异氟烷吸入性麻醉后，获取3只Hopx-LacZ转基因小鼠腹股沟处第四对乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
随后又采用Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠模型，进一步采用谱系追踪的方法来示踪Hopx在乳腺组织中的表达情况。STEWART等[13]证实Hopx可以作为肠道干细胞的特异性标记物，因此为了验证Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠的追踪效率，对3只8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠腹腔注射玉米油稀释后的他莫昔芬(4 mg/25 g)用以激活Cre/loxp系统，隔天注射1次，共注射3次，注射完成后异氟烷吸入性麻醉，获取肠道组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
为了进一步更好地检测Hopx在乳腺中的表达情况，取8周龄及妊娠17.5 d的雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠各3只，异氟烷吸入性麻醉获取腹股沟处第四对乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
1.4.5 稳态下Hopx报告基因标记的基底上皮细胞对乳腺上皮的作用 为了进一步探究Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在稳态情况下对体内乳腺上皮的贡献，使用6只8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠进行谱系追踪实验。对6只小鼠腹腔注射他莫昔芬(4 mg/25 g)用以激活Cre/loxp系统，隔天注射1次，共注射3次，末次注射后4周(n=3)和10周(n=3)，异氟烷吸入性麻醉获取乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
青春期时，乳腺的发育由于受到雌激素和生长激素调节在脂肪垫扩张性地进行增殖[25]，因此，实验选取4周龄青春期雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠3只，腹腔注射他莫昔芬(4 mg/25 g)用以激活Cre/loxp系统，隔天注射1次，共注射3次，末次注射后4周异氟烷吸入性麻醉，获取乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
1.4.6 Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在妊娠期乳腺腺泡的形成和发育中的作用 选取8周龄雌性Hopx-creERT2;Rosa26LacZ转基因小鼠6只，腹腔注射他莫昔芬(4 mg/25 g)用以激活Cre/loxp系统，隔天注射1次，共注射3次，注射后2周与野生型雄性小鼠合笼并进行交配，直至其怀孕，其中3只在第1次妊娠17.5 d时异氟烷吸入性麻醉，获取乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色；另3只在第3次妊娠的17.5 d时异氟烷吸入性麻醉，获取乳腺组织，进行β-半乳糖苷酶染色。
1.4.7 检测方法
乳腺全组织洋红染色：采集小鼠完整的乳腺组织并将其于干净玻片上进行铺展，使用卡诺固定液固定乳腺全组织约2 h，使用体积分数70%乙醇漂洗乳腺组织约15 min，使用蒸馏水漂洗乳腺组织5 min，浸泡于洋红染液中室温下过夜浸染，依次使用体积分数70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇分别处理15 min，使用二甲苯透明处理15 min，使用中性树胶封固，显微镜下拍照观察并记录。
β-半乳糖苷酶染色：获取小鼠完整的乳腺组织与肠道组织后，使用4 ℃预冷固定液固定约2 h，用洗液于室温下漂洗3次，每次30 min；使用β-半乳糖苷酶染液于37 ℃摇床(50-60 r/min)中浸染48 h，使用PBS漂洗3次，每次约15 min；使用40 g/L多聚甲醛室温固定2 h，按常规操作程序制作石蜡包埋块并切片处理，使用核固红染液对切片进行衬染，使用蒸馏水漂洗，依次使用梯度乙醇和二甲苯进行脱水处理，采用中性树胶封固，显微镜下拍照观察并记录。
K14/K8免疫荧光染色：小鼠乳腺组织经40 g/L多聚甲醛固定2 h，脱水包埋，用石蜡切片机切片5 μm厚，经过二甲苯和梯度乙醇脱蜡处理；柠檬酸钠(pH=6.0)处理后使用微波炉进行加热，便于抗原修复，自然冷却后使用PBS漂洗3次，每次约5 min；使用5%牛血清白蛋白室温下封闭处理1 h，弃掉封闭液，加入一抗K14(1∶100)和K8(1∶100)于4 ℃ 孵育过夜；次日将一抗弃掉，用PBS漂洗3次，每次约5 min；加入Alexa Fluor 594羊抗兔/Alexa Fluor 488羊抗小鼠 IgG (H+L)二抗室温下避光孵育1 h，用PBS漂洗3次，每次约5 min；加DAPI染液室温下避光孵育5 min，用PBS漂洗3次，每次约5 min；使用荧光抗淬灭剂进行封固，显微镜下拍照观察并记录。
1.5 主要观察指标 ①不同发育时期小鼠乳腺组织的结构特点；②Hopx在小鼠乳腺组织中的本底表达情况；③Hopx-CreERT2; Rosa26LacZ谱系追踪小鼠的有效性；④Hopx在稳态时小鼠乳腺中的表达与功能；⑤Hopx在妊娠期时小鼠乳腺中的表达与功能。
1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件和GraphPad Prism 9.3软件进行全部统计学分析。数据采用x±s表示，应用单因素方差分析(ANOVA)及t检验分析组间差异，检验水准参照P < 0.05。该文统计学方法已经过山西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

此次实验初步确定了Hopx报告基因标记的基底上皮细胞是休眠的乳腺干细胞，这群细胞对稳态时乳腺上皮的作用有限，然而其在妊娠期间驱动着腺泡周围基底收缩性肌上皮细胞类型的篮状结构形成，对妊娠期时乳腺腺泡的形成和发育有很大贡献，见图6。

乳腺干细胞的深入研究不仅对于哺乳动物乳腺发育、乳业生产有很重要的影响，而且对于临床医学上乳腺再生和乳腺癌的防治等方面都有非常重要的生理学意义。理论上，通过人体乳腺干细胞可以使得乳腺再生，在乳房切除后的乳房再造手术及隆胸手术中具有广阔的应用前景；此外，乳腺干细胞的研究还有助于进一步深入了解乳腺癌细胞如何获得干性及其在肿瘤发生发展过程中的功能，因而对临床医学上乳腺癌的防治也可以提供一定的理论基础。
截止到目前，乳腺干细胞的研究已经比较深入，并且已有多种类型的方法应用到了乳腺干细胞的研究中，例如采用细胞表面特异性的标记物、谱系追踪技术实现定时定点的标记等多种在体实验技术，均在探究乳腺干细胞(特别是小鼠乳腺干细胞)的功能中得以广泛应用。据报道，哺乳动物的乳腺上皮谱系大多与小鼠有着众多相似的特征，由于目前小鼠模型的研究相对来说较为透彻，因而可以为其他物种的乳腺干细胞研究提供一定的思路。
乳腺由于其上皮形态发生在出生之后，因此具有独特之处[26]，从胚胎期、青春期、成年期及妊娠期等不同发育阶段，乳腺经历了一系列复杂的上皮重塑过程[27]。越来越多的证据表明乳腺干细胞具有多样性[28]。Axin2、Lgr5和K5启动子驱动的谱系追踪实验结果表明，存在长期存活的基底特性单能祖细胞，这群单能祖细胞可以驱动出生后乳腺的形态发生和稳态下成年期基底细胞的补充[29-31]。在Lgr5、K5、Dll1和Procr启动子驱动的谱系追踪实验结果分析中也证实了成年期乳腺中双能基底细胞的存在[32-34]。研究表明，妊娠期间基底上皮细胞的显著扩增是由不同乳腺干细胞亚群推动的[32-33]。虽然人们已经知道妊娠期基底肌上皮细胞的数量增加了许多倍，但基底乳腺干细胞在驱动收缩的篮状结构中的相关作用机制仍亟待进一步探究。已有文献报道休眠乳腺干细胞在妊娠期可以被激活，例如：FU 等[35]的研究证实Lgr5+ Tspan8high细胞属于近端区域的休眠乳腺干细胞，在妊娠期受卵巢激素影响而激活；CAI等[36]的研究发现乳腺干细胞休眠的内在调节因子Bcl11b在妊娠期表达下调，而在稳态时小部分休眠的乳腺干细胞却反而高表达Bcl11b，这些均为静止的乳腺干细胞在妊娠期间可以被激活的有力证据。
Hopx基因是形态发生和细胞分化的重要转录调节因子，最初被证实是一种不寻常的同源结构域蛋白，对心脏的生长和发育发挥着重要的调节作用[37-38]。除此之外，Hopx已经被证实在多种组织的成体干细胞中有表达。Hopx在体内被证实通过CXCL12途径维持造血干细胞的静息态[11]。LIN等[39]的研究证实Hopx的高表达预示着急性粒细胞白血病的不良预后，这预示着Hopx在中胚层组织也发挥着重要功能。此外，Hopx被发现在发育中的气道中表达，并且通过作用于Nkx2.1和GATA6的下游，从而负性调节表面活性蛋白的表达[40]。TAKEDA等[41]的研究证实Hopx是肠道中一种新的+4位置细胞的特异性标记物，Hopx+的细胞可以产生隐窝基部柱状细胞和所有种类的成熟肠上皮细胞。以上证据表明Hopx在内胚层发挥重要功能。除此之外，LI等[12]研究发现Hopx在成年海马中静止的神经干细胞群中表达，而在侧脑室的增殖区不表达；TAKEDA等[14]研究证实成熟毛球下部中的Hopx+细胞逃脱了原毛球的凋亡，并且在随后的静止期产生K6+微环境细胞，这些均指示Hopx在外胚层发挥重要功能。目前关于Hopx在乳腺发育与乳腺疾病方面的研究较少，仅有少量文献报道Hopx的表观沉默有作为临床上治疗乳腺癌的预后标志的潜力[23，42]，然而Hopx在乳腺发育中的生物学功能至今仍尚未阐明。乳腺干细胞已被揭示在乳腺癌、乳腺炎等的疾病治疗以及乳腺组织损伤修复中有着潜在的应用价值，因此寻求乳腺干细胞的新型标志物十分重要[43-46]。
此次实验发现Hopx的表达标记着一种罕见的乳腺上皮细胞，并且以基底上皮细胞类型为主；Hopx报告基因标记的基底上皮细胞是相对休眠的乳腺干细胞，在稳态时作用有限，然而这群Hopx报告基因标记的基底上皮细胞在妊娠期却大量增加，并且对于乳腺腺泡结构的形成和发育有贡献，多胎妊娠更有利于其调动。综上，此次研究初步通过谱系追踪发现了一类新的以Hopx表达为标志的特异性基底乳腺上皮细胞群，在妊娠期对乳腺腺泡的形成和发育有贡献，为乳腺腺泡的形成相关机制提供了新的科学依据，关于该细胞群的生理特性与功能仍需开展进一步深入探究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Hopx 报告基因小鼠谱系示踪乳腺干细胞

Lineage tracing for mammary stem cells using Hopx reporter mice

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