耐力训练大鼠抗动脉粥样硬化线粒体自噬通路中抗增殖蛋白2的作用

doi:10.12307/2025.343

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2294-2300.doi: 10.12307/2025.343

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耐力训练大鼠抗动脉粥样硬化线粒体自噬通路中抗增殖蛋白2的作用

宋明箫1，陈君顺子1，2，王宁伟1，蔡欢1，冯红1

1天津体育学院运动健康学院，天津市 301617；2贵阳学院体育学院，贵州省贵阳市 550005

收稿日期:2024-03-05 接受日期:2024-04-28 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-10
通讯作者: 冯红，博士，教授，天津体育学院运动健康学院，天津市 301617
作者简介:宋明箫，女，1997年生，山西省运城市人，汉族，2022年天津体育学院毕业，硕士，主要从事运动生理学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(31470061)，项目负责人：冯红

Role of prohibitin 2 in mitophagy pathway against atherosclerosis in rats undergoing endurance training

Song Mingxiao1, Chen Junshunzi1,2, Wang Ningwei1, Cai Huan1, Feng Hong1

1School of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China; 2School of Physical Education, Guiyang University, Guiyang 550005, Guizhou Province, China

Received:2024-03-05 Accepted:2024-04-28 Online:2025-04-18 Published:2024-08-10
Contact: Feng Hong, PhD, Professor, School of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China
About author:Song Mingxiao, Master, School of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 31470061 (to FH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
抗增殖蛋白2(Prohibitin2，PHB2)：是序列高度保守的抗增殖蛋白家族中的一员，在哺乳动物中与PHB1以二聚体的形式定位于线粒体内膜。在线粒体自噬中抗增殖蛋白2可通过独立或依赖于PINK1-Parkin通路与自噬接头蛋白结合，调控线粒体自噬的发生。
动脉粥样硬化：是一种大动脉疾病，目前发病原因尚未完全清楚，主要表现为动脉壁的增厚、变硬并失去弹性，病理特征为动脉内纤维和脂肪的沉积及斑块的形成，血脂异常是最主要的危险因素。

背景：运动可降低血脂，减缓动脉粥样硬化发展。动脉粥样硬化起始于线粒体功能障碍，而抗增殖蛋白2蛋白受耐力训练调控，参与线粒体自噬。
目的：验证耐力训练干预动脉粥样硬化中抗增殖蛋白2蛋白在线粒体自噬通路中的作用。
方法：将40只Wistar大鼠随机分为对照组、运动组、动脉粥样硬化组和动脉粥样硬化运动组，每组10只，后2组大鼠高脂饮食(9周)联合维生素D注射(第1，3，6 周)构建大鼠动脉粥样硬化模型，同时2个运动组大鼠进行跑台递增训练干预9周。干预结束后进行血脂和病理检测观察造模及干预效果；酶标法和Western blot检测线粒体膜电位和自噬相关蛋白表达；免疫荧光观察主动脉中线粒体自噬蛋白的共定位情况。
结果与结论：①血脂和病理切片显示，与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇水平和主动脉脂质沉积面积显著降低(P < 0.001)。②线粒体膜电位显示，动脉粥样硬化运动组大鼠主动脉线粒体膜电位的显著降低得到逆转(P < 0.01)。③Western blot显示，与对照组相比，动脉粥样硬化组大鼠线粒体抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1和Parkin蛋白表达显著升高(P < 0.05)，PARL和PGAM5蛋白表达降低(P < 0.05)；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组大鼠线粒体PINK1和Parkin蛋白表达显著降低(P < 0.05)，抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PARL和PGAM5蛋白表达显著升高(P < 0.05)。④免疫荧光结果显示，动脉粥样硬化组较对照组LC3和PINK1与TOMM20共定位显著增加(P < 0.05)，动脉粥样硬化运动组较动脉粥样硬化组LC3与TOMM20共定位显著增加(P < 0.05)；动脉粥样硬化组较对照组LC3和PARL与抗增殖蛋白2共定位显著增加(P < 0.01)，动脉粥样硬化运动组较动脉粥样硬化组LC3与抗增殖蛋白2共定位显著增加(P < 0.01)，PARL蛋白与抗增殖蛋白2共定位显著降低(P < 0.01)。⑤结果表明，耐力训练可诱导线粒体内膜自噬受体抗增殖蛋白2表达，促进抗增殖蛋白2与线粒体自噬接头蛋白的结合完成线粒体自噬，恢复线粒体功能，减缓动脉粥样硬化发生。
https://orcid.org/0009-0001-1392-4742(宋明箫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 抗增殖蛋白2, 耐力训练, 线粒体自噬, 动脉粥样硬化, 线粒体

Abstract: BACKGROUND: Exercises can reduce blood lipids and slow down the development of atherosclerosis. Atherosclerosis begins with mitochondrial dysfunction, and prohibitin 2 is involved in mitophagy by endurance training.
OBJECTIVE: To explore the role of endurance training in the intervention of prohibitin 2 protein in the mitophagy autophagy pathway in atherosclerosis.
METHODS: A total of 40 Wistar rats were randomly divided into control group, exercise group, atherosclerosis group and atherosclerosis combined with exercise group, with 10 rats in each group. A rat model of atherosclerosis was constructed by combining a high-fat diet (9 weeks) with vitamin D injections (weeks 1, 3, and 6) in the latter two groups, while the two exercise groups were subjected to progressing intensity endurance training for 9 weeks. After the intervention, lipid and pathological detections were conducted to observe the modeling and interventional effects. Mitochondrial membrane potential and mitophagy proteins were detected by microplate reader and western blot. Immunofluorescence staining was used to observe the co-localization of mitophagy proteins in aortic tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: Lipid and pathological sections showed that compared with the atherosclerosis group, the serum low-density lipoprotein cholesterol and total cholesterol levels and aortic lipid deposition area were significantly reduced in the atherosclerosis combined with exercise group (P < 0.001). The results of mitochondrial membrane potential showed that the significant decrease in mitochondrial membrane potential of the aorta in the atherosclerosis combined with exercise group was reversed (P < 0.01). The results of western blot assay showed that compared with the control group, the mitochondrial protein expression of prohibitin 2, LC3II/I, PINK1 and Parkin was significantly increased (P < 0.05), and the protein expression of PARL and PGAM5 decreased (P < 0.05). Compared with the atherosclerosis group, the protein expression of PINK1 and Parkin in the mitchondria of rats in the atherosclerosis combined with exercise group was significantly decreased (P < 0.05), and the protein expressions of prohibitin 2, LC3II/I, PARL and PGAM5 were significantly increased (P < 0.05). Immunofluorescence results showed that compared with the control group, the co-localization of LC3 and PINK1 with TOMM20 was significantly increased in the atherosclerosis group (P < 0.05), while compared with the atherosclerosis group, the co-localization of LC3 and PINK1 with TOMM20 was significantly increased in the atherosclerosis combined with exercise group (P < 0.05). Co-localization of LC3 and PARL with prohibitin 2 was significantly increased in the atherosclerosis group compared with the control group (P < 0.01), co-localization of LC3 with prohibitin 2 was significantly increased in the atherosclerosis combined with exercise group compared with the atherosclerosis group (P < 0.01), and co-localization of PARL protein with prohibitin 2 was significantly decreased in the atherosclerosis combined with exercise group compared with the atherosclerosis group (P < 0.01). To conclude, endurance training can induce the expression of prohibitin 2 in the inner mitochondrial membrane and promote the binding of prohibitin 2 to the mitophagy junction protein to complete mitophagy, restore mitochondrial function, and slow down the occurrence of atherosclerosis.

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Key words: prohibitin 2, endurance training, mitophagy, atherosclerosis, mitochondria

中图分类号:

宋明箫, 陈君顺子, 王宁伟, 蔡欢, 冯红. 耐力训练大鼠抗动脉粥样硬化线粒体自噬通路中抗增殖蛋白2的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2294-2300.

Song Mingxiao, Chen Junshunzi, Wang Ningwei, Cai Huan, Feng Hong. Role of prohibitin 2 in mitophagy pathway against atherosclerosis in rats undergoing endurance training[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2294-2300.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选取的40只Wistar大鼠全部进入结果分析。
2.2 耐力训练对动脉粥样硬化大鼠血脂及病理进程的影响
2.2.1 血脂指标与对照组相比，动脉粥样硬化组大鼠血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均显著性增高(P < 0.001)；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著降低(P < 0.001)，见图1。
2.2.2 主动脉苏木精-伊红染色对照组和运动组大鼠主动脉内膜光滑，未发生动脉粥样硬化病变；动脉粥样硬化组大鼠主动脉内皮细胞脱落，管腔内发生多处破裂，内膜明显增厚，中膜浅层坏死钙化，细胞间排列发生明显扩张，弹力纤维变性断裂，发现明显脂质沉积；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组大鼠主动脉内膜破裂减少，血管中膜浅层坏死钙化减少，病变程度减轻，见图2。结果表明耐力训练可以有效降低动脉粥样硬化大鼠血清中血脂含量，减缓动脉粥样硬化进程。
2.3 耐力训练对动脉粥样硬化大鼠线粒体功能及自噬的影响
2.3.1 线粒体膜电位与对照组相比，动脉粥样硬化组主动脉线粒体膜电位显著性降低(P < 0.05)；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组线粒体膜电位显著增高(P < 0.01)，见图3A。表明耐力训练改善了动脉粥样硬化导致的线粒体膜电位的降低，使线粒体膜结构完整性得到保护。
2.3.2 线粒体与自噬蛋白共定位结果显示，与对照组相比，各组定位于线粒体的LC3蛋白均显著增加(P < 0.05)；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组中定位于线粒体的LC3蛋白显著性增多(P < 0.05)，见图3B，C。结果表明耐力训练进一步促进了线粒体与自噬相关蛋白的相互作用。
2.4 耐力训练对动脉粥样硬化大鼠抗增殖蛋白2自噬通路相关蛋白表达的影响大鼠主动脉组织蛋白表达显示，与对照组相比，动脉粥样硬化组大鼠抗增殖蛋白2、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ和PARL蛋白表达显著增加，与动脉粥样硬化组大鼠相比，动脉粥样硬化运动组大鼠PINK1及Parkin蛋白表达显著降低，抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PGAM5和PARL蛋白表达显著增加，见图4和表2。表明耐力训练导致抗增殖蛋白2作为线粒体自噬蛋白受体表达进一步增加，促进线粒体自噬的发生。

2.5 耐力训练对动脉粥样硬化大鼠抗增殖蛋白2线粒体自噬通路的影响免疫荧光共定位的结果显示，与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组中LC3蛋白与抗增殖蛋白2之间的共定位显著性增多(P < 0.01)，表明耐力训练进一步促进了抗增殖蛋白2和LC3的结合；与动脉粥样硬化组相比，动脉粥样硬化运动组中PARL与抗增殖蛋白2蛋白之间的共定位情况显著性下降(P < 0.01)，表明耐力训练减弱了抗增殖蛋白2和PARL的结合，见图5。

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引言

动脉粥样硬化是引发心血管疾病的重要危险因子[1]，它所引发的心脑血管疾病，如冠心病、心肌梗死、脑卒中和血栓已成为全世界范围人口死亡的首要原因[2]。动脉粥样硬化是一种大动脉疾病，以动脉内纤维脂肪沉积和粥样斑块为特征[3]，发病始于线粒体损伤，发病过程是涉及各种反应的复杂过程，包括氧化应激、巨噬细胞和炎症因子之间的相互作用，其特点是发生慢性的、进行性的病理改变[4]。动脉粥样硬化患者的主动脉内皮细胞表现出异常的线粒体功能和氧化应激状态[5]。在动脉粥样硬化发生的早期阶段，胆固醇和低密度脂蛋白升高，抗氧化系统失效，线粒体活性氧过量产生，引发线粒体自噬的失调。线粒体自噬是清除损伤线粒体的主要机制，通过选择性自噬特异性清除损坏或多余的线粒体，维持正常的线粒体功能，保证细胞的稳态和生存[6]。而线粒体自噬的失调使机体不能有效地清除受损的线粒体，从而造成线粒体功能障碍，导致动脉粥样硬化发生。
运动是全球公认的健康促进方式。长期的耐力运动可激活线粒体自噬，提高线粒体质量，促进机体健康[7-9]。
在缺血再灌注小鼠模型中，预适应的运动可显著提高线粒体自噬蛋白表达。有研究表明，6周的预运动训练导致中脑纹状体抗增殖蛋白2(prohibitin2，PHB2)水平的显著升高，该结果可能通过同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶1 (phosphatase and tensin homolog induced putative kinase 1，PINK1)/Parkin信号通路促进线粒体自噬的产生而发挥对心肌的保护作用[10-11]。
据报道，抗增殖蛋白2可作为线粒体内膜自噬受体独立介导线粒体自噬的发生[12]；而YAN等[13]的研究发现抗增殖蛋白2通过抗增殖蛋白2-PARL-PGAM5-PINK1轴启动线粒体自噬，不同的是后者具体探讨了抗增殖蛋白2升高时通过与线粒体内膜蛋白早老素相关菱形样蛋白 (presenilin associated rhomboid like，PARL)结合，使线粒体膜上的磷酸甘油酯突变家族成员5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)和PINK1蛋白不能被剪切，PINK1在线粒体外膜保持稳定，促进Parkin蛋白的招募，导致线粒体外膜的破裂，促进抗增殖蛋白2与线粒体自噬蛋白的结合，由此揭示了一条抗增殖蛋白2介导线粒体自噬的新途径——抗增殖蛋白2-PARL-PGAM5-PINK1轴。而耐力训练诱导抗增殖蛋白2的过表达可通过不同方式启动线粒体自噬，可能是减缓动脉粥样硬化形成的有效机制。
因此，该研究提出假设耐力训练可能通过直接或间接的方式诱导抗增殖蛋白2升高激活线粒体自噬通路减缓动脉粥样硬化进程。结合实际，此项研究选取血脂、病理、线粒体膜电位、线粒体自噬蛋白检测进行抗动脉粥样硬化评价，并检测了抗增殖蛋白2线粒体自噬相关蛋白及自噬蛋白间的相关作用，阐明抗增殖蛋白2在线粒体自噬通路中的具体机制。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年6-8月在天津体育学院天津市运动生理和运动医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物自北京维通利华购入7周龄雄性Wistar大鼠40只，体质量(220±20) g，SPF级，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。饲养条件：12 h明暗交替、室温18-23 ℃、相对湿度40%-70%，自由饮食饮水，适应性饲养1周后进行实验。
实验方案经天津体育学院动物实验伦理委员会批准，审批号为TJUS2023-038。实验过程遵循了国际兽医学编辑学会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 高脂饲料标准饲料中加入3%胆固醇、0.5%胆酸、5%猪油、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶，购于小黍有泰(北京)生物科技有限公司。
1.3.3 主要试剂维生素D3注射液、总胆固醇检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、JC-1试剂盒购于天津比优生物技术有限公司；PGAM5、PARL、LC3Ⅱ/Ⅰ、Parkin抗体购自赛默飞；抗增殖蛋白2、PINK1抗体购自Abcam；VDAC抗体购于三英；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)为碧云天产品。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组、造模及干预 40只Wistar大鼠随机分为4组：对照组、运动组、动脉粥样硬化组和动脉粥样硬化运动组，每组各10只。对照组及运动组喂饲标准饲料，动脉粥样硬化和动脉粥样硬化运动组喂饲高脂饲料。参照周红等[14]造模方案构建大鼠动脉粥样硬化模型。动脉粥样硬化组和动脉粥样硬化运动组大鼠适应性喂养1周后，进行9周的高脂饲料喂养。在高脂饲料喂养的第1周腹腔注射60万IU/kg维生素D3，第3周及第6 周腹腔注射10万 IU/kg的维生素D3；对照组和运动组给予相同体积的生理盐水注射。
在动脉粥样硬化造模期间，同时对运动组及动脉粥样硬化运动组大鼠进行为期 9 周中等强度递增负荷耐力跑台训练，包括适应性训练和正式训练。正式实验开始前 3 d大鼠以15 m/min 的速度进行跑台运动，训练时间由10 min增加至30 min，每日增加10 min，使大鼠逐渐适应训练时间的延长。正式训练主要参照林小晶等[15]和刘善云等[16]耐力训练方案，每周训练5 d，具体的训练方案如表1。

1.4.2 取材在最后一次训练结束24 h后取材。将大鼠称体质量记录后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.0-2.0 mL/kg)麻醉。大约5 min后观察大鼠四肢瘫软无力或口流唾液，无痛感或无反应后进行取材。于大鼠腹主动脉取血，用于血清指标检测；处死大鼠后自心脏处沿主动脉弓至下肢动脉分支处剥离全长动脉，分离结缔组织。部分用于线粒体提取，部分主动脉根部和胸主动脉于40 g/L多聚甲醛固定后用于病理检测和免疫荧光检测。

1.4.3 血清指标检测全血离心取血清，用试剂盒检测血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度，以评价大鼠血脂情况。
1.4.4 病理模型检测主动脉组织固定后进行石蜡包埋及切片，脱蜡复水后进行苏木精-伊红染色。脱水透明后以光学树脂封固，在光学显微镜下观察各组大鼠主动脉组织病理情况以评价大鼠动脉粥样硬化模型建立的情况。
1.4.5 线粒体膜电位检测将主动脉置于表面皿上，加入适量线粒体提取介质剪碎，移入匀浆管，冰浴环境下研磨数次，直至无明显组织块。匀浆液于4 ℃，1 000×g离心10 min，取上清。再次于4 ℃，10 000×g离心10 min，取沉淀，用500 μL 线粒体保存介质重悬，即得粗制线粒体。采用 JC-1荧光法检测线粒体膜电位，根据红绿荧光的比值代表线粒体来评定线粒体膜电位变化。
1.4.6 免疫印迹检测线粒体自噬通路蛋白的表达免疫印迹法检测主动脉线粒体抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、Parkin、PINK1、PARL和 PGAM5蛋白的表达水平。使用RIPA裂解主动脉线粒体，BCA法检测蛋白浓度，根据蛋白量加入到12% SDS-PAGE凝胶电泳中，半干转法转膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，条带被剪切后置于1∶1 000比例的一抗(抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、Parkin、PINK1、PARL、PGAM、VDAC)中4 ℃过夜孵育，二抗[辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)1∶20 000；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)1∶20 000]室温孵育2 h后ECL显影。Image J 软件分析条带灰度值。
1.4.7 免疫荧光线粒体自噬蛋白检测
(1)免疫荧光检测线粒体定位蛋白TOMM20和自噬标记物LC3及线粒体自噬蛋白PINK1的共定位情况：对各组主动脉组织进行免疫荧光染色，TOMM20显示绿色荧光，LC3和PINK1显示为红色荧光，根据红绿荧光的共定位细胞数所占目标区域内总细胞数的比率进行定量分析。
(2)免疫荧光检测抗增殖蛋白2与LC3，抗增殖蛋白2和PARL之间的共定位情况：LC3和PARL为红色荧光，抗增殖蛋白2 为绿色荧光。根据红绿荧光的共定位细胞数所占目标区域内总细胞数的比率进行定量分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠血清胆固醇及主动脉病理变化；②主动脉线粒体膜电位水平；③线粒体自噬相关蛋白抗增殖蛋白2、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin、PARL和PGAM5的表达；④线粒体定位蛋白TOMM20和 LC3及PINK1的共定位情况；⑤抗增殖蛋白2和LC3及PARL之间的共定位情况。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示，采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0对数据进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经天津体育学院生物统计学专家审核。

讨论

线粒体功能异常是动脉粥样硬化的病理基础，线粒体自噬是能够维持线粒体稳态的线粒体质量控制中的关键因素。耐力训练可以有效诱导大鼠骨骼肌和心肌线粒体自噬的发生[7，17]，恢复线粒体功能，提高线粒体质量。
血脂异常是诱发动脉粥样硬化及加剧斑块形成的重要危险因素[18]。胆固醇酯化是动脉粥样硬化开始的标志，血清中低密度脂蛋白胆固醇的升高程度与动脉粥样硬化病理进程直接相关[19-20]。运动是抵抗动脉粥样硬化的“良药”，有研究表明有氧运动可改善血液中脂质水平，起到抗动脉粥样硬化的作用[4]。林小晶等[15]的研究发现4周中等强度递增负荷有氧运动降低了动脉粥样硬化大鼠血清中的脂蛋白水平，减轻了主动脉病变和巨噬细胞浸润。有氧运动对高脂血症及早期动脉粥样硬化也产生积极作用，刘君雯等[21]发现有氧运动可改善高脂血症大鼠的血脂成分、抗氧化和内皮分泌功能，且较长运动时间的改善效果更好。此次研究中，耐力训练干预后动脉粥样硬化大鼠血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低，表明耐力训练可有效降低动脉粥样硬化大鼠血脂水平，改善动脉粥样硬化大鼠血脂的异常。在动脉粥样硬化形成过程中，脂质沉积是血管壁形成斑块的前提。病理结果显示，动脉粥样硬化运动组相较于对照组仍显示出明显的动脉粥样硬化斑块和脂质沉积，但与动脉粥样硬化组相比其斑块面积显著减小且中膜钙化程度明显减轻，表明规律的耐力训练可有效减缓动脉粥样硬化大鼠的病理进程，改善其血管钙化情况。
线粒体是机体能量供应的基本来源，正常的线粒体功能是维持细胞生存的必要条件。异常的线粒体不仅损害细胞呼吸和能量产生，且充当危险的活性氧发生器。线粒体活性氧的过度产生导致氧化应激，并作为细胞凋亡/损伤和死亡的靶点[22]。正常的线粒体膜电位维持线粒体氧化磷酸化和ATP的产生[23]，是线粒体功能健康与否的提示器，因此维持线粒体膜电位的稳定是线粒体功能的必要条件[24]。此次研究中动脉粥样硬化模型导致大鼠膜电位显著降低，运动干预后线粒体膜电位显著恢复，表明动脉粥样硬化导致了线粒体膜电位的降低，造成线粒体功能损伤，耐力训练可有效保护线粒体膜结构，恢复线粒体膜电位。耐力训练还进一步上调了线粒体上自噬相关蛋白LC3Ⅱ蛋白含量，表明耐力训练能够促进疾病状态下线粒体自噬的发生，恢复线粒体功能，维持线粒体稳态。由此推测，可以通过改善线粒体功能、保护线粒体膜结构来达到抗动脉粥样硬化效果。
研究发现，抗增殖蛋白2作为一种新型的线粒体内膜自噬受体，能够通过LIR区域与LC3Ⅱ直接结合，促进线粒体自噬的发生[12，25]。在线粒体自噬发生的早期阶段，Parkin通过诱导线粒体外膜蛋白的泛素化降解暴露线粒体内膜，此时位于线粒体内膜的抗增殖蛋白2蛋白能够与LC3结合，推动自噬膜泡对受损伤线粒体进一步包裹 [12]。因此，抗增殖蛋白2与LC3Ⅱ的共定位是线粒体自噬的直接证据。此次研究中，耐力训练干预后的动脉粥样硬化模型大鼠主动脉线粒体内抗增殖蛋白2及LC3Ⅱ蛋白表达进一步增加，且主动脉线粒体内抗增殖蛋白2和LC3Ⅱ蛋白的共定位情况增多，表明耐力训练促进了动脉粥样硬化大鼠主动脉线粒体内抗增殖蛋白2介导的线粒体自噬的增强，加速了受损线粒体的消除，以维持线粒体的正常功能。
最新的研究发现抗增殖蛋白2-PARL-PGAM5-PINK1轴是抗增殖蛋白2介导线粒体自噬的新途径[13]。抗增殖蛋白2依赖PARL蛋白介导线粒体自噬，在线粒体自噬的过程中抗增殖蛋白2与PARL之间发生相互作用。抗增殖蛋白2可稳定线粒体内膜蛋白酶PARL，阻止PARL对于PGAM5的剪切，完整的PGAM5可将PINK1稳定在线粒体外膜上，随后募集Parkin和线粒体其他受体，促进线粒体自噬[26]。PINK1-Parkin途径已被证明通过清除受损的线粒体保护细胞，发挥抗凋亡作用[27]。PINK1作为E3泛素连接酶Parkin的上游因子，在激活和招募Parkin至去极化线粒体上必不可少。PGAM5通过其N端的跨膜结构域靶向至线粒体，该区域具有PARL蛋白酶的裂解位点[28]。PARL响应线粒体膜电位下降，根据线粒体的健康状况调节其对于PINK1和PGAM5的差异性裂解。因此，PGAM5作为PARL的底物可以保护PINK1不被切割[29]。PGAM5与线粒体损伤有关。当线粒体轻度受损时，PGAM5激活线粒体生物发生和线粒体自噬以促进细胞补偿反应，而当线粒体遭到严重损伤时PGAM5诱导线粒体过度分裂，导致细胞坏死凋亡和线粒体死亡信号的发生，最终引起细胞死亡[30]。有研究推测，细胞在遭受严重氧化应激时，可能会导致线粒体自噬的无效和细胞凋亡的必然。动脉粥样病变导致抗增殖蛋白2表达的升高，通过PARL-PGAM5-PINK1通路，抑制蛋白PARL表达，使PGAM5保护PINK1稳定于线粒体，招募Parkin以促进线粒体自噬。由于线粒体受损严重，线粒体自噬不足以清除受损的线粒体。
综上，耐力训练诱导抗增殖蛋白2蛋白表达，促进其与成熟自噬蛋白LC3Ⅱ结合，逆转了线粒体膜电位的降低，有效降低动脉粥样硬化大鼠血脂水平，改善动脉粥样硬化大鼠主动脉病变程度，减少其脂质沉积。此项研究首次通过体内实验发现了抗增殖蛋白2线粒体自噬机制在动脉粥样硬化病变进程中的作用，阐明了抗增殖蛋白2在耐力训练抗动脉粥样硬化中线粒体自噬通路中的具体机制，为动脉粥样硬化治疗药物靶点的早期研发提供重要理论基础。
此次研究的实验设计及方法有以下几点可优化：①由于数据样本量限制，仅进行粗提线粒体，在后期实验中可改进提取方法，也可增加采集组织的细胞核或细胞质部分以获得更加全面的结果；②因条件限制，仅进行了线粒体膜电位检测，在今后的相关研究中可增加对线粒体活性氧及线粒体呼吸的检测；③仅进行体内造模验证，可在后期的实验中进行基因敲除或过表达进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

耐力训练大鼠抗动脉粥样硬化线粒体自噬通路中抗增殖蛋白2的作用

Role of prohibitin 2 in mitophagy pathway against atherosclerosis in rats undergoing endurance training

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