法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

doi:10.12307/2025.090

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4939-4946.doi: 10.12307/2025.090

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

郭敏芳1，张慧宇1，章培军1，苏琴2，贾思玮2，尉杰忠1，3

1山西大同大学脑科学研究所/分子细胞免疫学大同市重点实验室，山西省大同市 037009；2山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；3山西大同大学附属第一医院/大同市第五人民医院，山西省大同市 037009

收稿日期:2023-12-25 接受日期:2024-05-22 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-29
通讯作者: 尉杰忠，博士，教授，博士生导师，山西大同大学附属第一医院/大同市第五人民医院，山西省大同市 037009；山西大同大学脑科学研究所/分子细胞免疫学大同市重点实验室，山西省大同市 037009
作者简介:郭敏芳，女，1980年生，山西省大同市人，汉族，硕士，副教授，主要从事神经变性疾病的研究。
基金资助:
山西省基础研究计划项目(20210302123476)，项目负责人：郭敏芳；山西省基础研究计划项目(20210302123478)，项目负责人：张慧宇；山西省 2022 年度“四个一批”科技兴医创新计划项目(2022XM33)，项目负责人：尉杰忠；山西省中医药科研课题计划项目(2023ZYYB2042)，项目负责人：尉杰忠；山西大同大学大学生创新创业训练计划项目(XDC2022174)，项目负责人：郭敏芳

Fasudil alleviates beta-amyloid 1-42-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

Guo Minfang1, Zhang Huiyu1, Zhang Peijun1, Su Qin2, Jia Siwei2, Yu Jiezhong1, 3

1Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; 2Research Center of Neurobiology, Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 3First Affiliated Hospital of Shanxi Datong University/Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China

Received:2023-12-25 Accepted:2024-05-22 Online:2025-08-18 Published:2024-09-29
Contact: Yu Jiezhong, MD, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; First Affiliated Hospital of Shanxi Datong University/Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China
About author:Guo Minfang, Master, Associate professor, Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
Research Project of Shanxi Province Basic Research Program, No. 20210302123476 (to GMF); Research Project of Shanxi Province Basic Research Program, No. 20210302123478 (to ZHY); Shanxi Province 2022 “Four Batch One” Science and Technology Innovation Plan Project, No. 2022XM33 (to YJZ); Shanxi Province Traditional Chinese Medicine Research Project, No. 2023ZYYB2042 (to YJZ); College Student Innovation and Entrepreneurship Training Program Project of Shanxi Datong University, No. XDC2022174 (to GMF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

法舒地尔：是一种最常用的Rho激酶抑制剂，也是一种有效的钙通道拮抗剂和血管舒张剂。众多研究表明，法舒地尔可以改善神经元的功能，缓解包括阿尔茨海默病在内的多种神经变性疾病。
线粒体自噬：线粒体作为最重要的高能细胞器在细胞内稳态中发挥着关键作用。功能失调的线粒体不仅响应ATP生产的减少，还增加了氧化应激。受损的线粒体需要通过线粒体吞噬(线粒体自噬)选择性去除，其过程由核编码蛋白控制。线粒体自噬作为介导受损或衰老线粒体清除的途径，对维持细胞功能至关重要。异常的线粒体吞噬与各种疾病密切相关。

摘要
背景：法舒地尔对阿尔茨海默病小鼠脑内的线粒体动力学有调节作用，并且可以抑制神经炎症，但能否调节线粒体自噬和NLRP3炎症小体进而减轻β-淀粉样蛋白毒性尚不清楚。
目的：探究法舒地尔对β-淀粉样蛋白1-42诱导的人源神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y凋亡和线粒体自噬以及NLRP3炎症小体的调节作用。
方法：将SH-SY5Y细胞接种于孔板内，细胞贴壁后分3组干预：对照组不加入任何药物，模型组加入20 μmol/L β-淀粉样蛋白1-42，法舒地尔组同时加入20 μmol/L β-淀粉样蛋白1-42与15 mg/L法舒地尔，干预24 h后，采用MTT法检测细胞活性，TUNEL染色检测细胞凋亡，qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白表达，免疫荧光染色和Western blot检测线粒体自噬相关蛋白表达，免疫荧光染色和Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达。

结果与结论：①与对照组比较，模型组细胞活性降低、凋亡率升高(P < 0.05)；与模型组比较，法舒地尔组细胞活性升高、凋亡率降低(P < 0.05)；②qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与对照组比较，模型组细胞Bax mRNA与蛋白表达升高(P < 0.05)，Bcl-2 mRNA与蛋白表达降低(P < 0.05)；与模型组比较，法舒地尔组细胞Bax mRNA与蛋白表达降低(P < 0.05)，Bcl-2 mRNA与蛋白表达升高(P < 0.05)；③免疫荧光染色和Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达降低(P < 0.05)，p62蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组相比，法舒地尔组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3蛋白表达升高(P < 0.05)，p62蛋白表达降低(P < 0.05)；④免疫荧光染色和Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组相比，法舒地尔组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达降低(P < 0.05)；⑤结果表明，法舒地尔可以减轻β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，其机制可能与激活线粒体自噬且抑制NLRP3炎症小体激活有关。

https://orcid.org/0000-0003-2637-6367 (郭敏芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 法舒地尔, β-淀粉样蛋白, 神经细胞, 细胞凋亡, 线粒体自噬, 炎症小体

Abstract: BACKGROUND: Fasudil has a regulatory effect on mitochondrial dynamics in the brain of Alzheimer’s disease mice and can inhibit neuroinflammation, but whether it can reduce the toxicity of β-amyloid protein by regulating mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of fasudil on β-amyloid 1-42-induced apoptosis and mitophagy and NLRP3 inflammasome in human derived neuroblastoma cell line SH-SY5Y cells.
METHODS: SH-SY5Y cells were inoculated into the pore plate. After adhesion, cells were divided into three groups for intervention: No drug was added to the control group; 20 μmol/L β-amyloid 1-42 was added to the model group, and 20 μmol/L β-amyloid 1-42 and 15 mg/L fasudil were added to the fasudil group at the same time. After 24 hours of intervention, the cell activity was detected by MTT assay and apoptosis was detected by TUNEL staining. The expression of apoptosis-related proteins was detected by qRT-PCR and western blot assay. The expression of mitochondrial autophagy related proteins was detected by immunofluorescence staining and western blot assay. The expression of NLRP3 inflammasome related proteins was detected by immunofluorescence staining and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with control group, the cell activity of the model group was decreased and the apoptosis rate was increased (P < 0.05). Compared with model group, cell activity in the fasudil group was increased and apoptosis rate was decreased (P < 0.05). (2) The results of qRT-PCR and western blot assay showed that compared with the control group, the expression of Bax mRNA and protein was increased in the model group (P < 0.05), while the expression of Bcl-2 mRNA and protein was decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the expression of Bax mRNA and protein was decreased (P < 0.05), and the expression of Bcl-2 mRNA and protein was increased (P < 0.05) in the fasudil group. (3) The results of immunofluorescence staining and western blot assay showed that compared with the control group, the expressions of PINK1, Parkinson’s disease protein and LC3 protein were decreased (P < 0.05), while the expression of p62 protein was increased (P < 0.05) in the model group. Compared with model group, the expression levels of PINK1, Parkinson’s disease protein, and LC3 protein were increased (P < 0.05), while the expression of p62 protein was decreased (P < 0.05) in the fasudil group. (4) The results of immunofluorescence staining and western blot assay showed that compared with the control group, the expression levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, and interleukin1β protein were increased in the model group (P < 0.05). Compared with the model group, the expression levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, and interleukin1β were decreased in the fasudil group (P < 0.05). (5) The results show that fasudil can reduce the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by β-amyloid 1-42, and its mechanism may be related to the activation of mitophagy and the inhibition of NLRP3 inflammasome activation.

Key words: fasudil, β-amyloid, nerve cell, apoptosis, mitophagy, inflammasome

中图分类号:

郭敏芳, 张慧宇, 章培军, 苏琴, 贾思玮, 尉杰忠. 法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4939-4946.

Guo Minfang, Zhang Huiyu, Zhang Peijun, Su Qin, Jia Siwei, Yu Jiezhong. Fasudil alleviates beta-amyloid 1-42-induced apoptosis of SH-SY5Y cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4939-4946.

图/表（结果） 3

2.1 确定β-淀粉样蛋白1-42作用浓度 MTT检测结果显示，当β-淀粉样蛋白1-42浓度≥20 μmol/L时，SH-SY5Y 细胞活性下降(P < 0.001)，见图1。因此，后续实验选用β-淀粉样蛋白1-42的作用浓度为20 μmol/L。
2.2 各组SH-SY5Y细胞活性的比较 MTT检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞活性降低(P < 0.001)；与模型组相比，法舒地尔组细胞活性升高(P < 0.001)，见图2。
2.3 各组SH-SY5Y细胞凋亡的比较 TUNEL染色结果显示，与对照组相比，模型组细胞凋亡增加(P < 0.01)；与模型组相比，法舒地尔组细胞凋亡减少(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白mRNA和蛋白表达的比较 与对照组相比，模型组细胞Bax的mRNA与蛋白表达升高(P < 0.01或P < 0.001)，Bcl-2的mRNA与蛋白表达降低(P < 0.01)；与模型组相比，法舒地尔组细胞Bax的mRNA与蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.01)，Bcl-2的mRNA与蛋白表达升高(P < 0.01)，见图4。
2.5 各组SH-SY5Y细胞线粒体自噬相关蛋白表达的比较 免疫荧光染色与Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3的蛋白表达降低(P < 0.01或P < 0.001)，p62蛋白表达升高(P < 0.01或P < 0.001)；与模型组相比，法舒地尔组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3的蛋白表达升高(P < 0.05或P < 0.001)，p62蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.001)，见图5。

2.6 各组SH-SY5Y细胞NLRP3炎症小体相关蛋白表达的比较 免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，模型组细胞NLRP3、白细胞介素1β的蛋白表达升高(P < 0.01或P < 0.001)；与模型组比较，法舒地尔组细胞NLRP3、白细胞介素1β的蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.001)，见图6A。
Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β的蛋白表达升高(P < 0.01或P < 0.001)；与模型组相比，法舒地尔组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β的蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.001)，见图6B。

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引言

阿尔茨海默病是一种不可逆的神经退行性疾病，其特征是记忆力丧失和语言退化。世界上每3 s就会有人患上痴呆症，据估计在2010-2050年期间，痴呆症患者将从5 000万增加到1.13亿[1]。阿尔茨海默病作为最普遍的痴呆形式，发病率持续增长，负担沉重，因此研究阿尔茨海默病的潜在发病机制并寻求有效的治疗手段成为目前的迫切需求。
根据阿尔茨海默病发病机制中的β-淀粉样蛋白假说，β-淀粉样蛋白聚集可以引起星形胶质细胞和小胶质细胞的激活和增殖，从而诱发神经炎症，导致神经元凋亡或死亡[2-3]，因此神经元凋亡或死亡是阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的根本原因，而神经炎症在这一过程中发挥着关键作用[4]。NLRP3炎性小体的激活是介导神经炎症的主要成分之一[5]，并且在阿尔茨海默病小鼠的脑组织中大量表达[6]，说明NLRP3炎性小体参与阿尔茨海默病的神经炎症病理，抑制NLRP3炎症小体可以保护阿尔茨海默病神经元[7]。线粒体自噬是消除受损线粒体的选择性自噬途径，被认为是调节线粒体稳态的关键调节剂之一，线粒体自噬缺乏最近被认为是导致阿尔茨海默病的关键因素[8]。有研究表明，线粒体自噬受损与神经炎症之间存在串扰，线粒体自噬增加可以抑制NLRP3的激活，进而抑制神经炎症[9]。因此，调节线粒体自噬和NLRP3炎症小体可能是缓解阿尔茨海默病神经元凋亡、减轻β-淀粉样蛋白毒性的新策略。
法舒地尔为一种靶向Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶的小分子，具有多重神经保护效应。法舒地尔可以调节线粒体动力学、抑制神经炎症并改善阿尔茨海默病症状，还可以逆转β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡、细胞内钙超载，并且降低线粒体膜电位[10-12]，但其能否调节线粒体自噬和NLRP3炎症小体尚不清楚。此次实验采用β-淀粉样蛋白1-42刺激SH-SY5Y细胞建立阿尔茨海默病细胞模型，观察法舒地尔对β-淀粉样蛋白诱导神经元凋亡的影响，进一步探讨其治疗阿尔茨海默病的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞实验，组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用Tukey-t检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年11月至2023年9月在山西大同大学脑科学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株 人源神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y由山西大同大学脑科学研究所提供。实验方案已通过山西大同大学伦理委员会批准(2021017)。
1.3.2 实验试剂盐酸法舒地尔注射液(天津红日药业股份有限公司，批号：090116)；β-淀粉样蛋白1-42(Med Chem Express，货号HY-P1363)；高糖DMEM培养基(GIBCO，货号 C11995500BT)；胎牛血清 (CellMax，货号 SA101.02)；兔抗PINK1抗体(碧云天，货号AF7755)；兔抗p62抗体(CST，货号23214)；小鼠抗帕金森病蛋白抗体(CST，货号4211)；兔抗LC3抗体(CST，货号12741)；兔抗NLRP3抗体(CST，货号15101)；兔抗ASC抗体(CST，货号67824)；兔抗白细胞介素1β抗体(CST，货号31202)；兔抗Caspase-1抗体(CST，货号24232)；兔抗Bcl-2抗体(CST，货号3498)；兔抗Bax抗体(CST，货号14796)；兔抗GAPDH抗体(CST，货号5174)；Alex Flour 594 标记的羊抗兔和羊抗小鼠IgG荧光二抗(Abcam，货号ab150080和ab150116)；HRP标记的羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(ABclonal，货号AS014和AS003)；TUNEL染色试剂盒(碧云天，货号C1090)；总RNA提取试剂盒(莫纳生物科技公司，货号MI10001S)；反转录试剂盒(莫纳生物科技公司，货号MR05101S)；qRT-PCR检测试剂盒(莫纳生物科技公司，货号MQ00401S)；qRT-PCR检测引物由生工生物工程股份有限公司合成。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，细胞生长融合达培养皿底80%时传代。
1.4.2 MTT法确定β-淀粉样蛋白1-42作用浓度 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板内，细胞密度为1×104/孔，置于CO2培养箱中培养24 h后，加入不同浓度[0(对照)，10，20，30，40，50，60 μmol/L]的β-淀粉样蛋白1-42，设置只加培养基不加细胞的空白对照。干预24 h后弃掉培养液，每孔加入10 μL MTT溶液，放入培养箱内静置4 h，每孔加入100 μL甲臜溶解液，放入培养箱内继续培养，直至紫色结晶全部溶解，利用酶标仪测定570 nm处的吸光度值，计算细胞活性。细胞活性=(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%。
1.4.3 实验分组 将SH-SY5Y细胞接种于孔板内，细胞贴壁后分3组干预：对照组不加入任何药物，模型组加入20 μmol/L β-淀粉样蛋白1-42，法舒地尔组同时加入20 μmol/L β-淀粉样蛋白1-42与15 mg/L法舒地尔[10]，干预24 h。
1.4.4 MTT法检测细胞活性 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板内，每孔加入100 μL细胞培养基，细胞密度为1×104/孔，细胞贴壁后实验分组干预，设置空白对照(不加细胞，只加细胞培养液)。干预结束后，采用MTT法检测细胞活性，检测方法同1.4.2。
1.4.5 TUNEL染色检测细胞凋亡 将SH-SY5Y细胞接种于放有玻璃圆片的24孔板内，每孔加入1 mL细胞培养基，细胞密度为2×104/孔，细胞贴壁后按照实验分组干预。干预结束后，用40 g/L多聚甲醛固定1 h，用PBS洗3次，加入含有0.3% Triton X-100的PBS静置5 min，移除PBS后加TUNEL检测液，避光环境下37 ℃孵育1 h，用PBS洗3次，加入含DAPI的封片液封固，激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.6 qRT-PCR凋亡相关蛋白的mRNA表达 将SH-SY5Y细胞接种于6孔板内，每孔加入2 mL细胞培养基，细胞密度为1×105/孔，细胞贴壁后按照实验分组干预。干预结束后，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，然后进行反转录：37 ℃下作用2 min，55 ℃下作用15 min，85 ℃下作用5 min；随后进行荧光定量PCR 扩增。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列为：①Bax：F-5′-GAT GCG TCC ACC AAG AAG CTG AG-3′，R-5′-CAC GGC GGC AAT CATC CTC TG-3′；②Bcl-2：F-5′-ACG AGT GGG ATG CGG GAG ATG-3′，R-5′-CGG GCT GGG AGG AGA AGA TGC-3′；③GAPDH：F-5′- ACA CCC ACT CCT CCA CCT TTG -3′，R-5′- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG-3’。
1.4.7 免疫荧光染色检测线粒体自噬与NLRP3炎症小体相关蛋白的表达 将SH-SY5Y细胞接种于放有玻璃圆片的24孔板内，每孔加入1 mL细胞培养基，细胞密度为2×104/孔，细胞贴壁后按照实验分组干预。干预结束后，用40 g/L多聚甲醛固定1 h，用PBS洗3次，加入含有0.3%Triton X-100和1%牛血清白蛋白的PBS室温孵育2 h。加入兔抗PINK1抗体、小鼠抗帕金森病抗体、兔抗LC3抗体、兔抗p62抗体、兔抗NLRP3抗体和兔抗白细胞介素1β抗体(抗体稀释浓度均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜；第2天，加入相应的荧光二抗避光作用2 h，用含DAPI的封固液封固，激光共聚焦显微镜下观察并拍片。
1.4.8 Western blot检测线粒体自噬与NLRP3炎症小体相关蛋白的表达 将SH-SY5Y细胞接种于6孔板内，每孔加入2 mL细胞培养基，细胞密度为1×105/孔，细胞贴壁后按照实验分组干预。干预结束后，加入RIPA裂解液提取蛋白质，等量蛋白(50 μg)上样并进行电泳，转膜并用50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗PINK1、小鼠抗帕金森病、兔抗p62、兔抗LC3、兔抗NLRP3、兔抗ASC、兔抗Caspase-1、兔抗白细胞介素1β、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗GAPDH(抗体稀释浓度均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤，加入相应HRP标记的IgG二抗室温下孵育2 h，用TBST洗涤，使用凝胶成像分析仪成像。
1.5 主要观察指标 各组细胞活性、凋亡率、凋亡相关mRNA和蛋白表达、线粒体自噬相关蛋白及NLRP3炎症小体相关蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用GraphPadPrism 5.0 统计软件分析数据。数据以x±s表示。组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用Tukey-t检验。文章统计学方法已通过山西大同大学统计学专家审核。

讨论

β-淀粉样蛋白1-40和β-淀粉样蛋白1-42是β-淀粉样蛋白产生的两种主要形式。与β-淀粉样蛋白1-40相比，β-淀粉样蛋白1-42更具神经毒性，因为它具有更高的疏水性，从而导致更快的低聚和聚集[13]。在阿尔茨海默病中，积累的β-淀粉样蛋白1-42淀粉状纤维发展形成老年斑块，引起神经毒性和tau病理，导致神经细胞死亡和神经变性[14]。有研究表明，β-淀粉样蛋白过度积聚会导致阿尔茨海默病脑组织神经元凋亡和随后的认知障碍[15]。在过去的几十年里，当β-淀粉样蛋白假说成为阿尔茨海默病的主流概念时，科学家们使用了各种细胞和动物模型来研究β-淀粉样蛋白的毒性作用，寻找可能的“解药”[16]。尽管这些研究提出了多种有前景的候选药物，但没有一种候选药物被证明对阿尔茨海默病患者有用，因此仍然需要努力寻找治疗阿尔茨海默病的有效药物。
法舒地尔是一种最常用的Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂，也是一种有效的钙通道拮抗剂和血管舒张剂。法舒地尔具有抑制神经炎症、抗氧化应激、促进神经营养因子分泌和保护血脑屏障等多重作用[17]，显示出了良好的神经保护效果；法舒地尔还可以减轻β-淀粉样蛋白毒性，改善阿尔茨海默病[10，18]，但其作用机制尚未完全阐明。SH-SY5Y细胞系被广泛用作包括阿尔茨海默病在内的不同神经退行性疾病的细胞模型[19]。为了进一步探究法舒地尔治疗阿尔茨海默病的细胞分子机制，此次实验观察了法舒地尔对β-淀粉样蛋白1-42诱导SH-SY5Y细胞毒性的影响。
细胞凋亡被认为是病理条件下阿尔茨海默病相关表现的原因，β-淀粉样蛋白和tau沉积可以触发凋亡途径，导致神经元死亡[20]。Bcl-2蛋白家族是所有凋亡途径中的下游蛋白家族，其中抗凋亡分子Bcl-2与促凋亡分子Bax是一组凋亡稳态因子，Bcl-2通过与线粒体外膜上的受体结合有助于维持线粒体膜的完整性，而如果细胞暴露于凋亡诱导剂，Bax会从细胞质转移到线粒体膜并改变外膜的通透性，这些变化导致细胞色素C和其他凋亡诱导因子从线粒体释放，最终导致DNA断裂 [21]。有研究显示，Bcl-2家族成员在阿尔茨海默病模型的内在凋亡途径中发挥重要作用[22]。此次实验结果表明，β-淀粉样蛋白1-42干预后，SH-SY5Y细胞活性、Bcl-2表达降低，细胞凋亡率、Bax表达升高，证实β-淀粉样蛋白可以诱导神经元凋亡；法舒地尔干预后，β-淀粉样蛋白1-42处理细胞的细胞活性、Bcl-2表达升高，细胞凋亡率、Bax表达降低，表明法舒地尔可以减轻β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞毒性，抑制细胞凋亡。
NLRP3炎症小体是一种先天免疫信号受体，与阿尔茨海默病病理和神经炎症反应密切相关[23]。NLRP3的激活会募集ASC，随后导致pro-caspase-1的切割活化并产生成熟的Caspase-1，而Caspase-1又可以切割非活性的促炎细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18，增加白细胞介素1β和白细胞介素18的产生，诱发炎症反应[24]。有研究发现，β-淀粉样蛋白可以促进SH-SY5Y细胞NLRP3炎症小体的激活，而NLRP3炎症小体又可以诱发神经元凋亡和焦亡的发生[25-26]。此次实验结果显示，模型组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β的表达均较对照组增加，进一步证实了β-淀粉样蛋白可以诱导神经元内NLRP3炎症小体的激活，进而促进神经元的凋亡。有研究显示，法舒地尔可以抑制小胶质细胞的激活并促进小胶质细胞向抗炎表型极化，同时还可以抑制星形胶质细胞的激活，从而抑制促炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子的分泌，抑制神经炎症[10，27]，但是法舒地尔能否调节NLRP3炎症小体尚不清楚。此次研究通过细胞实验证实了法舒地尔可以降低NLRP3、ASC、Caspase-1和白细胞介素1β的表达，表明法舒地尔可以抑制β-淀粉样蛋白诱导的NLRP3炎症小体激活，这也可能是其抑制神经炎症进而抑制细胞凋亡的机制之一。
NLRP3炎症小体激活的机制之一是线粒体受损，而线粒体自噬能清除受损的线粒体、维持线粒体质量和稳态，进而抑制NLRP3炎症小体的激活 [28]。PINK1/帕金森病蛋白信号通路是线粒体自噬研究中的主要信号通路，当线粒体膜电位降低时，PINK1通过膜转运出线粒体，帕金森病蛋白从细胞质中被募集到去极化的线粒体中，从而激活线粒体自噬[29]。LC3被广泛用作监测自噬活性的指标，LC3Ⅱ的水平上升代表自噬活动增强[30]。p62是一种经典的选择性自噬受体，也是自噬的选择性底物之一，在帕金森病蛋白依赖性线粒体自噬中发挥重要作用，是线粒体自噬的另一个重要指标[31]。阿尔茨海默病中存在线粒体自噬损伤，导致异常线粒体积聚，进而增加氧化损伤、神经炎症和能量缺陷，从而加重阿尔茨海默病病理 [32-33]。有研究显示，β-淀粉样蛋白可以诱导阿尔茨海默病海马神经元线粒体自噬缺陷[34]，而法舒地尔可以激活帕金森病蛋白介导的线粒体自噬途径，从而发挥神经保护作用[35]。
此次实验结果显示，模型组细胞PINK1、帕金森病蛋白和LC3Ⅱ的基因和蛋白表达水平均降低，p62的基因和蛋白表达升高，说明β-淀粉样蛋白可以诱导SH-SY5Y细胞线粒体自噬受损。而法舒地尔干预后，PINK1、帕金森病蛋白和LC3表达增加，p62的表达降低，证实法舒地尔可以调节β-淀粉样蛋白诱导的线粒体自噬损伤，这也可能是其抑制NLRP3炎症小体激活、缓解阿尔茨海默病的机制之一。
总之，法舒地尔可以缓解β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤、减少神经元凋亡，这可能与其促进线粒体自噬且抑制NLRP3炎症小体的激活有关，这些结果为进一步证实法舒地尔抑制神经炎症、改善阿尔茨海默病的细胞分子机制提供了依据，为其后续的开发利用提供了理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

法舒地尔缓解β-淀粉样蛋白1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

Fasudil alleviates beta-amyloid 1-42-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

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