乌司他丁对脓毒症急性骨丢失的保护作用

doi:10.12307/2024.824

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5649-5655.doi: 10.12307/2024.824

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乌司他丁对脓毒症急性骨丢失的保护作用

杨鹏1，唐玉彬1，2，杨京1，刘健3，姚润杰1，陈林1，苏楠1

1陆军军医大学大坪医院骨质疏松与骨发育中心/战伤组织修复与康复医学研究室/全军军事训练伤防治与康复实验室/创伤与化学中毒国家重点实验室，重庆市 400042；2中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院急诊科，甘肃省兰州市 730050；3华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2023-11-08 接受日期:2024-01-12 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 苏楠，教授，陆军军医大学大坪医院骨质疏松与骨发育中心/战伤组织修复与康复医学研究室/全军军事训练伤防治与康复实验室/创伤与化学中毒国家重点实验室，重庆市 400042 陈林，教授，陆军军医大学大坪医院骨质疏松与骨发育中心/战伤组织修复与康复医学研究室/全军军事训练伤防治与康复实验室/创伤与化学中毒国家重点实验室，重庆市 400042
作者简介:杨鹏，男，1990年生，山东省烟台市人，汉族，硕士，实验师，主要从事成纤维细胞生长因子与骨骼衰老方面的研究。唐玉彬，男，1979年生，甘肃省兰州市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事重症医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81870621)，项目负责人：苏楠；国家自然科学基金项目(81991513)，项目参与人：苏楠；国家重点研发计划项目(2018YFA0800802)，项目负责人：陈林

Protective effect of ulinastatin on acute bone loss in sepsis

Yang Peng1, Tang Yubin1, 2, Yang Jing1, Liu Jian3, Yao Runjie1, Chen Lin1, Su Nan1

1Center of Osteoporosis and Bone Development, Laboratory of Injury Repair and Rehabilitation Medicine, Laboratory for Prevention and Rehabilitation of Training Injuries, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing 400042, China; 2Emergency Department of the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 3Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2023-11-08 Accepted:2024-01-12 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Su Nan, Professor, Center of Osteoporosis and Bone Development, Laboratory of Injury Repair and Rehabilitation Medicine, Laboratory for Prevention and Rehabilitation of Training Injuries, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing 400042, China Chen Lin, Professor, Center of Osteoporosis and Bone Development, Laboratory of Injury Repair and Rehabilitation Medicine, Laboratory for Prevention and Rehabilitation of Training Injuries, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing 400042, China
About author:Yang Peng, Master, Experimentalist, Center of Osteoporosis and Bone Development, Laboratory of Injury Repair and Rehabilitation Medicine, Laboratory for Prevention and Rehabilitation of Training Injuries, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing 400042, China Tang Yubin, Master, Associate chief physician, Center of Osteoporosis and Bone Development, Laboratory of Injury Repair and Rehabilitation Medicine, Laboratory for Prevention and Rehabilitation of Training Injuries, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing 400042, China; Emergency Department of the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870621 (to SN) and 81991513 (to SN [project participant]); National Key R&D Program of China, No. 2018YFA0800802 (to CL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脓毒症：是指感染合并有全身炎症反应的表现，如体温、呼吸、循环改变等，当脓毒症合并有器官灌注不足的表现如乳酸酸中毒、少尿、急性神志改变等，称为重症脓毒症。
乌司他丁：一种非特异性蛋白酶抑制剂，又称尿胰蛋白酶抑制剂，可通过抑制多种水解酶功能保护细胞膜结构稳态。

背景：在脓毒症引发的全身炎症情况下机体会出现骨量快速丢失的现象，目前尚缺乏有效的治疗办法。乌司他丁作为一种抑炎类药物在全身炎症情况下对骨骼的具体保护作用和机制尚不明确。

目的：探讨乌司他丁对脂多糖导致的急性骨丢失是否有缓解作用。
方法：①动物实验：将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组，对照组腹腔注射生理盐水，模型组腹腔注射脂多糖，实验组腹腔注射脂多糖与乌司他丁，其中乌司他丁连续注射3 d，每组10只。乌司他丁注射14 d后，进行股骨CT扫描与病理切片观察。②细胞实验：分离培养C57BL/6小鼠颅骨原代成骨细胞，分3组处理，对照组常规培养，模型组加入脂多糖，实验组加入脂多糖与乌司他丁，检测细胞增殖与成骨分化情况。分离培养C57BL/6小鼠骨髓单核细胞，分3组处理，对照组常规培养，模型组加入脂多糖，实验组加入脂多糖与乌司他丁，检测破骨分化情况。

结果与结论：①动物实验：CT扫描与苏木精-伊红染色显示，脂多糖处理后小鼠骨量减少，乌司他丁可提升脂多糖处理后小鼠的骨量。抗酒石酸酸性磷酸染色显示，模型组骨组织破骨细胞数量增加，实验组骨组织破骨细胞数量较模型组显著减少。②细胞实验：CCK-8检测显示脂多糖处理抑制了成骨细胞的增殖，乌司他丁可提升脂多糖处理后成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶染色、茜素红染色及成骨相关基因(碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素、骨桥素、RANKL、OPG)检测显示，脂多糖处理可抑制成骨细胞的成骨分化，提升RANKL/OPG比值；乌司他丁对脂多糖诱导的成骨细胞功能降低无明显作用，但可降低RANKL/OPG比值。抗酒石酸酸性磷酸酶与破骨相关基因(抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9)检测显示，脂多糖处理可促进骨髓单核细胞的破骨分化，而乌司他丁可抑制脂多糖诱导的骨髓单核细胞破骨分化。③乌司他丁可明显抑制脂多糖引起的骨丢失，主要通过促进成骨细胞增殖、直接或间接抑制破骨细胞分化来缓解骨丢失，达到骨保护的作用。

https://orcid.org/0009-0005-1692-1159(杨鹏)；https://orcid.org/0009-0006-1277-9885(唐玉彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脂多糖, 乌司他丁, 脓毒症, 成骨细胞, 破骨细胞, 骨丢失

Abstract: BACKGROUND: Sepsis-induced systemic inflammation leads to rapid bone mass loss; however, there is a lack of effective treatments. Ulinastatin is an anti-inflammatory drug, but its protective effect and mechanism on bone under sepsis-induced systemic inflammation are still unclear.
OBJECTIVE: To explore whether ulinastatin can relieve acute bone loss caused by lipopolysaccharide.
METHODS: (1) Animal experiment. Thirty male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups (n=10 per group): control group, model group and experimental group. The control group was injected intraperitoneally with normal saline, the model group was injected intraperitoneally with lipopolysaccharide, and the experimental group was injected intraperitoneally with lipopolysaccharide and ulinastatin. In the experimental group, ulinastatin was injected continuously for 3 days. After intraperitoneal injection of ulinastatin for 14 days, femoral tissues were taken for CT scanning and pathological observation. (2) Cell experiment. C57BL/6 mouse primary osteoblasts were isolated and divided into three groups: the control group was routinely cultured, lipopolysaccharide was added to the model group, and lipopolysaccharide with ulinastatin was added to the experimental group. Cell proliferation and osteogenic differentiation were detected. C57BL/6 mouse bone marrow mononuclear cells were isolated and divided into three groups: the control group was routinely cultured, lipopolysaccharide was added to the model group, and lipopolysaccharide and ulinastatin were added to the experimental group. Osteoclast differentiation was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Animal experiment. CT scanning and hematoxylin-eosin staining showed that bone mass in lipopolysaccharide-treated mice was reduced but increased after treatment with ulinastatin. Tartrate resistant acid phosphatase staining showed that the number of osteoclasts in bone tissue increased in the model group, but significantly decreased in the experimental group compared with the model group. (2) Cell experiment. Cell counting kit-8 assay showed that lipopolysaccharide treatment inhibited the proliferation of osteoblasts, and ulinastatin elevated the proliferation of osteoblasts after lipopolysaccharide treatment. Alkaline phosphatase staining, alizarin red staining and osteogenesis-related gene (alkaline phosphatase, Runx2, osteocalcin, osteoblastin, nuclear factor κB receptor-activating factor ligand, osteoprotegerin) detection showed that lipopolysaccharide treatment inhibited osteogenic differentiation of osteoblasts and elevated the nuclear factor κB receptor-activating factor ligand/osteoprotegerin ratio; ulinastatin did not have any significant effect on the reduction of osteoblast function induced by lipopolysaccharide but decreased the nuclear factor κB receptor-activating factor ligand/osteoprotegerin ratio. Tartrate resistant acid phosphatase staining and osteoclast-related gene (tartrate resistant acid phosphatase and matrix metalloproteinase 9) detection showed that lipopolysaccharide treatment could promote osteoclast differentiation of bone marrow monocytes, while ulinastatin could inhibit lipopolysaccharide-induced osteoclast differentiation of bone marrow monocytes. (3) Overall, ulinastatin can significantly inhibit lipopolysaccharide-induced bone loss, mainly through promoting osteoblast proliferation and directly or indirectly inhibiting osteoclast differentiation to alleviate bone loss and achieve osteoprotective effects.

Key words: lipopolysaccharide, ulinastatin, sepsis, osteoblast, osteoclast, bone loss

中图分类号:

杨鹏, 唐玉彬, 杨京, 刘健, 姚润杰, 陈林, 苏楠. 乌司他丁对脓毒症急性骨丢失的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5649-5655.

Yang Peng, Tang Yubin, Yang Jing, Liu Jian, Yao Runjie, Chen Lin, Su Nan. Protective effect of ulinastatin on acute bone loss in sepsis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5649-5655.

图/表（结果） 8

2.1 乌司他丁可有效缓解脂多糖诱导的骨丢失 30只小鼠全部进入结果分析。
各组小鼠股骨CT扫描重建结果见图1。与对照组比较，模型组小鼠骨量丢失严重，骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均明显降低(P < 0.01)，表明脂多糖能引发小鼠骨量减少。与模型组比较，实验组小鼠骨量明显增加，骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度显著增加(P < 0.05，P < 0.01)，表明乌司他丁对于急性骨丢失具有明显的保护作用。

2.2 乌司他丁可减轻脂多糖造成的成骨细胞数量减少，参与骨量维持上述显微CT扫描及统计结果显示乌司他丁能够缓解脂多糖导致的骨丢失，但具体机制尚不清楚。成骨细胞的骨生成功能与破骨细胞的骨吸收功能协同发挥作用，共同调节了骨量的稳态。在乌司他丁的作用机制研究方面，探讨了其是否通过影响成骨细胞功能来缓解脂多糖诱导的骨丢失。
各组小鼠骨组织苏木精-伊红染色结果见图2。相较于对照组，模型组小鼠骨量减少，并且成骨细胞明显减少，实验组小鼠骨量及成骨细胞数量较模型组明显增加。

为研究乌司他丁如何影响脂多糖引发的成骨细胞功能障碍，进行了体外成骨细胞成骨诱导实验，结果显示乌司他丁对脂多糖引起的成骨细胞分化和矿化障碍无明显缓解作用，见图3。

成骨细胞增殖实验显示，脂多糖显著抑制原代成骨细胞的增殖，而乌司他丁可以明显缓解脂多糖对成骨细胞增殖的抑制作用，见图4。

Q-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组细胞碱性磷酸酶、Runx2、骨桥素、骨钙素的mRNA表达降低(P < 0.01)；与模型组比较，实验组细胞碱性磷酸酶、Runx2、骨桥素、骨钙素的mRNA表达无明显变化(P > 0.05)，见图5。提示乌司他丁对脂多糖导致的成骨细胞分化功能降低无明显缓解作用。

以上结果显示，乌司他丁的骨保护作用主要是通过促进成骨细胞增殖来保证成骨细胞数量稳定的。
2.3 乌司他丁可显著减少脂多糖造成的破骨细胞生成骨吸收功能的发挥离不开破骨细胞，腹腔注射脂多糖可以引发小鼠全身炎症反应，进而激活破骨细胞功能，最终导致骨丢失。乌司他丁是重要的抗炎药物，因此研究了乌司他丁对破骨细胞的影响。
小鼠骨组织抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，与对照组相比，模型组破骨细胞的数量和表面积明显增加，实验组破骨细胞数量和表面积较模型组显著减少，见图6A-C，表明乌司他丁可通过抑制破骨细胞的形成来缓解脂多糖诱导的骨丢失。
为了研究乌司他丁是否直接对破骨细胞发挥调控作用，进行了破骨细胞体外诱导实验，结果显示脂多糖处理后破骨细胞的数量明显增加，实验组破骨细胞数量较模型组显著减少，见图6D，说明乌司他丁对脂多糖造成的破骨细胞形成有抑制作用。
Q-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9的mRNA表达升高(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组比较，实验组抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9的mRNA表达降低(P < 0.01)，见图6E，F。结果说明乌司他丁能够通过抑制破骨相关基因的表达抑制破骨细胞分化。

2.4 乌司他丁可通过降低RANKL/OPG的比值来降低骨吸收程度见图7。RANKL可以结合破骨细胞及其前体细胞细胞膜上表达的核因子κB受体活化子，促进破骨细胞的分化和形成[22]。成骨细胞分泌的OPG能够与核因子κB受体活化子竞争性结合RANKL，阻碍破骨细胞产生。骨髓中RANKL/OPG比值无论在正常还是疾病状态都是骨量的一个重要决定因素[23-24]。

Q-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组细胞RANKL mRNA表达、RANKL/OPG比值升高(P < 0.01)，OPG mRNA表达降低(P < 0.01)；与模型组比较，实验组细胞RANKL、OPG mRNA表达升高，RANKL/OPG比值降低(P < 0.05)。表明乌司他丁可以抑制脂多糖造成的破骨细胞分化，通过降低RANKL/OPG比值来降低骨吸收水平，从而对骨骼稳态起到保护作用。

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引言

材料方法

1.1 设计动物实验+体外细胞实验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年8月在陆军特色医学中心SPF实验动物中心2楼进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3 d龄C57BL/6小鼠6只，用于分离培养原代成骨细胞；3月龄雄性C57BL/6小鼠5只，体质量28-30 g，用于分离培养骨髓单核细胞；8周龄雄性C57BL/6小鼠30只，体质量22-24 g，用于动物实验。实验动物均由陆军特色医学中心SPF实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK (渝)2022-0011，使用许可证号：SYXK(渝)2022-0018。饲养于陆军特色医学中心SPF实验动物中心，环境温度为20-26 ℃，相对湿度 40%-70%，噪声60 dB以下，通风换气≥15次/h，光照循环条件为12 h/12 h明暗交替。实验方案经陆军军医大学实验动物福利伦理委员会批准，批准号：AMUWEC20237076。
1.3.2 实验仪器及试剂脂多糖(Sigma，货号：L4005-100MG)；乌司他丁(天普洛安)；活体小动物显微CT(viva CT 40)；生物安全柜、细胞培养箱、超低温冰箱、Varioskan LUX多功能酶标仪、液氮罐(Thermo)；荧光定量PCR仪(BioRAD)；图像采集系统(Leica)；胎牛血清、Ⅰ型胶原酶(Gibco)；α-MEM基础培养基、0.25%胰酶、双抗(HyClone)；碱性磷酸酶酶染色试剂盒(Sigma，货号：86C-1KT)；β-磷酸甘油二钠盐(Solarbio，货号：G8100)；维生素C(Sangon Biotech，货号： A610021 -0100)；地塞米松(Sigma，货号：D4902-100MG)；茜素红(Sigma)；Trizol (Invitrogen)；反转录试剂Prime ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，货号：RR037A)；细胞增殖检测试剂盒CCK-8(Solarbio，货号：CA1210)；荧光定量试剂TB Green® Premix Ex Taq™Ⅱ(TaKaRa，货号：RR820A)；核因子κB 受体激活因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)(Peprothech，货号：315-11-10UG)；巨噬细胞集落刺激因子(Peprothech，货号：142-12CB-06)。
1.4 方法
1.4.1 动物实验
构建急性骨丢失小鼠模型与实验分组：取8周龄雄性C57BL/6小鼠30只，采用随机数字表法分成对照组、模型组、实验组，每组10只。模型组小鼠腹腔注射15 mg/kg的脂多糖构建急性骨丢失模型[16]，药物注射14 d后，通过CT扫描与病理切片观察骨量丢失验证造模成功；实验组小鼠腹腔注射15 mg/kg的脂多糖+10×104 U/kg的乌司他丁[15，17]，乌司他丁连续注射3 d，首次与脂多糖同时注射；对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。
取材：药物注射14 d后，腹腔注射0.8%戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，获取股骨股骨、胫骨，置于40 g/L多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，切片厚度为5 μm。
CT扫描：使用活体小动物显微CT扫描小鼠股骨，扫描参数：70 kV，114 µA，15 μm。扫描完成后进行骨小梁部位重建，重建层数为200层，分析统计小鼠股骨骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数目。
病理切片观察：①苏木精-伊红染色：将石蜡切片置于57-65 ℃烤箱中30 min，二甲苯脱蜡30 min，然后按体积分数100%，95%，75%，50%乙醇、水的顺序各5 min复水；苏木精染色2 min，伊红染色20 s，漂洗，晾干后中性树脂封固。②抗酒石酸酸性磷酸酶染色：脱蜡和复水同上；抗酒石酸酸性磷酸酶染液37 ℃避光染色10 min，甲基绿复染，晾干后中性树脂封固。采用BIOQUANT OSTEO图像采集分析系统对苏木精-伊红与抗酒石酸酸性磷酸酶染色标本切片中成骨细胞和破骨细胞进行计量。
1.4.2 成骨细胞实验
分离提取小鼠原代成骨细胞：取3 d龄C57BL/6小鼠6只，腹腔注射0.8%戊巴比妥钠(80 mg/kg)麻醉后处死，置于体积分数75%乙醇中浸泡5 min，在超净工作台分离小鼠颅骨，用PBS洗净，采用胰酶37 ℃处理10 min以去除颅骨表层残留的骨膜，用PBS漂洗干净后使用消毒手术剪剪碎，采用0.2 mg/mL胶原酶Ⅰ消化，每间隔30 min吹打混匀帮助消化，共3次。800 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS重悬漂洗两三次后接种培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中。成骨细胞培养基：α-MEM基础培养基+体积分数5%胎牛血清+1%双抗。
成骨细胞增殖实验：将原代成骨细胞按照5 000个/孔的密度接种在96孔板中，细胞贴壁后分3组干预，对照组更换为新的成骨细胞培养基，模型组更换为含100 ng/mL脂多糖的成骨细胞培养基[18-19]，实验组更换为含100 ng/mL脂多糖+500 U/mL乌司他丁的成骨细胞培养基[20]。培养24 h后移除培养基，用PBS漂洗2次，将含有CCK-8增殖检测试剂的培养基加入培养板(100 μL/孔)孵育约1 h，使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值。
成骨细胞成骨诱导实验：将第2代成骨细胞按1.5×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，观察细胞融合至85%左右进行成骨诱导，对照组更换为成骨诱导培养基，模型组更换为含100 ng/mL脂多糖的成骨诱导培养基，实验组更换为含100 ng/mL脂多糖+500 U/mL乌司他丁的成骨诱导培养基。每2 d换液1次。成骨诱导培养基为含50 μg/L维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油二钠盐、10 nmol/L地塞米松的成骨细胞培养基。
茜素红染色：成骨诱导14 d后，取细胞漂洗固定，加入茜素红染液染色约30 min，漂洗后晾干保存，显微镜下观察拍照。利用酶标仪在415 nm波长处检测吸光度值。
碱性磷酸酶染色：成骨诱导14 d后，取细胞固定洗涤，加入碱性磷酸酶染色液(现用现配)37 ℃孵育30 min，移除染色液，双蒸水洗去浮色，晾干拍照。
碱性磷酸酶染色活性检测：成骨诱导14 d后，将细胞置于冰上漂洗2次，加入300 μL细胞裂解液，充分裂解后收集细胞裂解液，超声处理后4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清。取30 μL上清与300 µL碱性磷酸酶活性测定液37 ℃孵育30 min，转移反应液移至96孔板，200 μL/孔×3，于405 nm波长检测吸光度值。吸取30 μL细胞裂解液上清加入70 μL生理盐水，加入500 μL BCA工作液，37 ℃反应30 min，将反应液移至96孔板中，200 μL/孔×3，于562 nm波长检测吸光度值。取每个样品的A405/562比值做统计分析。

成骨相关基因检测：成骨诱导3 d后收集细胞，使用Trizol提取RNA，RNA提取后于NanoDrop 2000检测RNA质量。将RNA用反转录试剂PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，用荧光定量试剂TB Green® Premix Ex Taq™Ⅱ进行荧光定量PCR，每孔反应体系为20 μL，包括TB GreenⅡ 10 μL、cDNA 2 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、无菌水6.4 μL。于BioRAD荧光定量PCR仪进行反应：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40个循环；72 ℃ 20 s，72 ℃10 min。以Cyclophillin A为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算Runx2、骨桥素、骨钙素、碱性磷酸酶、RANKL、OPG (Osteoprotegerin)的mRNA表达。引物序列见表1[21]。

1.4.3 骨髓单核细胞实验
分离提取骨髓单核细胞：取3月龄雄性C57BL/6小鼠5只，腹腔注射0.8%戊巴比妥钠麻醉后处死，置于体积分数75%乙醇中消毒，于生物安全柜中用消毒器械分离股骨、胫骨，置于α-MEM基础培养基中，用剪刀暴露骨骼两端后，使用完全培养基(α-MEM基础培养基+体积分数5%胎牛血清+1%双抗)将骨髓冲洗到培养皿中收集细胞进行培养，24 h后收集未贴壁细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，使用培养基重悬细胞沉淀。
骨髓单核细胞破骨诱导分化实验：将骨髓单核细胞按1.5×105/孔的密度接种于12孔细胞培养板中，加含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基促进细胞增殖2 d，然后分3组干预，对照组更换为含破骨诱导培养基(含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子+80 ng/mL RANKL的完全培养基)，模型组更换为含100 ng/mL脂多糖的破骨诱导培养基，实验组更换为含100 ng/mL脂多糖+500 U/mL乌司他丁的破骨诱导培养基。每2 d天换液1次。破骨诱导6 d后，取出细胞，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(方法同上)。破骨诱导3 d后，收集细胞，采用Q-PCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9的mRNA表达，检测方法同上。引物序列见表1。
1.5 主要观察指标乌司他丁对脂多糖导致的急性骨丢失的作用，以及对成骨细胞成骨分化、骨髓单核细胞破骨分化的影响。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，数据以x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已通过陆军军医大学大坪医院生物统计学专家审核。

讨论

骨骼为一个多功能器官，其平衡状态是由成骨细胞和破骨细胞共同发挥作用维持的。随着对骨骼研究的深入，研究人员发现破骨细胞功能严重缺乏会导致造血功能衰竭等[25-27]。骨钙素由成骨细胞产生，除了调节骨量外还参与调节糖脂代谢、生殖、肌肉的形成[28-30]，以及影响大脑认知和情绪、影响子代大脑发育等[31]。同时，骨源性因子还与电解质平衡密切相关[32]，此外骨骼也是一种活跃的糖调节器官，它可以摄取人体吸收的大部分葡萄糖，这一过程便是骨形成和维持全身葡萄糖稳态的必要条件[33-34]。总之，骨骼系统的健康稳定是决定人正常生活工作的关键因素，可以说骨骼健康意义重大。
脓毒症是一种可以威胁生命的器官功能障碍综合征，在全身炎症反应的情况下骨量会快速丢失，形成溶骨现象，目前尚缺乏有效治疗方法[4-5]。近几年，以破骨细胞形成和分化增加为特点的骨质破坏性骨病的发病率正在增加，在骨丢失过程中核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路会被RANKL受体激活剂、炎症因子和氧化应激等激活[35-37]。脂多糖是所有革兰阴性细菌外膜的重要成分，是首个被发现能够在体外诱导骨吸收的细菌成分[38]。脂多糖是由细胞因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等)刺激巨噬细胞和其他细胞产生的，可以提升RANKL基因的表达，诱导破骨细胞的生成[23，39-41]；脂多糖还可提升破骨细胞相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9和核因子κB受体活化子的表达升高[42]。脂多糖可引发骨量丢失、成骨细胞数量减少、破骨细胞数量增多等现象。实验证明，脂多糖处理后成骨细胞的分化能力减弱；与此同时，定量PCR检测到RANKL等破骨细胞相关基因的表达上调，破骨细胞形成能力增强，骨重塑失衡。通过腹腔注射脂多糖的方法可以构建小鼠炎症型急性骨丢失模型，该模型可作为以后骨丢失机制及相关药物研究的有效工具。
乌司他丁具有调控炎症反应的作用，被广泛应用于临床治疗常见急危重症如急性胰腺炎、休克、脓毒症、多种急性中毒、严重创伤等[43]。骨量的维持由成骨细胞成骨和破骨细胞骨吸收共同决定。此次体内实验CT扫描结果显示，实验组小鼠骨量水平明显高于模型组，说明乌司他丁对脂多糖诱导的骨丢失具有较好的缓解作用。进一步的体外实验发现，乌司他丁对成骨细胞的分化和矿化无明显作用，但乌司他丁可明显提高成骨细胞的增殖能力，缓解了脂多糖对成骨细胞增殖的抑制作用，一定程度上维持成骨细胞数量的稳定，表明乌司他丁能够通过促进成骨细胞增殖减轻脂多糖诱导的骨丢失。
无论是在健康还是在疾病状态下，骨髓中RANKL/OPG比值都是决定骨量的重要因素之一[24，44]，RANKL/OPG的比值越大，破骨细胞的分化形成越活跃，骨吸收程度越高；而RANKL/OPG的比值越低，骨保护能力越强，因此，RANKL/OPG比值在骨丢失研究中常被作为评估骨吸收程度的常用参数。此次实验结果显示，实验组骨髓单核细胞破骨分化中的RANKL/OPG比值相较于模型组显著降低，说明乌司他丁可通过降低破骨细胞骨吸收功能缓解脂多糖诱导的急性骨丢失。此次实验证实乌司他丁可显著降低脂多糖诱导的炎症性骨丢失，其作用机制可能为：一方面，通过促进成骨细胞的增殖以维持成骨细胞数量稳定，但具体机制尚不明确；另一方面，通过直接或间接的方法抑制破骨细胞的形成。有研究指出，乌司他丁可以通过抑制炎症因子的过度释放来抑制破骨细胞形成，进而缓解骨丢失[9，12]。此外，乌司他丁对抗炎细胞因子及破骨细胞影响的研究也有待开展。综上所述，乌司他丁可能成为骨丢失有关疾病治疗的潜在治疗药物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

乌司他丁对脓毒症急性骨丢失的保护作用

Protective effect of ulinastatin on acute bone loss in sepsis

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