鼠尾草酸影响线粒体功能抑制破骨细胞分化

doi:10.12307/2025.205

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 245-253.doi: 10.12307/2025.205

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鼠尾草酸影响线粒体功能抑制破骨细胞分化

李海山1，2，3，吴宇桁3，4，梁梓炫1，2，3，张诗茵1，2，3，张朕1，2，3，麦彬1，2，3，邓威1，2，3，李永贤1，2，唐永超1，2，张顺聪1，2，袁凯1，2

1广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；2广东省中医临床研究院，广东省广州市 510405；3广州中医药大学岭南医学研究中心，广东省广州市 510405；4广州中医药大学第七临床医学院，广东省深圳市 518100

收稿日期:2023-12-15 接受日期:2024-01-25 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-24
通讯作者: 袁凯，博士，副主任医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；广东省中医临床研究院，广东省广州市 510405 并列通讯作者：张顺聪，博士，主任医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；广东省中医临床研究院，广东省广州市 510405
作者简介:李海山，男，1997年生，广东省广州市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，医师，主要从事脊柱退行性疾病诊疗与中医药防治骨质疏松疾病研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(202201020295)，项目负责人：袁凯；广东省基础与应用基础研究基金项目(2021A1515012168)，项目负责人：张顺聪；广州市科技计划项目(202201020500)，项目负责人：唐永超；广州市科技计划项目(202201020533)，项目负责人：张顺聪；
广州市科技计划项目(202102021040)，项目负责人：李永贤；广州中医药大学第一附属医院中青年重点人才培养项目(2023.10)，项目负责人：李永贤；中华中医药学会青年人才托举工程项目(2022-QNRC2-B11)，项目负责人：李永贤

Carnosic acid inhibits osteoclast differentiation by inhibiting mitochondrial activity

Li Haishan1, 2, 3, Wu Yuheng3, 4, Liang Zixuan1, 2, 3, Zhang Shiyin1, 2, 3, Zhang Zhen1, 2, 3, Mai Bin1, 2, 3, Deng Wei1, 2, 3, Li Yongxian1, 2, Tang Yongchao1, 2, Zhang Shuncong1, 2, Yuan Kai1, 2

1First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Guangdong Clinical Research Academy of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 4Seventh Clinical College of Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China

Received:2023-12-15 Accepted:2024-01-25 Online:2025-01-18 Published:2024-05-24
Contact: Yuan Kai, MD, Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangdong Clinical Research Academy of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China Co-corresponding author: Zhang Shuncong, MD, Chief physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangdong Clinical Research Academy of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Li Haishan, Master candidate, Physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangdong Clinical Research Academy of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangzhou Science and Technology Project, No. 202201020295 (to YK); The Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2021A1515012168 (to ZSC); Guangzhou Science and Technology Project, No. 202201020500 (to TYC); Guangzhou Science and Technology Project, No. 202201020533 (to ZSC); Guangzhou Science and Technology Project, No. 202102021040 (to LYX); The Young and Middle aged Key Talent Cultivation Project of The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, No. 2023.10 (to LYX); Youth Talent Lifting Project of Chinese Society of Traditional Chinese Medicine, No. 2022-QNRC2-B11 (to LYX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
鼠尾草酸：是一种主要来源于唇形科鼠尾草和迷迭香的天然酚类二萜化合物，具有广泛的药理和生物学作用，包括抑制肥胖、抗肿瘤、抗氧化和抗炎活性。
线粒体：是细胞中制造能量的细胞器及细胞有氧呼吸的主要场所，主要功能包括代谢调节、合成蛋白质、维持细胞功能、促进能量代谢等。

背景：鼠尾草酸是在迷迭香中发现的一种生物活性化合物，已被证明可减少炎症和活性氧，但在破骨细胞分化进程中的作用机制尚不明确。
目的：探讨鼠尾草酸对破骨细胞活化、活性氧产生及线粒体功能的影响。
方法：体外提取培养小鼠来源的原代骨髓源巨噬细胞，使用CCK-8细胞活力实验检测不同浓度(0，10，15，20，25和30 μmol/L)鼠尾草酸对骨髓源巨噬细胞的增殖和毒性作用，筛选出安全作用浓度。将骨髓源巨噬细胞按照浓度梯度分组培养，核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞5-7 d后，分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色、F-actin染色、H2DCFDA探针和线粒体活性氧、Mito-Tracker荧光检测，观察鼠尾草酸对破骨细胞分化和功能的影响；通过Western Blot及RT-PCR实验检测鼠尾草酸对核因子κB受体活化因子配体诱导的丝裂原激活蛋白激酶信号通路上下游基因和蛋白的影响。
结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶和F-actin染色显示：鼠尾草酸以浓度依赖性地抑制体外破骨细胞分化及细胞骨架肌动蛋白环形成，其中鼠尾草酸30 μmol/L组的抑制作用最显著；与其他干预时期相比，鼠尾草酸在破骨分化的早期(第1-3天)抑制作用最显著；②H2DCFDA探针和线粒体活性氧、Mito-Tracker荧光显示：鼠尾草酸抑制细胞活性氧和线粒体内活性氧的产生，同时减少线粒体膜电位，影响线粒体的功能；③Western Blot及RT-PCR结果显示：鼠尾草酸可抑制与破骨分化相关的NFATc1、CTSK、MMP9、C-fos蛋白的表达，下调与破骨分化相关的NFATc1、Atp6vod2、ACP5、CTSK和C-fos基因的表达；鼠尾草酸还可以增强抗氧化酶蛋白的表达，减少破骨分化过程中活性氧的产生；④鼠尾草酸抑制P38/ERK/JNK蛋白的磷酸化修饰，通过激活MAPK信号通路抑制骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化。
https://orcid.org/0000-0002-2102-7021(李海山)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 鼠尾草酸, 活性氧, 线粒体活性, RANKL, 破骨细胞

Abstract: BACKGROUND: Carnosic acid, a bioactive compound found in rosemary, has been shown to reduce inflammation and reactive oxygen species (ROS). However, its mechanism of action in osteoclast differentiation remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of carnosic acid on osteoclast activation, ROS production, and mitochondrial function.
METHODS: Primary bone marrow-derived macrophages from mice were extracted and cultured in vitro. Different concentrations of carnosic acid (0, 10, 15, 20, 25 and 30 μmol/L) were tested for their effects on bone marrow-derived macrophage proliferation and toxicity using the cell counting kit-8 cell viability assay to determine a safe concentration. Bone marrow-derived macrophages were cultured in graded concentrations and induced by receptor activator of nuclear factor-κB ligand for osteoclast differentiation for 5-7 days. The effects of carnosic acid on osteoclast differentiation and function were then observed through tartrate-resistant acid phosphatase staining, F-actin staining, H2DCFDA probe and mitochondrial ROS, and Mito-Tracker fluorescence detection. Western blot and RT-PCR assays were subsequently conducted to examine the effects of carnosic acid on the upstream and downstream proteins of the receptor activator of nuclear factor-κB ligand-induced MAPK signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase staining and F-actin staining showed that carnosic acid dose-dependently inhibited in vitro osteoclast differentiation and actin ring formation in the cell cytoskeleton, with the highest inhibitory effect observed in the high concentration group
(30 μmol/L). Carnosic acid exhibited the most significant inhibitory effect during the early stages (days 1-3) of osteoclast differentiation compared to other intervention periods. Fluorescence imaging using the H2DCFDA probe, mitochondrial ROS, and Mito-Tracker demonstrated that carnosic acid inhibited cellular and mitochondrial ROS production while reducing mitochondrial membrane potential, thereby influencing mitochondrial function. The results of western blot and RT-PCR revealed that carnosic acid could suppress the expression of NFATc1, CTSK, MMP9, and C-fos proteins associated with osteoclast differentiation, and downregulate the expression of NFATc1, Atp6vod2, ACP5, CTSK, and C-fos genes related to osteoclast differentiation. Furthermore, carnosic acid enhanced the expression of antioxidant enzyme proteins and reduced the generation of ROS during the process of osteoclast differentiation. Overall, carnosic acid exerts its inhibitory effects on osteoclast differentiation by inhibiting the phosphorylation modification of the P38/ERK/JNK protein and activating the MAPK signaling pathway in bone marrow-derived macrophages.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: carnosic acid, reactive oxygen species, mitochondrial activity, RANKL, osteoclasts

中图分类号:

李海山, 吴宇桁, 梁梓炫, 张诗茵, 张朕, 麦彬, 邓威, 李永贤, 唐永超, 张顺聪, 袁凯. 鼠尾草酸影响线粒体功能抑制破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 245-253.

Li Haishan, Wu Yuheng, Liang Zixuan, Zhang Shiyin, Zhang Zhen, Mai Bin, Deng Wei, Li Yongxian, Tang Yongchao, , Zhang Shuncong, , Yuan Kai, . Carnosic acid inhibits osteoclast differentiation by inhibiting mitochondrial activity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 245-253.

图/表（结果） 8

2.1 鼠尾草酸抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞破骨分化潜能鼠尾草酸的化学结构式见图1A。为了探讨鼠尾草酸对RANKL诱导的破骨细胞生成和细胞毒性的影响，选择小鼠来源的骨髓源巨噬细胞作为破骨细胞前体细胞。将不同浓度的鼠尾草酸与骨髓源巨噬细胞共孵育以检测细胞毒性。 CCK-8实验验证鼠尾草酸对细胞毒性和细胞增殖的影响，结果表明，与单纯的完全培养基相比，鼠尾草酸10-30 μmol/L对骨髓源巨噬细胞没有潜在的细胞毒性，见图1B。为了确定鼠尾草酸对破骨细胞形成的影响，将骨髓源巨噬细胞与不同浓度的鼠尾草酸和破骨细胞诱导培养基一起孵育特定时间，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒检测成熟破骨细胞时，在RANKL刺激后出现许多多核抗酒石酸酸性磷酸酶阳性破骨细胞，而增加鼠尾草酸浓度会增强对骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化的抑制作用，见图1C，D。这些结果表明鼠尾草酸对骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化的抑制呈浓度依赖性。
2.2 鼠尾草酸抑制骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化的细胞骨架F-actin环形成 F-actin环的形成在成熟破骨细胞的形成中起着至关重要的作用[15]。因此，用免疫荧光染色骨髓源巨噬细胞、F-actin环和细胞核(DAPI)来观察破骨细胞的大小和核聚集，并评估鼠尾草酸干预和不干预对破骨细胞形成的影响。RANKL刺激后，成熟破骨细胞(含3个以上细胞核)数量显著增加。随着鼠尾草酸浓度的增加，F-actin环的大小和环内细胞核的数量明显减少，见图2A-C。这些结果表明，鼠尾草酸以剂量依赖的方式减弱破骨分化的细胞骨架和核聚集来抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成。
2.3 鼠尾草酸降低骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化标志基因的表达通过RT-PCR检测鼠尾草酸对破骨细胞特异性基因的影响。正如预期的那样，不同浓度的鼠尾草酸抑制了NFATc1、Atp6vod2、ACP5、CTSK和C-fos在骨髓源巨噬细胞中的相对表达水平，抑制的程度与鼠尾草酸的浓度有关，见图3。这些结果表明，鼠尾草酸在体外抑制破骨细胞的形成，并抑制破骨细胞特异性标志基因的表达。
2.4 鼠尾草酸降低骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化关键蛋白的表达 C-Fos与NFATc1的转录激活密切相关，在RANKL诱导的信号转导中发挥重要作用[14，16]。选取30 μmol/L浓度观察鼠尾草酸对破骨细胞分化关键蛋白表达的影响。Western blot结果表明，RANKL的加入增加了CTSK、C-fos、MMP9和NFATc1的表达，而鼠尾草酸则逆转这些作用，在第3天和第5天抑制了CTSK、C-fos、MMP9和NFATc1的表达，见图4A-E。
2.5 鼠尾草酸通过激活MAPK信号通路抑制破骨细胞分化 MAPK信号通路包括P38、JNK和ERK三个主要家族成员，位于调节破骨细胞分化的RANKL信号通路下游[17]。因此，研究了这些信号通路是否参与了鼠尾草酸对RANKL诱导的破骨细胞生成的抑制。Western blot结果显示，鼠尾草酸处理15 min时，P38的磷酸化受到抑制，随后得到恢复，见图5A，B)。JNK的磷酸化水平在鼠尾草酸干预的45-60 min受到抑制，而ERK在鼠尾草酸处理的15-60 min内磷酸化水平持续被抑制，可能是抑制破骨细胞分化主要激活的信号通路，见图5A-D。
2.6 鼠尾草酸减少了骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化中活性氧的产生为了检测鼠尾草酸对RANKL诱导的破骨细胞分化中活性氧的影响，使用敏感的活性氧探针H2DCFDA和荧光显微镜检测细胞内活性氧的产生。当骨髓源巨噬细胞被RANKL刺激时，经鼠尾草酸15 μmol/L和30 μmol/L处理后，DCFs的荧光强度呈剂量依赖性地下降，鼠尾草酸显著减少了骨髓源巨噬细胞中活性氧的产生，见图6。相同操作下的流式检测结果也表明鼠尾草酸以浓度依赖性抑制细胞活性氧的产生，结果表明，鼠尾草酸通过降低活性氧活性而抑制RANK诱导的破骨细胞形成。
2.7 鼠尾草酸激活Nrf2-Keap1通路增强了破骨分化中抗氧化酶的表达在正常的生理状态下，活性氧的清除依赖于几种抗氧化酶[18- 19]。因此，研究了关键抗氧化酶Nrf2、Keap1、HO-1、SOD1和Catalase的表达。Western bolt分析表明，鼠尾草酸激活了Nrf2-Keap1通路，增加了RANKL诱导后HO-1、SOD1和Catalase的蛋白表达，见图7A-F。综上所述，鼠尾草酸通过增加活性氧清除酶的表达减少活性氧的产生，有效地抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化。
2.8 鼠尾草酸损害了破骨细胞分化中线粒体活性发挥由于线粒体呼吸链是活性氧产生的主要来源[19-20]，进一步检测了线粒体中的活性氧水平，见图8A，B。RANKL刺激促进线粒体活性氧的积累，而鼠尾草酸干预减弱了RANKL诱导的线粒体活性氧产生。在呼吸和氧化磷酸化过程中，线粒体产生的能量以线粒体膜电位的方式表现出来[21-22]。由于破骨细胞分化中的能量密集性，见图8C，D所示，成熟破骨细胞的线粒体膜电位相对增加，而线粒体膜电位在鼠尾草酸处理下以浓度依赖性方式降低。总体而言，鼠尾草酸通过损害线粒体活性发挥起到抑制破骨细胞分化的作用。

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引言

骨骼是一种极具活力的器官，在其整个生命周期中不断更新和重塑，即使在成年人中也是如此，而骨重塑被认为是一个动态、平衡的过程[1]。当成骨细胞介导的骨生成和破骨细胞介导的骨吸收的平衡被破坏时，例如在女性更年期，骨量会减少，并伴随着骨髓内结构空间的增加，最终导致骨质疏松症[2]。在目前骨质疏松症的治疗中，抗骨吸收药物，包括双膦酸盐(阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐等)和狄诺塞麦，通过抑制破骨细胞介导的骨吸收来增加骨矿物质密度并降低骨折风险[3]。但西药治疗费用较高，且临床不良反应不确定，如存在发热、关节肌痛、低钙血症等潜在不良事件[4]。而药食同源的中药因在治疗骨质疏松症方面具有成本低、不良反应少等优点，成为了骨质疏松症防治研究的热点内容[5]。
破骨细胞是来源于造血祖细胞的大型多核细胞，成熟破骨细胞的形成依赖于几个关键因素，包括巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)[6]。RANKL诱导多种早期信号转导通路的激活，例如NF-κB和丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，最终导致原癌基因Fos(protooncogene，C-fos)和活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)的激活[7]。NFATc1促进破骨细胞成熟基因的表达，包括耐酒石酸酸性磷酸酶(recombinant acid phosphatase 5，tartrate resistant，ACP5)、组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)和Atp6vod2可以刺激破骨细胞前体的成熟，并增加破骨细胞相关蛋白的活性[8]。因此，NFATc1在RANKL诱导的破骨细胞生成过程中充当主转录因子[9]。越来越多的研究还表明，活性氧通过促进RANKL诱导的信号传导对于破骨细胞生成至关重要[10-11]。
鼠尾草酸是从唇形科植物鼠尾草和迷迭香中分离出来的，现在研究表明鼠尾草酸具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗氧化和抗炎作用等[12]。最近，随着对鼠尾草酸药理作用研究的深入，鼠尾草酸在骨代谢领域中抑制破骨细胞分化、挽救去卵巢导致的骨量丢失的作用逐渐被发现。有研究发现，鼠尾草酸通过双重靶向SREBP2和ERRα，从而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成并改善去卵巢诱导的骨丢失，表明鼠尾草酸可以作为药物治疗骨质疏松症的理想化合物[13]。然而，鼠尾草酸对RANKL诱导的破骨细胞分化中活性氧产生和线粒体活性的影响尚未可知，该项研究通过体外鼠尾草酸干预含有RANKL和巨噬细胞集落刺激因子完全培养基诱导的骨髓源巨噬细胞，探讨鼠尾草酸对骨髓源巨噬细胞破骨分化潜能的影响及MAPK信号通路激活情况。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞干预实验，两组间比较采用student t-test，多组间比较采用单因素方差分析。实验方案获得广州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准通过(批准号：20230417003)。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年10月在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄C57BL/6J小鼠购自广州中医药大学动物实验中心(中国广州)，许可证号：SCXK (粤)2018-0034。C57BL/6J小鼠用于原代骨髓源巨噬细胞的提取。
1.3.2 主要试剂和仪器鼠尾草酸(纯度> 99%，MCE公司，美国)；α-MEM基础培养基、澳洲胎牛血清、磷酸盐缓冲液(1×PBS) 、0.25%胰酶和TBST缓冲液(Gibco 公司，美国)；重组小鼠TRANCE/RANK L/TNFSF11 (R&D Systems公司，美国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司，美国)；CCK-8检测试剂盒、BCA试剂盒、H2DCFDA探针试剂盒和线粒体活性氧试剂盒(Biosharp公司，中国)；TRIZOL、罗丹明鬼笔环肽 (Thermo Fisher Scientific公司，中国)；抗荧光淬灭DAPI染色液和线粒体Mito-Tracker试剂盒 (Beyotime公司，中国)；CTSK抗体、C-fos抗体、NFATc1抗体和SOD1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)；β-actin抗体、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)抗体、ERK抗体、p-ERK 抗体、JNK抗体、p-JNK抗体、P38抗体、p-P38 抗体、Nrf2抗体、Keap1抗体、Catalase抗体和HO-1抗体 (CST公司，美国)；山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(Bioss公司，美国)；RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液和快速封闭液(NCM Biotech公司，中国)；超敏ECL化学发光试剂盒；EvoM-MLV反转录试剂盒、SYBR® Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(Accurate Biology，中国)；NFATc1、Atp6vod2、ACP5、CTSK和C-fos基因引物 (艾科瑞生物公司，中国 )；全能型凝胶成像系统和PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓源巨噬细胞获取与培养遵循动物伦理指南，麻醉后切除C57BL/6J小鼠的双下肢股骨，去除股骨两端骨骺，在无菌环境下，用1 mL注射器反复冲洗骨髓腔直至变白。收集细胞悬液后加入红细胞裂解液，离心去除上清。随后用含有巨噬细胞集落刺激因子的完全α-MEM培养基(含体积分数10% FBS)重悬，于培养皿中培养[14]。每隔2 d用PBS去除漂浮的细胞，并在培养皿中全换液添加新鲜完全培养基。取P2代细胞用于后续实验。
1.4.2 CCK-8实验检测骨髓源巨噬细胞活力与毒性培养时观察细胞融合度至 90% 以上时收集细胞，计数后将骨髓源巨噬细胞以1×104/孔的细胞密度接种到96孔板中，每孔添加细胞培养液100 μL，继续培养24 h。弃去原培养基，添加浓度梯度的鼠尾草酸(0，10，15，20，25和30 μmol/L)。培养48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，避光孵育2 h后，使用酶标仪检测在450 nm波长下各组细胞吸光度值。实验得出鼠尾草酸对骨髓源巨噬细胞活力与毒性不产生影响的干预浓度范围。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞分化将骨髓源巨噬细胞以6×103/孔的细胞密度种于96孔板，加入细胞培养液100 μL，在有或没有鼠尾草酸浓度梯度(0，15，20，25和30 μmol/L)干预的含有 50 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/mL RANKL的完全培养基中培养5-7 d。参考文献[14]的方法进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，具有3个或3个以上细胞核的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞被认为是成熟破骨细胞。最后用倒置显微镜拍摄全孔照片，使用Image J软件进行定量分析。
1.4.4 F-actin染色观察破骨细胞骨架形成同1.4.3设置鼠尾草酸不同浓度(0，15和30 μmol/L)分组，培养细胞五六天，弃掉培养基，用PBS轻柔洗涤细胞3次，每孔加入100 μL 40 g/L多聚甲醛于室温下固定细胞20 min。随后弃去多聚甲醛，使用 PBS 清洗3次，加入 0.1% TritonX-100进行细胞破膜30 min，PBS清洗3次，加入罗丹明鬼笔环肽的F-actin荧光探针于室温下孵育2 h，弃去染液后加入抗荧光淬灭DAPI染色液在室温孵育20 min，PBS 清洗3后于倒置荧光显微镜下观察，在每孔视野中随机拍摄，Image J软件用于定量成熟破骨细胞的细胞核数量和面积。
1.4.5 细胞活性氧和线粒体活性氧、膜电位检测同1.4.4设置分组，不同浓度的鼠尾草酸干预培养48 h后弃去培养基加入对应的活性氧检测试剂盒进行孵育，细胞活性氧探针H2DCFDA被氧化并转化为DCF，呈现出强烈的绿色荧光。孵育完成后于倒置荧光显微镜下分别在488和515-540 nm波长下检测DCF和线粒体活性氧荧光强度，以便获得最佳激发和发射波长。
同样分组与干预条件后，使用线粒体Mito-Tracker试剂盒对线粒体膜电位进行检测。观察拍摄成像后，Image J软件将用于荧光强度定量分析。将骨髓源巨噬细胞种板于6孔板中，在相同分组和干预条件下，活性氧探针孵育完毕后收集细胞于流式管中，通过流式细胞技术检测细胞活性氧荧光的强弱。Flow Jo软件用于荧光强度定量分析。
1.4.6 Western Blot检测破骨细胞分化关键蛋白的表达骨髓源巨噬细胞接种在6孔板中，在指定时间(0，15，30，45，60 min和0，1，3，5 d)和30 μmol/L鼠尾草酸浓度条件下干预，从6孔板中提取细胞总蛋白。使用BCA试剂盒对蛋白浓度进行定量归一化处理。然后使用SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，并以恒定300 mA电流将蛋白转移到PVDF膜上。孵育相应的一抗(CTSK、C-fos、MMP9、NFATc1、P38、JNK、ERK、Nrf2、Keap1、HO-1、SOD1和Catalase，稀释比例均采用1∶1 000)二抗(兔源和鼠源二抗，稀释比例为1∶10 000)后，使用超敏ECL化学发光试剂盒和Bio-Rad全能型凝胶成像系统进行显影。以β-actin抗体为内参对目的条带进行结果处理，使用 ImageJ 软件对目的条带灰度值进行量化分析。

1.4.7 RT-PCR 检测破骨细胞分化标志基因的表达同1.4.4设置分组，用TRIZOL法提取骨髓源巨噬细胞的总RNA。用NanoDrop-2000仪器测定RNA样品的浓度和纯度，通过 EVOM-MLV预混试剂盒反转录成cDNA。使用SYBR Green Kit和PCR扩增仪进行扩增，循环条件如下：90 ℃，30 min；95 ℃，8 s；65 ℃，40 min，40个循环，使用β-actin基因作为内参，采用2-ΔΔCt方法分析各基因的表达水平变化，目的基因引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①鼠尾草酸干预骨髓源巨噬细胞无毒性作用的浓度范围；②鼠尾草酸抑制骨髓源巨噬细胞破骨分化情况；③鼠尾草酸处理下的破骨细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果；④鼠尾草酸抑制破骨细胞分化中对MAPK信号通路蛋白表达的影响；⑤鼠尾草酸抑制破骨细胞分化及功能相关标志性基因和蛋白的表达；⑥鼠尾草酸抑制破骨分化中对活性氧产生、抗氧化酶基因和蛋白的表达以及线粒体活性氧和膜电位的影响。
1.6 统计学分析实验至少重复3次，使用 GraphPad Prism 8.0 软件对所有结果进行分析，结果数据以x±s表达。两组间数据比较采用student t-test，多组间数据比较采用单因素方差分析。P < 0.05定义为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症是最常见的骨病之一，其中骨量的维持取决于骨形成和骨吸收之间的平衡，这涉及成骨细胞、破骨细胞以及调节骨机械应力反应的骨细胞[23]。有趣的是，骨质疏松症主要是由于破骨细胞过多造成的，因为破骨细胞吸收的骨量不会随着成骨细胞沉积的新骨而恢复，这将导致绝经后妇女骨质流失等骨质疏松发生[24]。因此，针对破骨细胞的过度形成和功能是治疗骨质疏松症的主要策略。尽管过去几十年来骨质疏松症治疗取得了巨大进步，各种研究已经确定了预防破骨细胞骨吸收的药物治疗方法，例如激素类药物[25]、双膦酸盐和特立帕肽等[3，26]，但已报道了许多不良反应。因此，探索寻找对抗这种疾病的替代天然药物来改善骨质疏松症治疗策略迫在眉睫。
现有研究表明，源自多种膳食成分和药用植物的天然产物基于不同机制调节成骨细胞与破骨细胞之间的平衡，这在预防和治疗骨质疏松症方面显示出巨大潜力，从而揭示了更让人接受的补充和替代治疗方案的出现[5，27]。
鼠尾草酸是一种酚类二萜化合物，首先在鼠尾草中发现，目前广泛用于治疗肥胖、心血管疾病和癌症[28-29]。最近研究发现鼠尾草酸通过抑制小鼠肝脏中基于P2X7R/NLRP3轴的中性粒细胞胞外诱捕网的形成减轻了酒精引起的脂肪堆积，具有保肝作用[30]。但目前关于鼠尾草酸治疗骨质疏松症的报道非常有限，此次研究通过浓度梯度抗酒石酸酸性磷酸酶、F-actin染色发现30 μmol/L鼠尾草酸可以有效减少破骨细胞分化及其细胞骨架F-actin环的形成，还通过减少活性氧的产生和损害线粒体活性发挥，有效抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化。
破骨细胞的分化与成熟离不开成骨细胞分泌的巨噬细胞集落刺激因子和RANKL这两种细胞因子。RANKL通过与其受体RANK结合、募集TRAF6或c-Src来促进破骨细胞生成，从而激活下游信号级联，包括NF-κB、MAPK和AKT信号通路[14，31]。而MAPK家族中的主要成员P38、JNK和ERK1/2在RANKL诱导的破骨细胞生成中发挥至关重要的作用[17]。另外，RANKL-RANK相互作用激活AKT信号通路并通过钙振荡触发细胞质中钙的释放，最终增加NFATc1的表达和核转录，促进下游Atp6vod2、ACP5、CTSK和C-fos基因的表达[27]。此次研究发现，鼠尾草酸可以激活MAPK通路，抑制P38、ERK和JNK的磷酸化水平，从而降低下游破骨相关基因NFATc1、Atp6vod2、ACP5、CTSK和C-fos的表达，抑制骨髓源巨噬细胞诱导的破骨细胞成熟。
氧化应激是许多炎症性疾病中细胞损伤的主要原因，而越来越多的研究表明，活性氧可以增强NF-κB和MAPK通路信号传导，对破骨细胞生成至关重要[11，32]。在氧化应激状态下，Nrf2-Keap1信号通路是细胞防御氧化应激的重要调节机制，Nrf2从Keap1-Nrf2复合物中释放并转移到细胞核，在细胞核中与抗氧化基因启动子区的序列结合激活抗氧化酶的表达，减少活性氧产生并减轻细胞凋亡[32-33]。此次研究的荧光染色和Western Blot结果显示鼠尾草酸可以激活Nrf2-Keap1信号通路，增强抗氧化酶蛋白Catalase、HO-1、SOD1的表达，降低活性氧产生抑制破骨细胞生成。
线粒体作为细胞代谢的重要介质，不仅产生活性氧，而且也是活性氧攻击的主要目标[34]。线粒体功能受损会导致活性氧生成增加，并导致细胞和组织氧化损伤。GAO等[35]报道了线粒体生物发生、超复合物形成和ATP产生增加对于成骨细胞功能至关重要，在成骨细胞分化过程中，线粒体的呼吸、ATP产生和膜电位显著增加。有研究还报道了减弱线粒体呼吸和线粒体生物发生可以抑制破骨细胞线粒体代谢和细胞骨架形成[36]，这提示线粒体在骨稳态中的重要作用。于是进一步检测了鼠尾草酸对线粒体活性氧以及线粒体产能即膜电位的影响，荧光染色结果表明RANKL诱导增加了线粒体活性氧和线粒体能量产生，而鼠尾草酸以浓度依赖的方式减少线粒体活性氧和线粒体膜电位的强度。
综上所述，MAPK信号通路以及RANKL引起的活性氧、线粒体功能在破骨细胞分化中具有重要作用，中药单体鼠尾草酸可以通过激活MAPK信号通路抑制骨髓源巨噬细胞向破骨细胞分化。在此次研究中，仍存在以下几个局限性：①研究中未对鼠尾草酸的作用靶点进行深入探讨，仅对其可能的通路机制进行研究；②仅仅发现鼠尾草酸抑制线粒体活性氧和膜电位的产生，未对线粒体其他表型和形态进行研究；③实验仅停留在以细胞为对象的体外研究，未在骨质疏松症的动物模型体内验证鼠尾草酸的疗效。研究团队将针对以上不足之处深入机制研究，并在动物体内进一步探索鼠尾草酸对骨保护的具体作用机制。此项研究结果表明鼠尾草酸有望作为抑制破骨细胞分化与功能的候选药物开发。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

鼠尾草酸影响线粒体功能抑制破骨细胞分化

Carnosic acid inhibits osteoclast differentiation by inhibiting mitochondrial activity

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