脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对小鼠成骨前体细胞的影响

doi:10.12307/2025.290

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 238-244.doi: 10.12307/2025.290

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脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对小鼠成骨前体细胞的影响

杜忠秋1，戚晓阳2，杨平1，于江林3，陈一心2，张林坚4，邱旭升1，2

1南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008；2南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210008；3江苏大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008；4中国药科大学化学系，江苏省南京市 211198

收稿日期:2024-01-24 接受日期:2024-03-16 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-23
通讯作者: 邱旭升，博士，主任医师，副教授，南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008；南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，江苏省南京市 210008
作者简介:杜忠秋，女，1996年生，山东省枣庄市人，汉族，2020年济宁医学院毕业，主要从事骨质疏松方面的研究。
基金资助:
2021年度南京市卫生科技发展专项(ZKX21029)，项目负责人：邱旭升

Effects of the prolyl hydroxylase 2 inhibitor cpd17 on mouse osteogenic precursor cells

Du Zhongqiu1, Qi Xiaoyang2, Yang Ping1, Yu Jianglin3, Chen Yixin2, Zhang Linjian4, Qiu Xusheng1, 2

1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopaedics, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 3Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Jiangsu University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 4Department of Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu Province, China

Received:2024-01-24 Accepted:2024-03-16 Online:2025-01-18 Published:2024-05-23
Contact: Qiu Xusheng, MD, Chief physician, Associate professor, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; Department of Orthopaedics, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Du Zhongqiu, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
2021 Nanjing Health Science and Technology Development Special Project, No. ZKX21029 (to QXS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
低氧诱导因子：最初被鉴定为一种促进红细胞生成素基因表达的转录因子。研究发现，在低氧条件下，低氧诱导因子介导了大多数低氧诱导基因的表达。因此，低氧诱导因子被誉为低氧适应调节的管家转录因子。同时它也是由低氧诱导因子α和低氧诱导因子β亚基组成的异源二聚体。低氧诱导因子α亚基可以敏感地感知机体细胞氧浓度的变化，它会调整自身在细胞中的浓度，从而影响低氧诱导因子的整体转录活性，进而影响一系列低氧诱导因子下游信号通路相关功能蛋白的表达，使机体适应缺氧环境。
脯氨酰羟化酶2(prolyl hydroxylase domain 2，PHD2)抑制剂：PHD2是参与低氧诱导因子活性调节的主要酶，这一特征也使得PHD2成为研发细胞氧感知通路相关新药的重要靶点。由于PHD2抑制剂可以稳定低氧诱导因子1α并激活低氧信号通路，从而治疗各类疾病，如肾性贫血，因此，科学家们积极开发PHD2抑制剂类新药用于疾病的治疗。

背景：脯氨酰羟化酶2抑制剂能够调节骨代谢，改善卵巢切除大鼠骨质疏松。cpd17是中国药科大学最新研发的一款小分子口服脯氨酰羟化酶2抑制剂，用于治疗肾性贫血疗效肯定，不良反应小，但是对骨形成和骨吸收的作用还不清楚。
目的：探讨脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对成骨前体细胞的影响。
方法：采用cpd17处理C57BL/6小鼠成骨前体细胞，检测碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化程度，检测成骨、破骨相关标志物以及脯氨酰羟化酶2、低氧诱导因子1α的表达水平。使用低氧诱导因子1α通路抑制剂LW6抑制低氧诱导因子1α通路后，再次检测碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化程度，以及成骨和破骨分化相关标志物以及脯氨酰羟化酶2、低氧诱导因子1α的表达水平。
结果与结论：cpd17能显著增强碱性磷酸酶活性和基质矿化程度，上调成骨分化相关标志物的表达，下调破骨分化相关标志物的表达，并上调低氧诱导因子1α表达，下调脯氨酰羟化酶2的表达。而LW6能明显减弱cpd17的作用。结果表明，脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17可通过激活低氧诱导因子1α信号通路促进成骨分化和抑制破骨分化。
https://orcid.org/0009-0001-6546-5429(杜忠秋)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脯氨酰羟化酶2抑制剂, cpd17, 低氧诱导因子, 成骨前体细胞, 成骨分化, 骨质疏松

Abstract: BACKGROUND: Prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) inhibitors can regulate bone metabolism and relieve osteoporosis in ovariectomized rats. cpd17 is a small molecule oral PHD2 inhibitor newly developed by China Pharmaceutical University. It is effective in the treatment of renal anemia with few side effects, but its effect on bone formation and bone resorption is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of cpd17 on mouse osteogenic precursor cells.
METHODS: Osteogenic precursor cells were treated with cpd17. Alkaline phosphatase activity and extracellular matrix mineralization were measured, and the expression levels of osteogenesis- and osteoclastogenesis-related markers, as well as PHD2 and hypoxia-inducible factor 1α, were detected. After inhibition of the hypoxia-inducible factor 1α pathway using LW6 (a hypoxia-inducible factor 1α pathway inhibitor), alkaline phosphatase activity and extracellular matrix mineralization were detected again, as well as the expression levels of osteogenesis- and osteoclastogenesis-related markers, PHD2 and hypoxia-inducible factor 1α.
RESULTS AND CONCLUSION: cpd17 significantly enhanced alkaline phosphatase activity and extracellular matrix mineralization, up-regulated the expression of osteogenesis-related markers, down-regulated the expression of osteoclastogenesis-related markers, up-regulated the expression of hypoxia-inducible factor 1α, down-regulate the expression of PHD2. However, cpd17’s effects were significantly attenuated by LW6. To conclude, the PHD2 inhibitor cpd17 promotes osteogenic differentiation and inhibits osteoclastic differentiation through activation of the hypoxia-inducible factor 1α signaling pathway.

Key words: prolyl hydroxylase domain 2 inhibito, cpd17, hypoxia-inducible factor, osteogenic precursor cell;, osteoblast differentiation, osteoporosis

中图分类号:

杜忠秋, 戚晓阳, 杨平, 于江林, 陈一心, 张林坚, 邱旭升. 脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对小鼠成骨前体细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 238-244.

Du Zhongqiu, Qi Xiaoyang, Yang Ping, Yu Jianglin, Chen Yixin, Zhang Linjian, Qiu Xusheng. Effects of the prolyl hydroxylase 2 inhibitor cpd17 on mouse osteogenic precursor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 238-244.

图/表（结果） 4

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引言

骨质疏松症是多种病因单独或综合引起的一种全身代谢性疾病，以骨量减少、骨组织微观结构退化和骨力学性能下降为特征，伴随着骨脆性和骨折风险的增加[1-3]。治疗骨质疏松的药物有很多，大多数是抑制骨吸收的药物，如双膦酸盐类药物；近年来出现一些促进骨形成的药物，如特立帕肽。
低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是一种对缺氧适应性调节的关键转录因子，它是由 HIF-α和 HIF-β亚基组成的异源二聚体。HIF-α包括 HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α 3种异构体，这种转录因子因在缺氧情况下调节多种基因表达而闻名[4]。在常氧环境中，HIF-1α通过脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase domains，PHDs)蛋白的羟基化作用迅速降解，PHDs需要氧、铁和2-氧代戊二酸作为辅助因子[5]。PHD有3种同工酶(PHD1-3)，其中PHD2在体内广泛表达，并在HIF羟基化的调控中起主导作用，因此 PHD2成为开发细胞氧感知通路相关药物的重要靶点[5]。由于PHD2抑制剂可以稳定HIF-1α并激活HIF-1α通路，从而治疗各类疾病[6-8]，如肾性贫血，因此，科学家们积极开发PHD2抑制剂类新药用于疾病的治疗。传统的PHD2抑制剂如铁螯合剂(如去铁胺)影响铁的代谢[9]，CoCl2有高毒性[10]，二甲基乙二酰氨基乙酸(dimethyloxalylglycine，DMOG)虽是一种很有前途已被广泛研究的抑制剂[11]，但它可能抑制2-羟戊二酸依赖的双加氧酶家族的其他成员，导致严重脱靶效应，因此都无法应用于临床[12]。最近，以罗沙司他为代表的基于PHD2结构设计的PHD2抑制剂已成功上市，用于治疗慢性肾性贫血[13]。在国内，同样是基于PHD2结构设计的口服PHD2抑制剂cpd17，即(5-(3-(4-氯苯氧基)丙-1-炔-1-基)-3-羟基吡啶酰基)甘氨酸(CAS：1842340-93-5)，由中国药科大学研发，目前也已进入治疗肾性贫血的Ⅰ期临床试验[14]。
文献报道，激活HIF-1α通路可调节骨发育过程中的骨形成和血管生成，并促进骨愈合[15]。此外，激活成骨细胞中的HIF-1α信号通路可防止雌激素缺乏诱导的小鼠骨质流失[16]。由此可见，HIF-1α通路不仅参与骨骼发育，还参与骨质疏松症和骨修复[17]。研究表明，PHD2抑制剂类药物去铁胺和DMOG都能缓解卵巢切除大鼠骨质疏松[18-19]。LI等[16]研究表明罗沙司他通过稳定HIF-1α和激活Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞分化，防止雌激缺乏诱导的骨丢失，但是对正常大鼠的骨量没有影响[19]。
最新的研究也证明，注射PHD2抑制剂IOX2，可以刺激低氧信号介导的软骨内成骨与血管形成[20]。在动物实验中，cpd17相较于罗沙司他对于贫血的治疗，血红蛋白的恢复更接近生理水平，同时，与罗沙司他相比，cpd17的活性更好，剂量更小，不良反应更小[14]。鉴于cpd17在治疗肾性贫血中的出色表现，该研究希望探讨cpd17对骨代谢的影响，了解其是否能够成为治疗骨质疏松的潜在药物。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞实验随机分为对照组，cpd17组和cpd17+ LW6组。从C57BL/6乳鼠的颅骨分离原代成骨前体细胞[16，21]，采用cpd17及cpd17+LW6进行干预，在 37 ℃、体积分数5% CO2 的湿润培养箱中培养。CCK-8法检测细胞增殖活性，碱性磷酸酶染色和茜素红S染色观察成骨分化情况，Western blot和qPCR检测Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ，Col1)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、PHD2、HIF-1α的蛋白及mRNA表达水平，实验重复3次。
1.2 时间及地点实验于2022年5月至2023年8月在南京医科大学附属南京医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物出生48 h的C57BL/6小鼠6只，雌雄不限，购买于北京斯贝福生物技术有限公司，水和食物供应充足，在温度25 ℃、湿度50%的环境下饲养。
实验方案经南京医科大学附属南京医院动物伦理委员会批准(审批号：DWSY-22069195)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物最大程度的减少痛苦后处死。
1.3.2 实验试剂和仪器 cpd17(中国药科大学研发)[14]；LW6(一种HIF-1α抑制剂，CAS：934593-90-5)；胰蛋白酶(Gibco，美国)；Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；1%青霉素-链霉素(Gibco，美国)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；β-甘油磷酸酯(Sigma- Aldrich，美国)；0.1 mmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich，美国)；50 µg/mL抗坏血酸(美国Sigma-Aldrich)；CCK-8试剂盒(碧云天，中国上海)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天，中国)；茜素红染色试剂盒(碧云天，中国)；RNA-Quick Purification Kit试剂盒(百优泰，中国)；SYBR Green QPCR试剂盒(雅酶，中国)；RIPA 裂解缓冲液(塞维尔，中国)；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(碧云天，中国)；一抗：Runx2(1∶1 000，Cell Signaling，12556S)；OPN(1∶1 000，Proteintech，22952-1-AP)；Col1(1∶1 000，Proteintech，14695-1-AP)；RANKL(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology，sc-37709)；OPG(1∶1 000，Abcam，ab73400)；PHD2 (1∶1 000，Abcam，ab226890)；HIF-1α (1∶1 000，Abcam，EPR16897)；β-actin (1∶1 000，Servicebio，GB15003)；二抗(1∶5 000，Biosharp)；ChemiDocXRS+ 成像系统(Tanon，中国上海)；LightCycler 480 PCR 系统(罗氏，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 原代成骨前体细胞培养将出生48 h内的C57BL/6小鼠麻醉处死后浸泡在乙醇中15 min，然后在无菌条件下从乳鼠的颅骨中分离提取成骨前体细胞，遵循先前报道过的提取方法[21]。无菌条件下将颅骨切成几个小片，用胰蛋白酶消化15 min，弃上清，剩余骨组织继续用0.1%胶原酶Ⅱ在37 ℃下消化30 min。收集上清液，原代成骨细胞在含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基中培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱，两三天换液1次，显微镜下细胞长至90%-100%融合后，以1∶3传代，第1-5代细胞用于实验。
1.4.2 细胞活力检测第2代成骨前体细胞以每孔约5 000个接种于96孔板，当细胞长到60%-70%融合时加入不同浓度cpd17(0，1，5，10，20，40，80，100 μmol/L)干预24 h，每孔加入10%的CCK-8溶液，放入37 ℃温箱孵育45 min-1 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
在获得cpd17的最佳浓度后，再次用最佳浓度的cpd17和不同浓度(0，1，5，10，20，40，80，100 μmol/L)的 LW6( HIF-1α抑制剂)进行CCK-8实验[22]，同时加入cpd17和LW6，干预24 h，如上述步骤，确定LW6的最佳浓度。
1.4.3 成骨分化实验将第2代成骨前体细胞以每孔5×105个接种于12孔板，随机分为3组：对照组、cpd17组(5 μmol/L cpd17)和cpd17+LW6组(5 μmol/L cpd17 +10 μmol/L LW6)，每组铺板3个孔，重复实验3次。细胞长至70%左右融合时进行成骨诱导分化。成骨诱导液配方如下：含体积分数为10%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸酯、0.1 mmol/L地塞米松和50 µg/mL抗坏血酸的α-MEM培养基。cpd17组和cpd17+LW6组在成骨诱导培养基中加入5 μmol/L cpd17，5 μmol/L cpd17 +10 μmol/L LW6进行干预，对照组单纯用成骨诱导培养基来诱导成骨细胞分化，每两三天更换1次培养基。
1.4.4 碱性磷酸酶染色和茜素红S染色成骨诱导7 d后，按照碱性磷酸酶染色试剂盒的说明用PBS冲洗细胞两三次，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，再用PBS冲洗3次，然后室温条件下用碱性磷酸酶染色试剂染色30 min，显微镜下观察，采用Image-Pro Plus软件计算染色强度。
成骨诱导14 d后，按照茜素红染色试剂盒的说明用PBS冲洗细胞两三次，然后用40 g/L多聚甲醛固定20 min，再次用PBS冲洗3次，室温下用茜素红染色试剂染色30 min，最后用蒸馏水冲洗 3 次以消除非特异性染色，显微镜下观察。为了量化茜素红染色细胞基质钙化程度，使用10%十六烷基吡啶洗脱矿化结节[23]，浸泡洗脱40 min，最后检测洗脱溶液在570 nm的吸光度值。
1.4.5 RNA提取和qPCR 成骨诱导7，14 d，使用 RNA-Quick Purification Kit试剂盒从细胞中提取RNA，使用PrimeScript RT kit进行反转录，使用SYBR Green QPCR试剂盒和LightCycler 480 PCR系统进行qPCR检测。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法将目标基因的mRNA表达水平与β-actin进行归一化计算[24]。

1.4.6 Western 印迹分析成骨诱导7，14 d，提取细胞蛋白并进行定量，然后按照所述方法进行Western blot实验。简单地说，将每个样品中等量的蛋白质在10%SDS-PAGE 凝胶上进行分离，然后转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂牛奶阻断膜1 h，然后用下列抗体孵育：Runx2、OPN、Col1、RANKL、OPG、PHD2、HIF-1α、

β-actin (稀释比例均为1∶1 000)在 4 ℃冰箱过夜，然后用适当的二抗(1∶5 000)在常温摇床上孵育1 h，使用
ChemiDocXRS+成像系统观察蛋白条带，使用Image J soft (1.8.0 版)对条带强度进行量化。
1.5 主要观察指标评估cpd17对成骨细胞碱性磷酸酶染色强度和细胞外基质矿化程度，成骨相关标志物Runx2、OPN、Col1，破骨相关标志物RANKL、OPG以及低氧信号通路相关HIF-1α、PHD2 mRNA与蛋白表达的影响。同时，进一步使用HIF-1α通路抑制剂LW6干预，检测LW6对上述指标的影响。
1.6 统计学分析实验数据以x±s表示，均基于3个独立重复的结果。统计分析使用SPSS 26.0软件(SPSS，IBM，美国)。采用两个独立样本、双尾t检验来比较2组之间的差异。采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD事后检验来比较3组之间的差异。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经通过南京中医药大学鼓楼临床学院统计专家审核。

讨论

该研究表明，cpd17在诱导成骨前体细胞分化的过程中，通过激活HIF-1α通路明显促进成骨分化和抑制破骨分化。细胞染色结果显示，cpd17诱导分化成骨细胞7，14 d后，能增加碱性磷酸酶活性和细胞基质钙化程度。Western blot实验结果和qPCR实验结果显示，cpd17能增加成骨分化相关标志物Runx2、OPN、Col1蛋白和mRNA的表达，cpd17能减弱破骨分化相关标志物RANKL/OPG的表达。同时，LW6通路抑制剂可以明显减弱cpd17的作用。
以往的研究表明，PHD2抑制剂可影响骨代谢。JAHANGIR等[25]研究发现，DMOG可促进大鼠颅骨的血管生成和骨生成，治疗骨缺损。LIU等[18]研究发现，去铁胺能激活成骨细胞中的HIF-1α/VEGF通路，通过促进成骨和血管生成来治疗绝经后骨质疏松症患者。LI等[16]研究表明，罗沙司他对卵巢切除雌激素缺乏大鼠的成骨细胞分化有积极影响，并能防止骨质流失。在体内，CHEN等[26]发现罗沙司他对骨折修复有促进作用，它能增加骨髓间充质干细胞的数量并诱导软骨内成骨。在体外，罗沙司他通过上调细胞内Ca2+、一氧化氮同时伴随活性氧减少，显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。此外，一项研究表明，当单独培养CD14+单核细胞时，罗沙司他可抑制破骨细胞分化；当单核细胞与成骨细胞共培养时，该抑制剂对破骨细胞的抑制作用进一步增强[27]。该研究证明cpd17在细胞实验中能促进成骨分化，同时抑制破骨分化。
目前有许多药物可用于治疗骨质疏松症[28]。最常见的一类药物是抑制骨吸收的药物，如双膦酸盐类，其疗效和安全性都经过临床验证；近年来，促进骨形成的药物，如硬骨化蛋白抑制剂(如特立帕肽)应用逐渐增多，理论上比抗骨质吸收药物效果更好。尽管这些药物都很有效，但其潜在的不良反应和效力下降可能会限制单一药物的长期使用。目前临床上广泛应用的药物中，既能促进骨形成又能抑制骨吸收的药物很少。该研究表明，cpd17 在体外实验中既能促进成骨分化同时又能抑制破骨分化，因此PHD2抑制剂(如cpd17)有可能成为治疗骨质疏松症的非常有效的潜在药物。
PHD2抑制剂在治疗肾性贫血领域研究广泛[29]。去铁胺和氯化钴是两种具有代表性的PHD2抑制剂，鉴于去铁胺会影响铁代谢[9]，而氯化钴对人体有剧毒，因此它们并未应用于临床；DMOG是一种很有前景的HIF稳定剂[11]，但它导致脱靶作用。罗沙司他也能稳定HIF，但罗沙司他的半衰期较短[30]。cpd17是一种新型的HIF稳定剂，也可用于肾性贫血的治疗，与罗沙司他相比，它具有用量少、不良反应小等优点。在顺铂诱导的小鼠模型中，与罗沙司他相比，cpd17的血红蛋白恢复更接近正常生理水平[14]；临床试验对cpd17治疗贫血患者的效果和安全性进行了评估，结果表明cpd17在临床应用中具有良好的安全性和耐受性[14]。因此，PHD2抑制剂cpd17是一种既安全又有效的治疗肾性贫血的新药。该研究结果表明它还是一种潜在的治疗骨质疏松的药物。
该研究的主要不足之处是缺乏相应动物实验，因此，未来有必要进一步完善动物实验以验证cpd17对于动物骨质疏松的作用，为cpd17用于临床骨质疏松用药奠定基础。由于低氧信号通路对全身各个组织器官的广泛作用，PHD2抑制剂用于治疗骨骼疾病之前，还需要进行广泛实验研究以证明其有效性及安全性。

结论：该研究证明PHD2抑制剂cpd17在细胞实验中可通过激活HIF-1α信号通路促进成骨分化和抑制破骨分化，是治疗骨质疏松症的一种潜在药物。鉴于体内体外实验可能存在的差异，PHD2抑制剂cpd17是否可以用于治疗骨质疏松症仍需动物实验进一步验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脯氨酰羟化酶2抑制剂cpd17对小鼠成骨前体细胞的影响

Effects of the prolyl hydroxylase 2 inhibitor cpd17 on mouse osteogenic precursor cells

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