一种可注射生物活性磷酸钙骨修复材料的制备及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 821-828.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.001

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一种可注射生物活性磷酸钙骨修复材料的制备及表征

刘健休¹，沈莹²，储彬²，曾飞¹，黄世嘉¹，李松建¹

¹南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510280；²深圳清华大学研究院，广东省深圳市 518057

收稿日期:2017-01-10 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 李松建，博士，主任医师，南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510280
作者简介:刘健休，男，1988年生，河南省信阳市息县人，南方医科大学毕业，硕士，医师，主要从事生物活性骨修复材料的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(51303094)，课题名称：三维打印PLA/HA/脉冲缓释微球支架材料的制备及其对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

Preparation and characterization of an injectable bioactive calcium phosphate material for bone repair

Liu Jian-xiu¹, Shen Ying², Chu Bin², Zeng Fei¹, Huang Shi-jia¹, Li Song-jian¹

¹Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; ²Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China

Received:2017-01-10 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Li Song-jian, M.D., Chief physician, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
About author:Liu Jian-xiu, Master, Physician, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51303094

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
磷酸四钙：是磷酸钙系列骨水泥最重要的组成原料之一，作为惟一钙磷比高于羟基磷灰石且碱性仅次于氧化钙、氢氧化钙的磷酸盐，其能够与其他低钙磷比的磷酸盐形成理想的磷酸钙骨水泥，但目前国内尚未有其产品销售，资料显示，碳酸钙和磷酸氢钙或二水磷酸氢钙是最常见的合成磷酸四钙的方法。
固化液：骨水泥一般包括固相的粉体和液相的固化液，常见的固化液有氯化钠溶液、磷酸氢铵水溶液、磷酸氢钠溶液、柠檬酸溶液及一些高分子水溶液。根据不同的要求，选择合适固化液对骨水泥的综合性能影响非常明显，实验需选择磷酸氢铵水溶液、磷酸氢钠溶液及柠檬酸溶液或其混合溶液作为固化液，探索其对骨水泥凝固时间、溶血率、环境pH、放热性、崩解性、细胞生物相容性等的影响。

背景：针对当前自体骨和异体骨移植治疗骨缺损存在的种种问题，急需研制生物活性可降解人工骨修复材料，特别是磷酸钙骨修复材料，目前依然是国内外研究的热点之一。
目的：旨在开发一种磷酸四钙基可注射生物活性磷酸钙骨修复材料。
方法：通过磷酸四钙基磷酸钙骨水泥原粉和无水磷酸氢钙以及不同组分固化液在室温下(25 ℃左右)混合制成可注射活性骨水泥，并通过X射线衍射，水泥硬度测定，在模拟体液中崩解以及溶血实验和细胞毒性实验等方法进行研究，探索其固体成分构成、液相构成、煅烧及干燥温度等条件对其物理性能、生物学性能的影响，从而筛选出一种或多种综合性能优异的骨修复材料。
结果与结论：①煅烧温度低于1 300 ℃时，磷酸四钙产量很少，只有当温度接近1 400 ℃时，可以得到比较纯净的磷酸四钙；②极冷条件因避免了空气中水分的影响，得到大量纯净的磷酸四钙，而慢冷后的产物主要为羟基磷灰石，这说明极冷对于获得纯净的磷酸四钙至关重要；③随着液相中柠檬酸溶液比例的提高，骨水泥浸泡液中的pH值和溶血率逐渐增大，这说明柠檬酸溶液很容易导致溶血；④通过体外细胞实验证实，在液相选择上，NH4/Na比为2∶1的磷酸氢铵和磷酸氢钠溶液构成的骨水泥溶血率最低，细胞生物相容性最好，最有利于细胞生长；⑤1 400 ℃煅烧后过筛得到的粉体组成的骨水泥初凝时间最短，pH值影响最小，崩解性不高，溶血率最低，对细胞的抑制作用更小，这说明经过1 400 ℃煅烧，过筛粉体得到的骨水泥更加适合临床应用。

ORCID: 0000-0001-8897-6080(刘健休)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 生物活性, 可注射, 磷酸钙骨水泥, 磷酸四钙, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In view of the unavoidable problems of autogenous and allogenous bone grafts, it is an urgent need to develop biodegradable bone substitute materials, among which is calcium phosphate material that has become a hot spot in the domestic and foreign research.
OBJECTIVE: To develop a biodegradable calcium phosphate material for bone repair based on tetracalcium phosphate (TTCP).
METHODS: The biodegradable calcium phosphate cement made from TTCP, dicalcium phosphate anhydrous and different constituents of curing liquids was prepared under room temperature (about 25 ℃). The effects of solid components, liquid components as well as calcinations and drying temperature on the physical and biological performances were detected through X-ray diffraction test, hardness test, decay in a simulated body fluid, hemolysis and cytotoxicity tests, respectively, to select the bone repair material with excellent performances.
RESULTS AND CONCLUSION: When the calcination temperature was lower than 1 300 ℃, TTCP was rarely available; only close to 1 400 ℃, the relatively pure TTCP was gained. A large number of pure TTCP were gained by rapid cooling because of avoidance of the moisture impact, but slow cooling made the main products to be hydroxyapatite, suggesting that rapid cooling is essential to obtain pure TTCP. With the increase of the proportion of citric acid solution in the liquid phase, the pH values and the hemolysis rate in the bone cement soak solution were increased gradually, illustrating that citric acid solution is easy to induce hemolysis. In vitro cell experiments showed that the hemolysis rate of bone cement with a solution of 2:1 NH4/Na ratio was the lowest, and the biocompatibility was the best, which was the most favorable to cell growth. Cements was made of calcined powders sieved at 1 400 ℃ and showed the shortest initial setting time, least effect on pH values, lowest disintegration rate and hemolysis rate, and slightest inhibition effect on the cell proliferation, indicating that the bone cements made of sieved powder after 1 400 ℃ calcination is more suitable for clinical application.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Materials Testing, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘健休，沈莹，储彬，曾飞，黄世嘉，李松建. 一种可注射生物活性磷酸钙骨修复材料的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 821-828.

Liu Jian-xiu, Shen Ying, Chu Bin, Zeng Fei, Huang Shi-jia, Li Song-jian. Preparation and characterization of an injectable bioactive calcium phosphate material for bone repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 821-828.

图/表（结果） 14

2.1 磷酸四钙基磷酸钙骨水泥原粉制备的影响因素磷酸钙骨水泥主要通过骨水泥固相和水溶液发生水化反应而自然凝固^[10]，因此，骨水泥原粉的合成是磷酸钙骨水泥制备的关键。骨水泥原粉通常采用CaHPO₄与CaCO₃在高温下进行固相反应获得，控制反应条件(温度、原料配比等)可得到不同的产物，为磷酸四钙、α-磷酸三钙和羟基磷灰石，以及其中两者或三者的混合物。骨水泥原粉的必要组分是磷酸四钙，依靠它的水溶性才使水泥具有黏结性，同时它还直接影响到水泥的强度、酸碱性和生物相容性等一系列性质。这里粗略讨论了反应温度、冷却方式，原料的理化性质对磷酸四钙基磷酸钙骨水泥原粉制备的影响。

2.1.1 反应温度的影响将图1和标准XRD图谱数据(表2)对比，可以看出，1 150 ℃煅烧得到的产物为羟基磷灰石+ α-Ca₃(PO₄)₂(2θ=27.905，29.072，34.211，34.492)+β-Ca₃(PO₄)₂(2θ=33.049，37.489，46.816)，其中α、β-磷酸钙含量较少，羟基磷灰石的含量较多；在1 300 ℃锻烧得到的产物主要为纯度和结晶度均较高的羟基磷灰石；而在 1 400 ℃锻烧得到的产物为磷酸四钙，还含有少量的羟基磷灰石。在所有的谱图中均不含有CaO，说明固相反应比较充分，反应物无过量。

根据文献，以CaHPO₄•2H₂O和CaCO₃为原料通过固相反应制备磷酸四钙的反应，存在如下物质转变过程^[8]：

由上述反应式可以解释不同温度所获得的产物的差异。当反应在1 150 ℃下进行时，Ca₂P₂O₇与CaO反应生成β-磷酸钙与羟基磷灰石，由于未达到α-磷酸钙的转化温度，故产物中同时含有α-磷酸钙与β-磷酸钙，而反应温度均未达到羟基磷灰石分解或磷酸钙与CaO发生固相反应生成磷酸四钙的温度，故产物中未出现磷酸四钙；在1 300 ℃下，反应物Ca₂P₂O₇与CaO反应得到纯度很高的羟基磷灰石，但由于反应温度未达到羟基磷灰石分解温度(1 350 ℃)，故产物中不含有磷酸四钙；在1 400 ℃时，反应温度超过羟基磷灰石分解温度，羟基磷灰石分解为磷酸四钙，故反应产物中主要含磷酸四钙。由于羟基磷灰石高温下的结晶度比磷酸四钙高，尽管图谱中羟基磷灰石特征峰衍射强度较高，但实际含量并不高。由此可见，只有当反应温度大于1 400 ℃才有可能出现大量的磷酸四钙，因此，从磷酸四钙含量和能耗两方面考虑，1 400 ℃是制备磷酸四钙基骨水泥原粉的最佳温度。

2.1.2 冷却方式的影响图2是相同锻烧条件、不同冷却方式获得产物的XRD图谱。由图可见采用慢冷方式，反应产物主要为羟基磷灰石，伴随少量的磷酸四钙，这主要由于磷酸四钙在逐渐冷却的过程中会大量吸收空气中的水蒸气，并与之发生水化反应，转变为羟基磷灰石；而使用急冷方式，反应产物主要为磷酸四钙，说明急冷方式比慢冷方式更有利于获得磷酸四钙基的骨水泥原粉。

2.1.3 原料理化性质的影响粉料的研磨和过筛是骨水泥研制中极其重要的一环，因为粉料颗粒大小直接影响到骨水泥的性能，实验首先采用球磨机研磨，但发现在研磨的过程中二水磷酸氢钙易析出结晶水，导致粉料黏附在球磨罐壁以及球磨球上，而且球磨后粉料的颗粒依然很大，以致在过筛过程中造成了困难，所以放弃使用球磨机而改用手磨。

将二水磷酸氢钙和无水磷酸氢钙分别与CaCO₃高温反应(图3)，发现1 300 ℃时以无水磷酸氢钙为原料，主要产物为磷酸钙+羟基磷灰石，而以二水磷酸氢钙为原料则得到几乎100%的羟基磷灰石。由于磷酸四钙主要由羟基磷灰石分解而来，因此羟基磷灰石纯度越高，磷酸四钙含量越高；由此可以看出，以二水磷酸氢钙为原料比无水磷酸氢钙要好，有可能获得更高含量的磷酸四钙。

实验还比较了以不同干燥温度的二水磷酸氢钙为原料对反应产物的影响(图4)。由图可见，采用80 ℃下干燥的二水磷酸氢钙使产物中羟基磷灰石含量增多，磷酸四钙含量减少，这可能是由于二水磷酸氢钙失去了部分结晶水，使中间产物纯度降低所致；而采用50 ℃下干燥的二水磷酸氢钙，产物中磷酸四钙含量相当高，因此二水磷酸氢钙干燥的适宜温度是低于50 ℃。

2.2 骨水泥制备的影响因素及条件优化

2.2.1 固相和液相组分的选择经X射线衍射测定表明，在固化前的固体相由Ca₄(PO₄)₂O和CaH(PO₄)等组成。经过液相调和后，其组分基本转化成羟基磷灰石的结构，而羟基磷灰石则是人体骨组织的主要成分，它占人体骨组织的70%左右，因此，从化学结构上决定了磷灰石骨水泥的人体骨相似性，也决定了磷灰石骨水泥与人体骨组织具有很好的生物相容性。

磷酸钙骨水泥形成的原因是由于不同磷酸钙盐溶解度不同所致。实验比较了采用不同温度煅烧得到的磷酸钙骨水泥原粉制备出的磷酸钙骨水泥的各种理化性质(表3)，发现＃3粉制备的D1号磷酸钙骨水泥初凝时间最短，体液中pH值变化最小，崩解性不高，溶血率最低(低于5%)，其原因与磷酸四钙含量增加，水化产物中纳米羟基磷灰石含量相应增多以及羟基磷灰石晶体结构与人体骨近似(图5)有关。

固化液能影响到水泥固化的初凝时间、崩解程度、硬度、强度、水化热以及其pH值等性质参数。实验比较了不同液相组分制备的磷酸钙骨水泥的理化性质(表4)，发现采用(NH₄)₂HPO₄为液相组分的H2号水泥初凝时间、体液中pH值和崩解性均为其中较佳者。整个系列的磷酸钙骨水泥理化性能不佳是由于固相组分采用了1 150 ℃锻烧产生的磷酸钙骨水泥原粉。

2.2.2 NH₄-Na液相体系制备骨水泥条件优化考虑到采用纯(NH₄)₂HPO₄为液相组分，水化过程中会释放氨气，使体液在较长时间内偏碱性，因此采用Na₂HPO₄调节水化产物的酸碱性。另外，由于骨水泥的抗压强度与羟基磷灰石的转化生成密切相关, 而Na⁺盐比NH₄⁺盐更易水解，Na⁺的替代行为会引起晶格的畸变，促进羟基磷灰石的转化和生

成，因此采用Na⁺盐作为添加剂制成骨水泥可提高最大抗压强度。由表5看出，此系列各项理化指标均无太大差异。Na⁺盐的加入使初凝时间增加。溶血率值基本在正常范围内。当铵、钠盐共存时，在(NH₄)₂HPO₄/Na₂HPO₄为1︰2时，溶血率值相对最低。可以看出，这种配比(J4)得出的磷酸钙骨水泥血液相容性最好。

2.2.3 NH₄-柠檬酸液相体系制备骨水泥条件优化经研究表明，磷酸钙骨水泥的强度与所采用的固化液组分具有很大的相关性，骨水泥的抗压强度因液相的不同有很大的差别，如果固化液采用的是水、稀酸或者是氢钠等，其抗压强度多较低，且初凝时间较慢，而采用柠檬酸等溶液进行混合时，抗压强度将有一定的提高，初凝时间也相应提高，但由于柠檬酸的加入会使固化反应放出大量热，于是采用了NH₄-柠檬酸液相体系作为固化液。由表6可以看出，随着柠檬酸含量的增加，NH₄-柠檬酸液相体系制备的骨水泥体液中的pH值和溶血率逐渐增大，只有K1号水泥溶血率达到5%以内。

2.3 纯NH₄体系、NH₄-Na体系、NH₄-柠檬酸体系磷酸钙骨水泥的比较

2.3.1 三种磷酸钙骨水泥的理化性质比较选择1 400 ℃煅烧产生的磷酸钙骨水泥原粉为固相组分，纯NH₄、NH₄/Na比为1︰2的NH₄-Na体系、NH₄/柠檬酸比为12︰1的NH₄-柠檬酸体系为固化液制备磷酸钙骨水泥，各种理化性质列于表7。由表7看出，3种水泥的崩解性比较接近，都低于采用1 150 ℃或1 300 ℃煅烧产生的磷酸钙骨水泥原粉制备的水泥，可能是由于水化产物并没有完全转化为羟基磷灰石的缘故。

从图6看出，每种水泥均有宽化的羟基磷灰石特征衍射峰，意味着水泥体相是由部分纳米羟基磷灰石组成的，但还存在相当程度的其他磷酸钙盐大晶粒，因此导致水泥强度下降。

从图7的电镜照片中也可看出，没有添加Na或柠檬酸的体系(图7A，B)水泥体相中存在较大缝隙，而添加了Na或柠檬酸的体系(图7C，D)水泥颗粒间结合紧密，无大孔洞(> 5 μm)存在，这与水泥的崩解情况和实际强度情况相符；而采用1 300 ℃煅烧产生的磷酸钙骨水泥原粉制备的水泥G2，J3和K1，其孔洞尺寸和孔隙率均小于1 400 ℃煅烧产生的磷酸钙骨水泥原粉制备的水泥D1，主要原因可能也与大颗粒的磷酸钙盐的存在有关。

由表7还可以看出，3种水泥的溶血率也都比较接近，其中纯NH₄体系的水泥溶血率达到5%以下。由于溶血率与固相组分和液相组分的性质密切相关，并且实验值本身误差也很大，还需要做细胞实验以准确判断水泥的生物相容性。

2.3.2 三种磷酸钙骨水泥细胞相容性与细胞毒性比较由图8可以看出，在液相选择上，NH₄/Na比为1︰2的NH₄-Na体系的磷酸钙骨水泥细胞相容性最好(图8B1，B2，C1，C2，D1和D2)。将组成不同的磷酸钙骨水泥原粉制成的骨水泥编为1号系列和2号系列，并进行对比，可以得出2号系列比1号系列骨水泥生物相容性更好，更适合做人工骨修复材料(图8B1，C1，D1，B2，C2，D2)。对于E和B1而言，两个样品的磷酸钙骨水泥原粉煅烧温度不同，但主要成分为羟基磷灰石，B1中含少量磷酸三钙。在细胞毒性测试中，E出现崩解，这可能与水泥中仅含大颗粒羟基磷灰石有关。常温常压下E体相中仍含有少量水分，液相组分可以缓慢水解以维持其强度，但高压下水分丧失，导致水泥完全崩解。另外将C2和F进行对比发现，在其他制备条件相同的情况下，原粉经过过筛比没经过过筛的细胞相容性好(图8C2，F)。

参考文献

引言

骨修复材料广泛应用于骨外科、整形外科以及牙科领域。按来源分类有3种，即自体骨、异体骨和人工合成材料^[1]，虽然自体骨是理想的骨修复材料，但供骨来源有限且二次手术给患者带来痛苦，供骨区可能出现形态和功能障碍；异体骨存在免疫排斥反应，有导致传染疾病和肿瘤生成的可能，因此长期以来各国科学家们在不断探索理想的骨缺损修复材料^[2-4]。曾经试验使用的生物陶瓷材料、有机可降解聚合物以及各种复合材料如胶原复合羟基磷灰石、骨形成蛋白复合人工骨等均有很多优点^[5-6]，但同时也存在种种问题，如降解产物引发炎症，材料的惰性导致缺损面难以固定等。

20世纪80年代中期，Dr. E. Brown及Dr. Lawrence. Chow 发现了磷酸钙盐的水硬特性，然后以磷酸四钙(TTCP)和磷酸氢钙合成了具有自固化特性和骨传导性的磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)，拉开了磷酸钙骨水泥研究的序幕^[7]。这种物质植入人体内能与周围组织良好共存且伴有选择性吸收，无明显排斥反应出现，具有良好的成骨活性、降解活性以及固化过程的等温性，尤其是它能任意塑型的特性，使磷酸钙骨水泥克服了其他材料的缺陷，成为新一代人体硬组织修复材料^[1-4]。当前磷酸钙骨水泥仍然是生物材料主要研究领域之一。然而，不同的骨水泥粉体、不同的固化液成分、不同的实验条件均可能影响骨水泥一系列性能^[2]，为了确保骨水泥性能的稳定，有必要探索影响骨水泥性能的主要因素。实验将不同条件合成的磷酸四钙基磷酸钙骨水泥原粉和无水磷酸氢钙以及多种固化液在室温下(25 ℃左右)混合制成可注射活性骨水泥，并采用X射线衍射分析晶体结构，从而探究煅烧温度对骨水泥合成的影响，在模拟体液中崩解、溶血实验和细胞毒性实验等方法研究不同固化剂对骨水泥部分物理性能和生物学性能的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料学研究。

1.2 时间及地点于2015年1月至2016年7月在南方医科大学实验室和深圳清华大学研究院实验室完成。

1.3 材料 CaHPO₄•2H₂O(分析纯，上海市四赫维化工有限公司)；CaCO₃(分析纯，汕头市光华化学厂)；C₆H₈O₇(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；Na₂HPO₄(分析纯，广州化学试剂厂)；(NH₄)₂HPO₄ (分析纯，广东台山化工厂)；模拟体液(自制)；生理盐水(南洋普康集团衡淯制药有限责任公司)；人血(ACD全血)(南方医科大学珠江医院提供)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)。

硅钼棒炉(1 600 ℃)(上海金炉电热仪器联营厂)；快速升温箱式电炉(1 600 ℃)(洛阳涧耐火材料试验厂)；722 S分光光度计(上海光学仪器厂)；XD-2型X射线衍射仪、维卡稠度仪(深圳清华大学研究院)；生物安全柜(上海HEAL FORCE)；立式灭菌器 LMQ.R-4060(山东新华医疗器械股份有限公司)；倒置相差显微镜TS-100、数码相机 CoolPIX4500(Nikon)；扫描电镜JSM-T300(JEOL)；台式离心机TDL-40B (上海安亭科学仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 磷酸钙骨水泥原粉的制备将二水磷酸氢钙放入烘箱内，于50 ℃以下进行烘干，密封保存，备用。将一定量的二水磷酸氢钙和CaCO₃(摩尔比1∶1)充分混合并研磨，过400目筛，于高温下锻烧，得到磷酸钙骨水泥原粉^[8]，密封保存。

1.4.2 磷酸钙骨水泥固相的调配将二水磷酸氢钙置于120 ℃烘箱里烘2.0-3.0 h至二水磷酸氢钙脱去结晶水，得到无水磷酸氢钙。将磷酸钙骨水泥原粉与无水磷酸氢钙按一定比例混合均匀，研磨，过400目筛，所得粉末即为磷酸钙骨水泥固相粉体。

1.4.3 骨水泥的调和取适量磷酸钙骨水泥固相粉体按适量的固液比加入预先配制好的固化液，调和成膏状物放入预先准备的纸盒模具(0.5 cm×1 cm×1 cm)中，一段时间后，膏浆逐渐失去黏性，变成具有一定强度的硬化物。

1.4.4 合成粉末与水化产物物相分析将待测粉体用玛瑙研钵研磨后放入金属模具中压片做X射线衍射，测试条件为：Cu靶K_α(λ=0.193 nm)，管压40 kV，管流20 mA，扫描范围2θ＝10°-70°，扫描速率：8(°)/min。

1.4.5 初凝时间测定在环境温度为(23±1) ℃时，调和固液组分成膏状在60 s内填入直径6 mm、高12 mm的玻璃管状模具中(尽量填实)，一头抹平，采用维卡稠度仪测量凝结时间^[9]。

初凝时间：自填入模具起，每隔30 s将试针垂直降落到调和物表面，停留5 s，当试针沉入样品为8 mm时，所需时间即为初凝时间。

终凝时间：自填入模具起，每隔30 s将试针垂直降落到调和物表面，停留5 s，当试针沉入样品不超过1 mm时，所需时间为终凝时间。

1.4.6 崩解实验将水泥块放入模拟体液中，置于37 ℃的恒温水浴中，每隔12 h换一次体液，观察水泥块的崩解状况，并用pH试纸测定其pH值。

1.4.7 溶血实验将硅油(3 mL的硅油配97 mL的石油醚稀释)涂在试管、烧杯、移液管、玻棒、滴管等溶血过程中直接与血接触的物品，然后放入马弗炉中260-270 ℃烧2 h。

将磷酸钙骨水泥放入涂有硅油的试管中，加入10 mL生理盐水，其中取2支试管作为阴性、阳性对照组，前者试管仅盛有生理盐水10 mL，后者盛有蒸馏水10 mL。将所有试管放入37 ℃恒温水浴中60 min，然后取出，再加入 0.2 mL的抗凝血(新鲜抗凝血的制备：B型全血4 mL，用2%草酸钾抗凝后，加入5 mL生理盐水稀释，制得新鲜抗凝血9 mL)，缓慢混合轻轻振荡后再放置37 ℃恒温水浴维持 60 min。取出试管，放入离心机以1 100 r/min离心所有试管7 min，取上清液，用722型分光光度计在波长540 nm处比色测量吸光度^[7]，取平均值，按照下面公式计算溶血率：

1.4.8 磷酸钙骨水泥材料与动物细胞的相容性和毒性实验 ①所有磷酸钙骨水泥材料首先分组并经高温灭菌处理，分组状况见表1；②将磷酸钙骨水泥放置于细胞培养瓶内，加少许小牛血清将其固定在瓶壁内；③配置细胞培养液：DMEM、体积分数为10%胎牛血清、1%双抗；④接种C2C12细胞于96孔板，细胞数1×10⁶；⑤置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养；⑥培养48 h后，在生物倒置显微镜下观察细胞生长情况。

1.4.9 扫描电镜测试将实验样品置于粘有双面导电胶的铜台上，然后喷金2次，取出置于扫描电镜中观察、拍照。

1.5 主要观察指标 ①磷酸四钙基磷酸钙骨水泥原粉制备的影响因素；②骨水泥制备的影响因素及条件优化；③纯NH₄体系、NH₄-Na体系、NH₄-柠檬酸体系磷酸钙骨水泥的理化性质、细胞相容性与细胞毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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磷酸钙骨水泥是磷酸钙化合物的混合物。它是由固相和液相两种原材料以一定的比例调合成糊状后植入体内，在体内环境下自行结晶固化。其固化后终产物的化学成分与骨组织的无机成分相似，其晶相结构亦与骨组织相近，植入骨缺损后可被逐渐降解吸收，降解释放的钙和磷参与缺损区骨组织形成。其固相成分是由2种或2种以上的粉末状磷酸盐混合物组成，而液相则可能是水、等渗盐水或磷酸钠。常用于合成磷酸钙骨水泥的磷酸盐有：磷酸四钙、磷酸三钙、二水磷酸二钙、磷酸二钙等，均具有良好的生物相容性。磷酸钙骨水泥抗压强度介于骨松质和骨皮质之间。抗压强度的大小与磷酸钙骨水泥固化过程中所用固相成分的颗粒大小及终产品的孔隙率和羟基磷灰石结晶度密切相关，而终产品孔隙率与调合时的粉液比直接相关。较大抗压强度的磷酸钙骨水泥适用于低负重部位的骨缺损修复，较小抗压强度的磷酸钙骨水泥适用于非负重部位骨缺损或小体量的骨缺损修复及牙根管充填。临床上使用的磷酸钙骨水泥根据其构成成分主要分为三大类，第一类是磷酸三钙型骨水泥，主要构成骨水泥的固相由磷酸三钙、磷酸七钙、偏磷酸钙、焦磷酸钙和二水合磷酸二钙等磷酸钙类化合物中的一种与脱碳磷酸钙按一定比例混合而成；第二类为碳化磷酸钙骨水泥，主要构成成分为磷酸一钙、阿尔法-磷酸三钙、碳酸钙的混合物；第三类主要为磷酸四钙型骨水泥，其主要固体成分为磷酸四钙、二水磷酸氢钙或无水磷酸氢钙等。磷酸钙骨水泥与现行骨缺损修复材料如自体骨、异体骨、聚甲基丙烯酸甲酯等骨水泥等相比，它克服了以下缺陷：①自体骨来源有限，需承受第二次手术痛苦及供区潜在的出血、感染等风险；②异体骨存在排斥反应及潜在的病源传播危险；③聚甲基丙烯酸甲酯系列骨水泥的固化过程中大量放热、灼伤周围组织、不可降解、不适合中青年以下人群使用等。而磷酸钙骨水泥的固化反应不伴有放热，又具有良好的诱导骨能力，可生物降解，能被新生骨组织替代，且对骨重塑或骨折愈合无明显毒副作用，无明显免疫原性及致癌作用，而且其又具有可塑形，可注射性，有较高的抗压强度及对CT和MRI成像没有干扰等优点，特别是磷酸四钙型骨水泥性能尤为突出，除了具有上述其他磷酸钙骨水泥良好的生物相容性外，还具有较大的压缩强度，较好的诱导骨组织再生，非常适合于传统的无感染的骨缺损修复手术。当前许多科研聚焦于多孔支架和多能干细胞，良好的磷酸四钙型骨水泥甚至可以通过制孔剂将其固化产物制备成多孔磷酸钙支架，然后与多能干细胞体外复合，形成真正的生物活性磷酸钙骨支架，这一研究方向非常值得尝试。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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一种可注射生物活性磷酸钙骨修复材料的制备及表征

Preparation and characterization of an injectable bioactive calcium phosphate material for bone repair

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