纳米羟基磷灰石/涂层双相磷酸钙人工骨移植脊柱后外侧融合：组合磁场的辅助作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (34): 5089-5097.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.012

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纳米羟基磷灰石/涂层双相磷酸钙人工骨移植脊柱后外侧融合：组合磁场的辅助作用

卓祥龙¹，吕红斌²，胡建中³，李兵¹，刘咏⁴，吴祖同³

¹柳州市工人医院脊柱外科，广西壮族自治区柳州市 545001；中南大学湘雅医院，²运动医学科，³脊柱外科，湖南省长沙市 410008；⁴中南大学粉末冶金研究院，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2016-06-04 出版日期:2016-08-19 发布日期:2016-08-19
通讯作者: 胡建中，中南大学湘雅医院脊柱外科，湖南省长沙市 410008
作者简介:卓祥龙，1976年生，安徽省灵璧县人，汉族，2011年中南大学湘雅医院毕业，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事脊柱疾病微创治疗及生物材料相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171699)

Nano-hydroxyapatite coated biphasic calcium phosphate for posterolateral lumbar fusion: combined magnetic field plays an auxiliary role

Zhuo Xiang-long¹, Lv Hong-bin², Hu Jian-zhong³, Li Bing¹, Liu Yong⁴, Wu Zu-tong³

¹Department of Spine Surgery, Liuzhou Worker’s Hospital, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ²Department of Sport Medicine, ³Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; ⁴Powder Metallurgy Research Institute, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2016-06-04 Online:2016-08-19 Published:2016-08-19
Contact: Hu Jian-zhong, Department of Spine Surgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Zhuo Xiang-long, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Spine Surgery, Liuzhou Worker’s Hospital, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171699

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
纳米羟基磷灰石涂层双向磷酸钙人工骨：双相磷酸钙是由不同比例的羟基磷灰石和β-磷酸钙酸钙混合而成，两者均属于磷酸钙陶瓷，与天然骨矿物质充分和结果类似，具有良好的生物活性和生物相容性。天然骨中羟基磷灰石是以纳米形式存在，纳米羟基磷灰石具有更好地生物活性，在双相磷酸钙人工骨表面进行纳米羟基磷灰石涂层能够提高人工骨的活性和生物相容性。
组合磁场：为一种新型的生物物理刺激，其信号是2种波的组合，为动态交替的正弦电磁场并联叠加于静磁场上组成。静磁场强度0.2 Gs，正弦电磁场的磁场强度为0.4 Gs，频率76.6 Hz，正好在0-150 Hz范围内，这个区域的频率对刺激成骨效果最佳。

背景：自体骨移植是脊柱融合的主要方法，但其来源有限，而且伴有很多并发症的发生，人工合成材料已成为最有前途的骨移植替代材料。
目的：观察组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层对双相磷酸钙人工骨移植兔脊柱后外侧融合的影响。
方法：制作48只兔双侧L5/6横突间融合模型，随机分成6组：G1组为组合磁场+自体髂骨；G2组为组合磁场+纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙；G3组为组合磁场+双相磷酸钙；G4组为安慰剂+自体髂骨；G5组为安慰剂+纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙；G6组为安慰剂+双相磷酸钙。术后1周开始组合磁场治疗，30 min/d，治疗8周后处死实验动物，分别进行触摸法、X射线、CT、组织学(脱钙和不脱钙骨)和生物力学评估脊柱融合效果。
结果与结论：①触摸法、X射线法和组织学评估G2组脊柱融合率最高，G6组最低，差异有显著性意义(P < 0.05)。G2组新生骨长入比显著高于G3，G5组和G6组(P < 0.05)；②X射线片显示融合区校正吸光度指数G2组显著高于其他各组(P < 0.05)；③CT和组织学可见新生骨小梁从自体骨长入人工骨孔隙内，与自体骨形成骨性结合；④生物力学结果显示，G2组脊柱弯曲刚度最高，显著高于其他各组(P < 0.05)；⑤析因分析结果显示，组合磁场治疗和纳米羟基磷灰石涂层可显著提高脊柱融合率、融合评分、骨长入比、融合区校正吸光度指数及脊柱融合弯曲刚度(P < 0.05)；⑥结果提示，组合磁场联合纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙生物支架进行兔脊柱后外侧融合能够显著提高融合率，融合效果类似于单纯的自体骨融合，可作为脊柱融合的一种新方式。

ORCID: 0000-0002-3239-0539(卓祥龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 纳米羟基磷灰石涂层, 组合磁场, 双相磷酸钙, 腰椎后外侧融合, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Autologous bone is considered the main material for spinal fusion, while synthetic materials overcome the shortcomings caused by the autologous bone (complications and limited source) and become the most promising bone graft substitute materials.
OBJECTIVE: To investigate the effects of nano-hydroxyapatite (nano-HA) coating and combined magnetic field (CMF) on the biphasic calcium phosphate (BCP) transplantation for rabbit posterolateral lumbar fusion.
METHODS: Forty-eight rabbits underwent bilateral intertransverse processes fusion at the level of L5-6, and were then randomly divided into six groups: rabbits in group G1 received autologous iliac bone graft and CMF treatment; group G2 was given nano-HA/BCP and CMF treatment; group G3 received BCP and CMF treatment; group G4 received autologous iliac bone graft and placebo; group G5 underwent nano-HA/BCP and placebo; group G6 received BCP and placebo. CMF treatment was performed 30 minutes each day for 8 consecutive weeks beginning at 1 week after surgery. These rabbits were euthanized at 9 weeks after surgery to evaluate spinal fusion effects through palpation, X-ray examination, CT examination, histological analysis (decalcified and undecalcified sections) and biomechanical assessment.
RESULTS AND CONCLUSION: The palpation, X-ray and histological examinations showed that there was significant difference in the fusion rate between groups G2 and G6, the highest in the group G2, and the lowest in the group G6 (P < 0.05). The bone ingrowth rate in the group G2 was significantly higher than those in the groups G3, G4 and G6 (P < 0.05). The normalized optical density index of fusion mass and bending stiffness in the group G2 were significantly higher than those in the other groups (P < 0.05). CT and histological observations found that new bone trabecula grew into the biological scaffold, exhibiting osseointegration. Factorial analysis showed that CMF and nano-HA coating could significantly improve the spinal fusion rate, fusion score, bone ingrowth rate and bending stiffness (P < 0.05). In conclusion, CMF combined with nano-HA/BCP for rabbit posterolateral lumbar fusion can significantly ameliorate the fusion rate, which is analogous to the single autologous bone; therefore, it can be used as a new spinal fusion method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Lumbar Vertebrae, Spinal Fusion, Nanocomposites, Hydroxyapatites, Electromagnetic Fields, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

卓祥龙，吕红斌，胡建中，李兵，刘咏，吴祖同. 纳米羟基磷灰石/涂层双相磷酸钙人工骨移植脊柱后外侧融合：组合磁场的辅助作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5089-5097.

Zhuo Xiang-long, Lv Hong-bin, Hu Jian-zhong, Li Bing, Liu Yong, Wu Zu-tong. Nano-hydroxyapatite coated biphasic calcium phosphate for posterolateral lumbar fusion: combined magnetic field plays an auxiliary role[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5089-5097.

图/表（结果） 11

2.1 实验动物数量分析共有48只成年家兔纳入实验，随机分成6组，每组8只。在实验早期(术后2周内)有2只兔手术中死亡，按序补入。

2.2 大体观察及触摸法融合评估结果触摸法融合率和评分见表2。各组融合率以G2组最高(94%)，G6组最低(44%)，2组相比差异有显著性意义(P=0.006)，G1组也显著高于G6组(P=0.023)，G5和G3组略高于G4组，但差异无显著性意义。析因分析显示A和B两因素没有交互作用(F=0.56，P=0.949)，A因素主效应提高融合率23%，差异有显著性意义(F=6.747，P=0.011)，B因素主效应是提高融合率19%，差异也有显著性意义(F=3.513, P=0.034)。

G1，2，5组融合评分都显著高于G6组(P=0.003，0.001，0.028)，G2组也高于G4组(P=0.028)，余各组间比较差异无显著性意义。析因分析结果显示A因素和B因素没有交互作用(F=0.073，P=0.930)，A因素主效应提高融合评分0.33，差异有显著性意义(F=4.667，P=0.037)；B因素的主效应提高0.38，差异有显著性意义(F=4.594，P=0.016)。

2.3 X射线片结果术后5周各组均可见到横突间有多少不等的骨痂形成，但不连续；术后7周，在G1和G2组中可见到横突间连续骨痂出现，各有3只实验动物达到了影像学融合标准，但各组间骨痂形成量没有明显差别。术后9周，组合磁场治疗组形成的骨痂量相对要多一些，G1，G2和G5组骨痂形成稍多，G3，G4和G6组形成较少。

2.3.1 X射线融合评价 X射线融合率和评分见表2。

G1和G2组融合率最高，显著高于G6组(P=0.023)，其他各组之间差异无显著性意义。析因分析结果显示A因素和B因素没有交互作用(F=0.51，P=0.95)，A因素(组合磁场治疗)主效应提高融合率为21%，差异有显著性意义(F=5.102，P=0.026)；B因素提高融合率为17%，差异无显著性意义(F=2.908，P=0.06)。

比较各组间融合评分结果显示G1，G2，G5组融合评分显著高于G6组(P=0.006，0.01，0.025)，余各组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。析因分析显示A因素和B因素没有交互作用(F=0.538，P=0.588)，A和B因素主效应分别为0.79和0.75，差异有显著性意义(F=4.521，P=0.039；F=3.243，P=0.49)。

2.3.2 融合区校正吸光度指数由图2所示融合区校正吸光度指数度指数，自体髂骨组(G1组和G4组)校正吸光度指数始终显著低于其他各组(P < 0.05)，但保持增高的趋势。而G2，G3，G5和G6四组校正吸光度指数经历升高、下降后再缓慢升高的过程。第5周G3组校正吸光度指数高于其他各组，此后G2组校正吸光度指数升高加快，第7，9周始终明显高于其他各组(P < 0.05)。

由图3可以看出术后9周，组合磁场治疗组校正吸光度指数均显著高于对照组，G2组显著高于其他各组(P < 0.05)，G3和G5组也明显高于G6组(P=0.009，P=0.63)。析因分析结果显示A因素和B因素之间没有交互作用(P=0.835)，A因素主效应提高校正吸光度指数3.15 (P=0.000)，B因素主效应提高了2.15(P=0.008)。

2.4 CT分析结果 CT扫描显示自体髂骨组植骨大部分被吸收，在相邻横突之间新生骨痂形成骨桥连接。在G1组新生骨痂量要多于G4组，密度也高于G4组，这与X射线的校正吸光度指数结果一致(图4A，B)。人工骨组可见到新生骨自横突和小关节突与人工骨紧密连接并长入人工骨内部，形成连续骨桥连接相邻横突。G2组与其他组相比，人工骨变得稀疏、松散，人工骨残留减少明显，有更多的骨痂形成包绕人工骨，人工骨与自体骨形成紧密骨整合(图4C)。G3和G5组人工骨与自体骨形成骨整合，但新生骨痂相对G2组少，人工骨稍松散，孔隙变大，结构尚规整(图4D，E)，G6组新生骨骨痂更少，有时在界面区可见到线状缝隙，这说明人工骨与自体骨之间新生骨矿化不完全，密度稍低于周围组织，人工骨较规整(图4F)。

2.5 生物力学结果如表3所示，G2组脊柱弯曲刚度最高，显著高于其他各组(P < 0.05)，G4组脊柱弯曲刚度最低，亦显著低于G1和G5组(P < 0.05)，G5组脊柱弯曲刚度还显著高于G6组(P < 0.05)。余各组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。析因分析结果显示A因素和B因素没有交互作用(F=1.521，P=0.068)，A因素(组合磁场治疗)主效应为提高弯曲刚度20.41 N/mm，差异有显著性意义(F=14.12，P=0.01)；B因素的主效应是提高弯曲刚度23.85 N/mm，差异有显著性意义(F=16.43， P=0.000)。

由表3可见，G3组的最大应力和最大弯曲载荷最大，显著高于其他各组(P < 0.05)；G6组最大应力和最大弯曲载荷最小，显著小于其他各组(P < 0.05)；G2组显著高于G1，G4和G5组(P < 0.05)，余各组间比较差异无显著性意义。G1，G4和G5组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。组合磁场治疗组可显著提高人工骨组最大应力和最大弯曲载荷(P < 0.05)，但对自体髂骨组没有明显作用。

2.6 组织学分析结果

2.6.1 脊柱融合评价结果各组脊柱融合率见图5。G2组融合率高于其他各组，但只显著高于G6组(P=0.029)，其他各组间融合率差异无显著性意义(P > 0.05)。析因分析显示A和B两因素没有交互作用(F=0.108, P=0.898)。A因素主效应能够显著提高融合率，为29% (F =5.277, P=0.027)；B因素主效应能够提高融合率，为25%(P=0.06)。

各组脊柱融合评分见图6。G2组融合评分显著高于G3，G4和G6组(P < 0.05)，G1组亦显著高于G6组(P=0.008)，余各组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。析因分析显示A和B两因素之间没有交互作用(F=0.272, P=0.763)。A因素主效应提高融合评分1.0(F=5.81，P=0.02)，B因素主效应提高融合评分0.96(F=4.206, P=0.022)。

横突间可见连续骨桥形成，人工骨周围生成新生骨痂，并长入人工骨内，形成骨性相连，有成熟骨髓腔和骨小梁结构。界面区域内有大量的成骨细胞、软骨细胞存在、骨髓(图7)。人工骨孔隙内由新生骨、纤维组织组成，可见骨细胞陷窝和骨细胞，有成熟骨小梁并相互连通，可见到骨小管，人工骨变得稀疏，松散，边缘模糊(图8)，成骨细胞围绕在新生骨周围，破骨细胞和软骨细胞少见，并可见到较多血管长入，骨样基质沉积在成骨样细胞周围并逐渐钙化，在人工骨周围和内部可见到多核细胞围绕。G2组人工骨自体骨整合效果最佳，有连续新生骨小梁长入人工骨孔隙内，可见到成熟新生骨小梁结构形成的网络，而且孔内新生骨形成也高于其他人工骨组，周围骨痂以成熟骨组织为主。G6组新生骨小梁最少，孔隙内以纤维组织为主，伴有新生骨形成，在新生骨边缘可见成骨细胞和破骨细胞围绕，人工骨周围骨痂纤维组织较多。G3和G5组相对G6组来说，新生骨增加，胶原纤维减少，新生骨与纤维组织的比例在50%左右。人工骨周围包绕的骨痂以软骨为主。

2.6.2 人工骨孔隙内骨长入比 G2组骨长入比最高并显著高于其他各组(P < 0.05)，G6组最低并显著低于G3组(P < 0.05)和G5组(P=0.054)。析因分析结果显示A和B因素的主效应分别为10.305和9.865(P=0.001)(图9)。

2.6.3 人工骨残留率在新生骨形成的同时伴随着人工骨的降解，IPP软件计算的人工骨残留面积百分率结果显示(图10)，G2组人工骨残留率最少为38%，显著低于G3和G6组(P < 0.05)，余各组残留率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。析因分析结果显示，A因素对人工骨降解没有显著促进作用(P=0.13)，B因素能够显著促进人工骨降解(P=0.003)。

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引言

材料方法

1.1 设计 2因素3层次析因分析设计。

1.2 时间及地点实验于2009年3月至2010年11月完成。材料实验在中南大学粉末研究院完成，动物实验在中南大学动物学部完成，病理性检测在中南大学湘雅医院病理科及上海中医药大学附属曙光医院完成，生物力学检测在中南大学粉末研究院完成。

1.3 材料用PASS 2008软件估计样本量(检验水准α=0.05，检验效能>0.80)，结果每组不少于7只。查表法把48只健康成年家兔随机分成6组，见表1。

48只纯种健康成年家兔，由中南大学动物学部提供，体质量(2.2±0.2) kg，雌雄不拘。多孔双相磷酸钙人工骨(湖南省共创生物功能材料有限公司)，纳米羟基磷灰石涂层多孔双相磷酸钙人工骨(自制)，戊巴比妥钠(Sigma公司)，组合磁场治疗仪(美国Donjoy公司赠送)。Motic病理图像自动采集系统，Image-pro Plus 6.0 图像分析软件。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立、治疗及标本采集家兔单笼喂养1周后手术，饲养笼标记分组实验动物。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉，L₅棘突为中心正中切口，椎旁肌间隙显露L₅_，₆横突，去皮质，同切口每侧切取2.5 cm³髂骨备用。各组根据实验设计植入移植材料后缝合切口。术后1周开始组合磁场治疗，30 min/d，治疗8周后安乐死法处死，切取L₁-S₂脊柱标本放入-70 ℃超低温冰箱中保存。

1.4.2 大体观察及触摸法评估脊柱融合^[13] 根据自体髂骨、人工骨与脊柱横突结合牢固程度进行评估，对每个样品两侧分别单独评分。融合区域分为2级：活动记为0分，牢固记为1分，总分0-2分。固定认为融合，否则为不融合。

1.4.3 X射线检测分别于术后1，3，5，7，9周拍摄前后位X射线片。采用Faxitron X射线摄片机，球管电压 70 kV，电流0.3 mA，曝光时间15 s。根据Lopez等^[14]描述的标准对X射线进行双盲评分。根据Huang等^[15]介绍的方法测量融合区吸光度。用IPP图像分析软件把X射线图片转换为黑白照片以提高融合区密度使其有更高的吸光度(图1)。采用标准化吸光度指数进行组间比较。校正吸光度指数=融合区累积吸光度/相邻椎体校正累积吸光度。

1.4.4 双源CT扫描测量前夜标本4 ℃过夜至完全解冻，扫描条件：准直16 mm×0.3 mm；重建层原0.4 mm；重建间距0.2 mm；卷积核U90，U70sharp；重建视野(FOV)50 mm，120 kV，180 mA；螺距0.85；扫描时间14-18 s，进行脊柱融合区扫描，获取扫描层次原始数据，用Minics 8.0进行重建。观察人工骨与自体骨整合情况以及骨痂形成量。

1.4.5 生物力学测试测试前夜标本4 ℃过夜至完全解冻，剔除全部软组织和肌肉，仅保留肌腱和小关节囊，将试样放置于材料力学实验机的支座正中，止点跨距设为25 mm，进行三点弯曲实验。预载10 N，加载速度0.4 mm/s，5次循环后应变达到0.5 mm。然后加载速度设为3 mm/min，继续加载至样本断裂。测定弯曲载荷-变形曲线，测出弯曲最大载荷、最大应力、根据压力应变曲线计算脊柱弯曲刚度指标^[16]，定量分析样本力学特征。

1.4.6 组织学分析脱钙融合区骨组织切片苏木精-伊红染色，不脱钙融合区组织切片甲苯胺蓝染色^[17]，根据融合区纤维组织、软骨、不成熟和成熟新生骨的比例对切片进行评分，总分10分^[18]，评分大于6分认为成功融合，指的是有连续骨桥通过临近横突。IPP 6.0测量计算骨长入比及人工骨残留百分率。骨长入比例是指新生骨总量占孔隙总量的比例^[19]。

1.5 主要观察指标术后1周安乐处死实验动物，分别进行触摸法、X射线、CT、组织学(脱钙、不脱钙)和生物力学检测，观察其融合效果。

1.6 统计学分析 SPSS 13.0统计软件包建立本实验计量资料和计数资料数据库。采用一般线性模型单变量析因分析实验数据，如有交互作用则对各因素的单独效应进行单独分析；计量资料采用方差分析，若方差不齐，两样本采用Wilcoxon秩和检验，多样本采用Kruskal-Wallis秩和检验，若有显著差别再用LSD法检验分析；等级资料采用Wilcoxon符号秩检验或Kruskal-Wallis秩和检验，若有显著差别再LSD法进行分析；率或构成比采用卡方检验进行分析。检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 组合磁场+纳米羟基磷灰石涂层对脊柱融合人工骨骨整合的影响 Linovitz等^[20]多中心临床RCT双盲研究组合磁场对无内固定脊柱融合的影响，术后9个月治疗组的融合率为64%显著高于对照组的43%(P=0.003)。Marks^[21]研究显示脉冲电磁场能够显著提高腰椎后外侧融合率，促进骨桥形成，提高临床治疗效果。文章结果显示，组合磁场治疗能够显著提高纳米羟基磷灰石涂层多孔双相磷酸钙人工骨兔脊柱后外融合率。对触摸法评估结果进行析因分析，组合磁场治疗能够提高融合率为23%，B因素主效应能够提高融合率为19%，差异有显著性意义(F=6.747，P=0.011；F=3.513，P=0.034)，这说明组合磁场治疗和纳米羟基磷灰石涂层能够显著提高脊柱融合率，组合磁场+纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙的能够获得理想的融合率(94%)，显著优于单纯自体髂骨植骨(63%)，甚至较组合磁场+自体髂骨植骨融合效果要好(88%)。校正吸光度指数析因分析结果进一步支持了触摸法融合评估结果，组合磁场治疗和纳米羟基磷灰石涂层均能够显著提高融合区校正吸光度指数，说明融合区的骨密度得到了提高，这表示融合区的新生骨生成量、骨成熟度得到显著增加。Ito等^[22]的研究表明脉冲电磁场能够提高融合区骨密度，并且能够降低因内固定引起的压力遮挡。CT扫描显示在G2组人工骨块体周围形成的骨痂显著多于其他人工骨植入组，而且新生骨长入人工骨内部更明显。

这些都说明组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层能够显著提高双相磷酸钙人工骨兔腰椎后外侧融合率，有利于双相磷酸钙与骨整合，组合磁场治疗促进了人工骨与自体骨整合，提高了融合率。组合磁场辅助治疗联合纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙移植具有最佳脊柱融合效果，显著提高了脊柱融合率，而且显著高于单纯自体髂骨移植。

3.2 组合磁场+纳米羟基磷灰石涂层对脊柱融合区成骨的影响组合磁场和纳米羟基磷灰石显著提高了脊柱融合评分说明组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层能够显著改善融合效果，有利于新生骨生成和矿化。与其他组相比，G2组纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙人工骨周围有更多的新生骨痂形成，与自体骨结合更紧密，有连续骨桥形成与自体骨形成骨性结合。孔隙内有更多骨长入，骨长入比最高，以新生骨为主，骨小梁成熟度更高。

作者所在课题组前期曾采用低强度脉冲超声波刺激多孔羟基磷灰石块体用于兔脊柱后外侧融合的研究，结果显示低强度脉冲超声波刺激能够显著促进新生骨形成并长入羟基磷灰石孔隙内，促进成骨细胞、成软骨细胞迁徙入支架内部^[19]，在使用组合磁场治疗兔髌腱连接点损伤过程发现组合磁场能够促进髌腱连接点修复过程中骨形成，从而治愈髌腱连接点损伤^[23]。实验结果显示在G2组人工骨孔隙内有更多的新生骨小梁长入，骨小梁成熟度高，以板层骨为主，人工骨内部孔隙内新生骨形成明显多于其他人工骨组(G3、G5和G6组)，人工骨孔隙内骨长入比结果显示G2组显著高于G3、G5组和G6组(P=0.002，0.002和0.000)，而且G6组也显著低于G4和G5组(P=0.039，P=0.052)。析因分析结果显示组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层显著提高骨长入比(P=0.001)。这说明组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层都能显著促进新生骨长入人工骨内部孔隙，促进孔隙内新生骨生成，而且以组合磁场+纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙效果最好，这也说明组合磁场改善了人工骨的生物相容性和生物活性，这与Fini等^[24-25]的研究结果一致。这些也从CT扫描结果得到证实，在G2组周围见到更多的高密度骨痂，人工骨与自体骨没有低密度缝隙，而G3和G5组相对骨痂相对较少，而G6组周围可见到线样低密度缝隙。

从硬组织切片和CT扫描看两种人工骨材料都可以见到人工骨降解的表现，这说明在新生骨形成的同时，人工骨进行着降解。析因分析结果发现纳米羟基磷灰石涂层能够显著降低人工骨残留率达12%(P < 0.05)，而组合磁场只能降低6%(P > 0.05)，这说明纳米羟基磷灰石涂层可调节双相磷酸钙人工骨更快的降解，，还不能认为组合磁场有促进人工骨降解的作用，这样有利于新生骨的爬行替代。

3.3 组合磁场+纳米羟基磷灰石涂层对融合的生物力学的影响动物实验证明脉冲电磁场能够显著改善生物材料的组织学反应，提高生物支架生物相容性，促进自体骨与支架材料骨整合，提高新生骨形成率，显著改善骨整合力学性能。Galzer等^[26]把10只新西兰大白兔自体骨后外侧融合融合模型随机分成脉冲电磁场治疗组和对照组。6周后力学测试表面脉冲电磁场显著提高了脊柱弯曲刚度(35%)，最大弯曲位移(37%)和最大载荷(42%)，融合区新生骨显著增加。此次实验采用三点弯曲实验被认为能够完全确定融合是否成功的检测方法。力学检测结果与Galzer实验结果相一致，G2组脊柱弯曲刚度最高，显著高于其他各组(P < 0.05)，G5组也显著高于G4和G6组(P < 0.05)，G1组显著高于G4组(P < 0.05)。析因分析显示组合磁场能够显著提高脊柱融合的弯曲刚度20.41 N/mm(F=14.12，P=0.01)，骨移植材料因素也能显著提高脊柱融合弯曲刚度达23.85% (F=16.43，P=0.000)。这说明组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层对于提高多孔双相磷酸钙人工骨脊柱融合的力学性能都改善起到显著作用，两者结合能够显著提高双相磷酸钙人工骨移植脊柱后外侧融合的力学性能，组合磁场治疗能够显著改善人工骨脊柱融合的力学性能。然而测量的融合区最大弯曲载荷和最大应力与弯曲刚度结果不一致，G3组的最大应力和最大弯曲载荷最大，显著高于其他各组(P < 0.05)；G6组最大应力和最大弯曲载荷最小，显著小于其他各组(P < 0.05)；G2组显著高于G1，G4和G5组(P < 0.05)，余各组间比较差异无显著性意义。G1，G4和G5组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。组合磁场治疗组显著提高人工骨组最大应力和最大弯曲载荷(P < 0.05)，但对自体髂骨没有明显作用。最大弯曲载荷和最大应力与脊柱融合弯曲刚度结果不一致，这是因为两者测量方法不一致，弯曲刚度表现的是脊柱的初始刚度，既在进行弯曲开始形变的前2 mm范围内的应力变化，可准确反映脊柱的融合效果，而最大弯曲载荷和最大应力则是代表融合区破坏的最大能量，这不但受融合本身的影响，而且还受到椎体大小、椎间盘、小关节和韧带等因素的影响，所以认为弯曲刚度能够才能准确反映脊柱融合效果。

小结：实验发现制备的多孔纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙人工骨具有良好的生物相容性、生物活性和降解性，组合磁场和纳米羟基磷灰石涂层都能够促进脊柱融合和改善融合效果，组合磁场辅助治疗联合纳米羟基磷灰石/双相磷酸钙进行兔脊柱后外侧融合能够显著提高融合率，融合效果近似、甚至好于单纯的自体移植，而且组合磁场治疗能够改善人工骨的生物活性和生物相容性。

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纳米羟基磷灰石/涂层双相磷酸钙人工骨移植脊柱后外侧融合：组合磁场的辅助作用

Nano-hydroxyapatite coated biphasic calcium phosphate for posterolateral lumbar fusion: combined magnetic field plays an auxiliary role

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