2.1  神经嵴细胞发生时差异表达的基因被富集在不同的“信号通路”、“分子功能”和“生物学过程”子集  从GEO Datasets数据库获取了神经嵴细胞发生时差异表达的500个基因，这些基因之间的关系并不清楚。本研究中应用DAVID在线数据库对这500个基因进行生物信息学分析，结果显示这些基因可以富集到不同的“信号通路”、“分子功能”和“生物学过程”子集中。

在信号通路子集中，按照KEGG数据库的分类，这500个基因中部分基因被富集到了10个不同的子集(表1)，其中SMAD6、骨形态发生蛋白5、PITX2和TGFB2等10个基因属于转化生长因子β信号通路，这10个基因在整个转化生长因子β信号通路所处的位置及与其他信号通路的关系如图1所示。此外，NKD1、SOX17、AXIN2和WNT6等8个基因富集在WNT信号通路，GLG1、NCAM1、ITGA6和NLGN1等8个基因富集在细胞黏附分子信号通路。这些信号通路都与神经嵴发育密切相关。

按照“功能关键词”进行分类，这500个基因中部分基因被富集到了多个不同的分子功能子集，其中与神经嵴发育密切相关的子集见表2，包括同源盒基因、生长因子、黏附因子和细胞外基质等。同源盒基因中包括GSC、OTX2、PAX3、MSX2、DLX6、PITX2等14个基因，已有研究表明这些基因对神经嵴细胞的发育具有十分重要的调控作用。

按照GO数据库的“生物学过程”进行分类，这500个基因中部分基因可被富集到了多个不同的生物学过程子集(表3)，包括胚胎形态发生、神经嵴细胞分化、神经嵴细胞迁移、神经管发育和骨骼系统发育等。其中神经嵴细胞分化子集包括成纤维细胞生长因子19、PAX3、SOX9和 SHH等8个基因，神经管发育子集包括GSC、PAX7、SHH和TWIST1等9个基因。这些对神经嵴细胞的发育具有十分重要的调控作用的基因按照一定的规律都进行了分类。

2.2  神经嵴细胞发生关键调控基因的分子网络  应用STRING数据库分析DLX5、MSX2、SNAIL2、PAX7、SHH、SOX9、NOG、GSC、KAL1、骨形态发生蛋白5、成纤维细胞生长因子8和WNT3a等12个基因之间关系，结果显示这些基因之间存在相互作用的分子网络。STRING可以“Actions”、“Evidence”和“Interactive”等模式显示这些基因的分子网络图。当以“Actions”显

示时可以从分子网络中看到各个基因之间存在激活、抑制、表达调控等相互作用关系(图2)，如KAL1和成纤维细胞生长因子8之间存在相互作用，成纤维细胞生长因子8和WNT3a存在表达调控的相互作用。DLX5和MSX2可结合在一起形成转录复合体并调控彼此的表达。当以“Evidence”显示时可以从分子网络中看到各个基因之间关系及资料来源(图3)，如KAL1和成纤维细胞生长因子8之间的关系通过文献挖掘获得，骨形态发生蛋白5和NOG之间的关系在文献，数据库和实验中都有获得，而SHH和NOG之间存在共表达的关系。

1.1  设计  生物信息学分析。

1.2  时间及地点  实验于2015年1至9月在黑龙江省口腔病防治院完成。

1.3  方法

1.3.1  获取神经嵴细胞发生时的基因表达芯片数据  美国NIH主办的GEO公共数据库可获取大量开放的基因芯片数据。本研究拟获取神经嵴细胞发生时的基因表达芯片数据，其步骤如下：输入网址“http://www. ncbi.nlm.nih.gov/”，点击进入网页。从下拉框中选择“GEO Datasets”，在搜索栏中输入“neural crest”，搜索后选择“Embryonic cranial neural crest and neural plate”数据集(GEO参考序列号：GSE38381)，该数据集采用表达芯片检测鸡胚神经板和神经嵴组织差异表达的基因，相关实验参数可在以往的文献中查阅^[12]。本研究中，应用GEO Datasets自带数据分析软件对原始数据进行成组t 检验统计学分析，设置P < 0.01为差异有统计学意义。获得神经嵴细胞发生时差异表达的基因集，选取表达差异明显的前500个基因用于后续生物信息学分析。

1.3.2  神经嵴细胞发生时差异表达基因的生物信息学分析  DAVID数据库集合了Gene Ontology (GO)、KEGG等公共数据库，可对大量基因数据集进行富集和归类^[13]。研究中应用DAVID数据库对神经嵴细胞发生时表达明显发生改变的500个基因进行系统生物信息学分析，其步骤包括：打开网页“http://david.abcc.ncifcrf. gov/home.jsp”，进入DAVID在线数据库，将神经嵴细胞发生时表达明显发生改变的500个基因从EXCEL表格中复制到基因输入框，以“Official gene symbol”作为识别类型，本文选自哺乳动物 “Mus musculus(小鼠)”作为注释种属。提交数据后点击“Start Analysis”按钮对这500个基因进行生物信息学分析。

1.3.3  神经嵴细胞发生关键调控基因的分子网络分析STRING数据库可分析一些蛋白之间的相互作用关系^[14]。已有文献报道Anosmin(又称为KAL1)可调控成纤维细胞生长因子8和骨形态发生蛋白5的表达，并且增强成纤维细胞生长因子8的活性同时抑制骨形态发生蛋白5和WNT3a的活性来调控神经嵴的发育。此外，DLX5、MSX2、SNAIL2、PAX7、SHH、SOX9、NOG和GSC等基因也对神经嵴的发生和发育起着关键作用，并且在前述生物信息分析中发现其在神经嵴发生时表达也发生了改变。为研究这些基因之间的相互关系，本研究应用STRING数据库这一系列基因进行生物信息学分析。具体步骤如下：进入网http://string-db.org/ newstring_cgi/show_input_ page.pl，将基因集“DLX5、MSX2、SNAIL2、PAX7、SHH、SOX9、NOG、GSC、KAL1、骨形态发生蛋白5、成纤维细胞生长因子8、WNT3a”输入后点击“GO”进行分析，选择“Mus musculus(小鼠)”作为注释种属。STRING数据库可以“Actions”或“Interactive”等模式显示这些基因的分子网络图。

神经嵴细胞是脊椎动物胚胎发育过程中出现的一个暂时性、多能性细胞群，其来源于神经管边缘的隆起(神经褶)^[1，3]。 神经嵴细胞由头至尾至少可分为颅神经嵴细胞、心神经嵴细胞、迷走神经嵴细胞和体神经嵴细胞，每一部分形成后都沿着特定的路径进行迁移并衍生为颌骨、心脏、周围神经系统等多种重要的组织器官^[2]。神经嵴细胞发育障碍可引起神经管裂开、面裂、心脏疾病等^[4-5，7]。研究神经嵴细胞的发育具有十分重要的意义。现有研究表明，WNT、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、细胞黏附因子和同源盒基因等参与了神经嵴细胞的调控作用^[8-9，11]。研究中通过生物信息学分析发现这些基因在神经嵴细胞发生时其表达发生了改变，并且通过DAVID数据库分析以后可富集到转化生长因子β信号通路、同源盒基因、神经管发育等不同的信号通路、分子功能子集及生物学过程，进一步支持了已有的研究结果。

KAL1、成纤维细胞生长因子8和骨形态发生蛋白5等都是分泌因子，通过与受体结合可影响邻近和远处组织基因的表达和功能。DLX5和MSX2等基因为转录因子，可彼此形成转录复合体，调控其他靶标基因的表达^[10]。以往的研究表明，KAL1和成纤维细胞生长因子8、骨形态发生蛋白5及WNT3a等基因在调控神经嵴细胞发育的时候彼此之间存在相互作用，本研究生物信息学分析发现这些基因不只是单线的作用关系，而是存在互相影响的调控网络，且彼此之间存在反馈调节机制。因此，在研究某一神经嵴相关疾病的发病机制时要综合考虑多个基因的协同或拮抗作用，而不是仅仅聚焦于某一个基因。

以往通过细胞和动物实验等方法可研究基因确切功能，但每次只能研究少数几个基因之间的关系。随着基因芯片的发展，大量芯片数据的出现为研究多个基因间内在关系提供了可能。而生物信息学的发展可帮助我们研究多个基因间的复杂关系^[15]。研究从GEO 公共数据库获取了神经嵴细胞发生时差异表达的基因数据，然后通过DAVID及STRING等数据库对这些基因进行分析，按照一定属性对这些基因进行富集，建立了部分基因的分子调控网络，可帮助清楚的了解众多基因在调控神经嵴发育时的相互关系。 总之，研究应用生物信息分析从GEO数据获得了大量在神经嵴细胞发生时差异表达的基因，这些基因经DAVID数据库分析后按照一定的共同属性富集在转化生长因子β信号通路、WNT信号通路、黏附因子信号通路、同源盒基因、生长因子、神经嵴细胞分化、神经管发育等不同的“信号通路”、“分子功能”和“生物学过程”子集。经STRING数据库分析后建立了DLX5、MSX2、SNAIL2、PAX7、SHH、SOX9、NOG、GSC、KAL1、骨形态发生蛋白5、成纤维细胞生长因子8和WNT3a等12个基因的分子网络图，这些基因通过共表达、拮抗、激活等彼此关联并相互作用形成网络。结果提示要从信号通路和分子网络上整体思考神经嵴发育障碍相关疾病的防治。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：
神经嵴细胞：脊椎动物胚胎发育过程中在神经板弯曲形成神经管时，部分边缘细胞可形成神经嵴细胞。神经嵴细胞是胚胎发育过程中出现的一类暂时性的、多潜能细胞，其可分为颅神经嵴细胞、心脏神经嵴细胞、脊柱神经嵴细胞以及体神经嵴细胞等。可以分化形成骨细胞、软骨细胞、黑色素细胞、神经元细胞和平滑肌细胞等。
生物信息学：生命科学研究中，通过计算机对生物数据信息进行储存、检索和分析的科学。其主要包括基因组学、蛋白质组学和表型组学等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

以往通过细胞和动物实验等方法可研究基因确切功能，但每次只能研究少数几个基因之间的关系。随着基因芯片的发展，大量芯片数据的出现为研究多个基因间内在关系提供了可能。而生物信息学的发展可帮助我们研究多个基因间的复杂关系。本研究从GEO 公共数据库获取了神经嵴细胞发生时差异表达的基因数据，然后通过DAVID及STRING等数据库对这些基因进行分析，按照一定属性对这些基因进行富集，建立了部分基因的分子调控网络，可帮助清楚的了解众多基因在调控神经嵴发育时的相互关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程