内皮祖细胞与高血压病的应用研究进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.020

摘要/Abstract

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文题释义：

内皮祖细胞：是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。1997年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞。

高血压病：是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征，可伴有心、脑、肾等器官功能或器质性损害的临床综合征。高血压和内皮细胞功能障碍之间密切相关，一方面血管内皮功能障碍在高血压的发生、发展过程中起重要作用；另一方面高血压本身又加重血管内皮功能障碍，形成恶性循环。

背景：内皮细胞结构和功能的改变是多种心血管疾病的共同病理基础。现已证实，高血压、冠心病等患者内皮结构和功能严重受损。

目的：试图从血管内皮祖细胞角度，探索治疗高血压的新方法。

方法：检索PubMed数据库和万方数据库，以关键词“hypertension，EPCs”和“高血压病，内皮祖细胞”进行文献检索，按相关性进行排序最终获得近200余篇英文文献，100余篇中文文献，最后筛选出49篇符合标准的文献。

结果与结论：内皮祖细胞的分化和增殖能力较强，调控内皮祖细胞向内皮细胞分化，为高血压病治疗提供一些证据，从而为进一步临床诊疗高血压病提供新的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9672-7284(袁东亚)

关键词: 组织构建, 组织工程, 内皮祖细胞, 高血压, 应用, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Structural and functional changes of endothelial cells are the common pathological basis of cardiovascular disease. Severe structural and functional damage of endothelial cells are found in patients with hypertension or coronary heart diseases.

OBJECTIVE: To explore a new treatment method for hypertension from the perspective of vascular endothelial progenitor cells.

METHODS: PubMed and Wanfang databases were retrieved using the keywords “hypertension, EPCs” and approximately relevant 200 English and 100 Chinese literatures were obtained. Forty-nine eligible literatures were screened finally.

RESULTS AND CONCLUSION: Endothelial progenitor cells have strong differentiation and proliferation capacities. This review may provide a new insight into potential sources of cells for diagnosis and treatment of hypertension.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Hypertension, Tissue Engineering

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图/表（结果） 1

2.1 内皮祖细胞的生物学特性内皮祖细胞具有克隆能力、自我更新能力、增殖能力，在细胞外基质分子中黏附后发育成具有一定功能的内皮细胞^[2]。在胚胎形成过程中，胚胎干细胞和成体干细胞是组成内皮祖细胞的两大来源，具有全能性的内皮祖细胞可通过诱导分化形成多种内皮细胞类型，在临床中有比较广泛的应用价值。来源于胚胎干细胞的内皮祖细胞在分化、提纯和扩增等方面的技术不成熟，并且在移植时存在发展成为肿瘤的风险，同时，伦理道德和法律方面使内皮祖细胞应用受阻。因而，在临床上应用来源于胚胎干细胞的内皮祖细胞进行诊疗还有一段很长的路^[3]。成熟的内皮祖细胞定居于骨髓中，当机体受到组织缺血、降压药物、炎性细胞因子和动员因子影响时，内皮祖细胞便从骨髓中动员进入到循环外周血中。这些内皮祖细胞动员因子包括：粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factors，G-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、基质细胞衍生因子(stromal cel l-derived factor，SDF-1)。此外，有研究表明在脐血^[1]、胎盘^[4]、外周血^[5]、脾脏等组织器官中可分离得到内皮祖细胞^[6]。这样看来，成熟的内皮祖细胞具有来源广、分离提纯和增殖容易的特点，更重要的是，上述过程安全性比较高且不与伦理道德等问题相违背，因而，在临床应用中，内皮祖细胞有比较好的前景。

目前，用于鉴别内皮祖细胞的依据有：鹅卵石样形状、具有克隆能力、表面标志物、吞噬DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白的能力、结合荆豆凝集素的能力和体内外生成血管能力。辛毅等^[7]应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的骨髓间充质干细胞，2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的内皮祖细胞，2种细胞锥虫蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上，传至第2代后，生长曲线均近似“S”形；MTT法检测显示，细胞生长第3-5天时吸光度值变化较明显；骨髓间充质干细胞G₀-G₁期为(93.32±1.65)%、内皮祖细胞G₀-G₁为(93.05±1.95)%，2种细胞DNA周期无明显差异；2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%，CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%，鉴定为内皮祖细胞(图1)。内皮祖细胞的典型表面生物标志物有以下几种：CD34、CD133、KDR、CD31、CD144、CD105、CD146^[8]、血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)^[9]、趋化因子CXCR2和CXCR4等^[10]。虽然内皮祖细胞具有这些生物标记物，但是它们并不具有特异性，例如：CD34是造血干细胞重要的表面标志物；CD133既是来源于人脐血CD34^-造血干细胞的表面标志物^[11]，也是癌干细胞的表面标志物，在直肠结肠癌^[12]、脑肿瘤^[13]、乳腺癌等癌症的诊断中发挥着重要的作用^[14]；CD31既在发育成熟的内皮细胞中表达，也在T细胞中表达^[15]；KDR既是内皮类细胞的表面生物标志物，也是来源于内胚层的肝祖细胞的生物标志物^[16]。为了鉴定内皮祖细胞，通常是采用2种或3种表面生物标志物，例如：来源于骨髓的早期内皮祖细胞虽然表达CD34、CD133和KDR，但是它不表达CD31^[17]；既有报道说来源于人体外周血的晚期内皮祖细胞表达CD31，CD105和CD146^[8]，也有报道说来源于人体外周血的早期内皮祖细胞表达造血干细胞的表面生物标志物CD45，而晚期的内皮祖细胞表达CD31和KDR^[18]。因为这些表面生物标志物缺少特异性并且具有来源广泛的特点，至今，使得内皮祖细胞依旧没有较准确的概念。

2004年Hur等^[19]从成人的外周血中分离培养了2种类型的内皮祖细胞，继而给其命名为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞具有促进血管生成的能力，有研究将这种细胞定义为“循环成血管细胞”；而晚期内皮祖细胞又叫作内皮克隆形成细胞，这种细胞拥有更多表型的内皮细胞类型，进而可分化发育为成熟的内皮细胞，这就是被人们认知的内皮祖细胞。

内皮祖细胞具有吞噬DiI-Ac-LDL，结合UEA-1的能力。在炎性因子白细胞介素1β的作用下，内皮祖细胞可以通过释放血管内皮生长因子达到促进三维血管内皮网络形成的效应。此外，高浓度碱性成纤维生长因子和内皮祖细胞共培养条件下，表现出协同促进血管生成的效应。内皮祖细胞在体内、体外都有生成血管的能力。研究显示，内皮祖细胞移植后能迁移到缺血或受损部位，通过分泌细胞因子或分化发育成内皮细胞从而参与新生血管的构建^[20]，此时，新生的血管可以整合至宿主血管中，这在治疗缺血性疾病中有比较好的应用前景。

2.2 影响内皮祖细胞数量和功能的因素

2.2.1 药物对内皮祖细胞的影响 Zhang等^[21]通过制作裸鼠颈动脉损伤模型证明：下调CXCR7会导致内皮祖细胞功能障碍，而通过使用乐卡地平等二氢吡啶类钙通道拮抗剂可以上调CXCR7，进而可能成为高血压治疗的新靶点；Suzuki等^[22]通过大鼠实验分别用氯沙坦与三氯甲嗪进行干预，最终发现氯沙坦等血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能明显改善受损的内皮祖细胞功能；Georgescu等^[23]研究显示厄贝沙坦治疗高血压仓鼠能明显调控内皮祖细胞水平。Li等^[24]通过苯那普利等血管紧张素转换酶抑制剂治疗高血压患者，发现内皮祖细胞功能得到改善。Raptis等^[25]通过实验表明：阿利吉仑(肾素抑制剂)能改善内皮祖细胞的功能并减缓动脉硬化。Liu等^[26]通过阿托他伐汀治疗肺心病患者，发现能促进内皮祖细胞的迁移和黏附。Chen等^[27]证实ACE2能通过调节eNOS和NOX信号通路来改善内皮祖细胞功能治疗脑卒中。因此，降压药中的二氢吡啶类钙通道拮抗剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂和肾素抑制剂能够比较明显调节内皮祖细胞的数量及功能。此外，他汀类药物在内皮祖细胞数量和功能的调节上也发挥着重要的作用。大部分的降压药和他汀类药物对内皮祖细胞的理化性质起到正性调节作用，进而在心脑血管疾病的血管修复、新生血管和再内皮化过程中有应用前景。

2.2.2 信号传导对内皮祖细胞的影响 Liu等^[28]通过裸鼠颈动脉损伤模型认为，拉西地平促进体外内皮祖细胞CXCR4/JAK-2信号的表达，从而加速血管的再内皮化，一定程度上改善高血压患者的血管内皮功能。Xia等^[29]证实体育锻炼能通过CXCR4/JAK-2信号延缓内皮祖细胞的衰老；剪应力能通过CXCR4/Janus激酶-2信号通路上调，有利于老人血管再内皮化。Xie等^[30]通过盐敏感性高血压大鼠实验证明，通过调控GTPCH/BH4信号通路从某种程度上抑制糖蛋白G-1(TSP-1)的表达和氧化应激进而可以调控内皮祖细胞的数量和功能。Chen等^[31]也是在盐敏感性高血压大鼠中证明，通过内皮素A/NADPH氧化应激通路活化的内皮素1使盐敏感性高血压大鼠内皮祖细胞数量减少以及功能紊乱。Peng等^[32]认为NADPH氧化酶(NOX)介导的氧化应激能调节内皮祖细胞的生物活性，使其功能紊乱。Yang等^[33]表明Tie2/ PI3K/Akt信号通路参与内皮祖细胞介导的血管损伤后再内皮化，剪应力介导的Tie2信号通路上调，促进人内皮祖细胞再内皮化。综上所述，能影响内皮祖细胞理化性质的信号很多，例如：细胞因子、补体、各种活性酶和氧化应激等。这些理化因素能直接或间接调控内皮祖细胞的数量和增殖。如果要将内皮祖细胞应用于临床诊疗心血管疾病，如高血压等，这些可作为切入点。这么看来，内皮祖细胞在临床的应用前景依旧很好。

2.3 内皮祖细胞应用

2.3.1 内皮祖细胞捕获支架内皮祖细胞捕获支架是利用来源于骨髓的内皮祖细胞来修复损伤动脉段的一个装置。内皮祖细胞抗体的表面耦合了共价多糖和人的CD34抗体，然后连接到一个不锈钢的支架上。在支架植入时，CD34抗体能引起循环内皮祖细胞分化为成熟的内皮细胞，进一步形成功能性血管内皮细胞层，其目的是减少支架内血栓形成和再狭窄的风险，也能减少继续沿用抗血小板治疗。心血管疾病患者使用这种支架后，具有安全性和有效性的特点^[34]。这种疗法的不良事件的报道率在4.2%-16%。尽管如此，这也存在问题：内皮祖细胞捕获支架并不像传统支架那样能减缓再狭窄。也有一种新的CD133抗体在猪模型上做实验初步结果表明，CD133支架与再内皮化无明显差异。因此，现行的CD133⁺细胞治疗，将意味着这些支架失去其效应。

2.3.2 内皮祖细胞疗法自从人体成功分离出内皮祖细胞后，来源于骨髓的内皮祖细胞能刺激血管形成进而减缓心血管疾病。最初的临床前期研究中，将体外扩增的CD34⁺细胞注入大鼠心肌梗死模型中，能明显改善大鼠左心室功能。此外，也有研究在猪心肌梗死模型中进行，表明内皮祖细胞可能是一种潜在治疗药物。

顽固性心绞痛患者可经过多种方法治疗，包括冠状动脉旁路移植术和经冠状动脉介入治疗。CD34⁺细胞植入心肌细胞是一种可行的选择。Ⅰ/Ⅱ期和Ⅱb期临床试验表明：运动耐量得到改善，心绞痛得到缓解。一项长期临床研究中，Ⅲ期临床试验共444例患者将充分研究自体CD34⁺细胞植入顽固性心绞痛患者的效应^[35]。此外，也有研究将自体CD34⁺细胞注入严重缺血肢体。研究表明，CD34⁺细胞治疗能减少截肢率^[36]。

2.3.3 内皮祖细胞移植治疗大量研究表明，通过基因修饰方法可提高内皮祖细胞的血管再生、细胞增殖能力，有这种功能的基因有：端粒酶反转录酶基因(telomerase reverse transcriptase，TERT)、内皮型一氧化氮合酶基因(NOS)、人组织型激肽释放酶基因(human tissue kallikrein，hTK)和蛋白激酶B(protein kinase B)与血红素氧合酶1。2012年，Shuai等^[37]将转染hTERT基因的内皮祖细胞植入肾脏切除的大鼠模型中，发现增大毛细血管密度，提高肾功能。2014年，Cui等^[38]通过eNOS基因转染的内皮祖细胞作用于颈动脉受损内皮的大鼠模型中，发现该处颈动脉血管内膜的抗增生及内皮血管舒张功能明显增强。2013年Fu等^[39]将转染hTK-162基因的内皮祖细胞移植于后肢缺血大鼠中，研究表明转染hTK-162基因的内皮祖细胞大鼠缺血周边毛细血管密度及血流灌注量增加。2013年，Yao等^[40]将转染hTK基因的内皮祖细胞移植于急性心肌梗死小鼠模型中，观察到hTK基因的过表达能增加心肌梗死区域周边毛细血管密度、增强左室射血功能，减少心肌细胞凋亡。2007年，Deshane等^[41]研究显示HO-1基因敲除小鼠中，内皮祖细胞的血管生成及迁移能力会严重受损。2012年，Brunt等^[42]研究表明内皮祖细胞过表达Akt与HO-1，内皮祖细胞的黏附、迁移及血管新生能力提高，增强了内皮祖细胞在缺血性疾病的治疗作用。

2.4 药物治疗

2.4.1 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARBs) 这类降压药的主要作用机制是作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统而达到降压效果。有几个研究在探讨这种降压药物对内皮祖细胞数量的影响。3个实验用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂成功治疗原发性高血压，此时内皮祖细胞数量和功能都在提高^[43]。高血压时，活性氧导致血管内皮受损，进而产生大量的血管紧张素Ⅱ。由于NADPH氧化酶是心血管系统中活性氧的主要来源，而这种药物能明显抑制NADPH氧化酶的活性。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂通过增加内皮祖细胞的数量和功能进而抑制氧化应激^[43]，这些发现均证明能提高心血管疾病患者内皮祖细胞的数量和改善其功能。用替米沙坦治疗的人内皮祖细胞活化水平和功能改善水平要明显高于未经该药治疗。然而，内皮祖细胞的数量和功能能被特异性过氧化物酶体增殖物受体γ、GW9662抑制，这表明替米沙坦诱导的内皮祖细胞增殖很可能是通过过氧化物酶体增殖物受体γ依赖性通路发挥效应的。此外，也表明替米沙坦是过氧化物酶体增殖物受体γ的配体。双盲实验中，冠心病患者自认无高血压病史，注射80 mg替米沙坦4周，发现内皮祖细胞数量明显升高，结果进一步支持替米沙坦能改善内皮功能的观点。心血管疾病患者通过使用替米沙坦达到降压进而改善内皮祖细胞功能。因此，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可能通过多重效应改善内皮祖细胞的功能和提高内皮祖细胞的数量，这些机制包括NADPH氧化酶抑制剂和通过过氧化物酶体增殖物受体γ信号通路产生的刺激^[44]。

2.4.2 血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) 与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类似，血管紧张素转换酶抑制剂也是用于治疗高血压的药物，是通过抑制RAAS产生的血管紧张素转换酶进而治疗高血压和心力衰竭。用血管紧张素转换酶抑制剂治疗高血压患者对于提高内皮祖细胞数量和改善其功能有积极作用^[45]。在心血管疾病患者中，用雷米普利不到1周就能增加内皮祖细胞数量和提高其功能，使用4周后，这种效应更加明显。缓激肽B2受体通路能激活内皮型一氧化氮合酶并参与内皮祖细胞形成血管。实际上，一氧化氮水平的提高通过缓激肽得以实现，而这种效应是独立于血压的。在人体内皮细胞中，通过使用血管紧张素转换酶抑制剂能使一氧化氮活化，减少氧化应激。佐芬普利能使一氧化氮含量升高，减缓动脉粥样硬化，减少活性氧的产生。与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂相比，血管紧张素转换酶抑制剂能提高内皮祖细胞的数量和功能，进而降低血压。这种效应是通过一氧化氮途径实现的。

2.4.3 Ca²⁺通道阻滞剂(CCBs) Ca²⁺通道阻滞剂是通过抑制L-型钙通道达到减少Ca²⁺内流的效应。它主要是作用于血管平滑肌，达到舒张血管的效应^[46]。在原发性高血压患者中，使用该Ca²⁺通道阻滞剂能提高内皮祖细胞数量和改善其功能。Ⅰ级高血压男性患者用硝苯地平治疗，发现能明显改善内皮祖细胞介导血管生成的相关功能并且提高其数量。使用硝苯地平后，内皮祖细胞相关生物学性状的改善能促进平滑肌释放血管内皮生长因子。这也表明硝苯地平治疗的内皮祖细胞能拮抗活性氧介导的氧化应激和细胞凋亡。此外，硝苯地平能改善内皮功能的主要原因是促进细胞增殖和血管生成。Chen等^[27]证实ACE2能通过调节eNOS和NOX信号通路来改善内皮祖细胞的功能。

2.4.4 他汀类药物 Liu等^[26]通过阿托他伐汀治疗肺心病患者，发现能促进内皮祖细胞迁移和黏附。研究表明，除了降压药物对内皮祖细胞数量和功能有影响之外，他汀类药物在一定程度能调控内皮祖细胞的生物学功能，这可能在修复血管、生成血管等方面起着重要的作用。

2.5 其他有氧运动已经被证明是一个非常重要的非药物治疗高血压方法。运动训练可以修复外周毛细血管功能，这是通过VEGF/eNOS依赖性的信号通路来实现的，并且能明显改善内皮祖细胞生成毛细血管^[47]。同样，Yang等^[48]证实规律的体育锻炼能增加循环内皮祖细胞的数量。经过3个月的定期运动，循环内皮祖细胞的数量和活性增加。Lavoie等^[49]表明基因修饰过的内皮祖细胞可用于治疗心血管疾病。以上研究表明，基因修饰和规律的锻炼能促进内皮祖细胞数量增加，改善内皮祖细胞功能，从而达到修复并生成血管以及再内皮化的效应。

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