髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 992-998.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.008

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髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向的分化

陈亮^1,2，李大鹏¹，黄永辉¹,²，刘侃²

1江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000
2宜兴市人民医院，江苏省宜兴市 214200

收稿日期:2012-09-09 修回日期:2012-11-14 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 黄永辉，硕士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000；宜兴市人民医院，江苏省宜兴市 214200
作者简介:陈亮★，男，1984年生，江苏省宜兴市人，汉族，2012年镇江医学院毕业，硕士，医师，主要从事组织工程学研究。 www.cl05107907962@163.com

Induced differentiation of nucleus pulposus cells from bone marrow mesenchymal stem cells

Chen Liang¹, ², Li Da-peng¹, Huang Yong-hui¹, ², Liu Kan²

1 Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
2 People’s Hospital of Yixing, Yixing 214200, Jiangsu Province, China

Received:2012-09-09 Revised:2012-11-14 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Huang Yong-hui, Master, Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China; People’s Hospital of Yixing, Yixing 214200, Jiangsu Province, China
About author:Chen Liang★, Master, Physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China; People’s Hospital of Yixing, Yixing 214200, Jiangsu Province, China www.cl05107907962@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外已有很多文献相继报道了用骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合植入材料来修复大鼠退变的腰椎间盘，但尚缺少对此复合物与正常髓核细胞之间的各项生物学指标的比较。
目的：在Transwell非接触共培养条件下，研究髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。
方法：全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定，取第3代骨髓间充质干细胞及髓核细胞复合藻酸盐接种于Transwell共培养系统中，上室接种骨髓间充质干细胞藻酸盐复合物，下室接种髓核细胞藻酸盐复合物，共培养7 d后回收上层骨髓间充质干细胞。
结果与结论：RT-PCR方法检测共培养组Ⅱ型胶原、Sox-9和多功能蛋白聚糖的mRNA表达均接近正常髓核细胞。说明共培养条件下髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向分化。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, sox9, 骨髓间充质干细胞, 藻酸盐, 髓核, RT-PCR, 椎间盘退变, Ⅱ型胶原, 多功能蛋白聚糖, Transwell共培养系统, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: There have been many reports addressing repair of degenerative lumbar intervertebral discs in rats using alginate compounded with bone marrow mesenchymal stem cells. However, there are few reports describing biological indices of this compounded material versus normal nucleus pulposus cells.
OBJECTIVE: To investigate the inducing effects of normal nucleus pulposus cells on bone marrow mesenchymal stem cells under Transwell non-contact co-culture condition.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured from the whole bone marrow and identified. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells and nucleus pulposus cells compounded onto alginate were inoculated into a Transwell co-culture system. Bone marrow mesenchymal stem cells compounded onto alginate were inoculated onto the upper layer, and nucleus pulposus cells compounded onto alginate were inoculated onto the lower layer. After 7 days of co-culture, bone marrow mesenchymal stem cells were retrieved from the upper layer.
RESULTS AND CONCLUSION: RT-PCR results showed that type Ⅱ collagen, Sox-9 and versian mRNA expression in the bone marrow mesenchymal stem cells + nucleus pulposus cells group was similar to that in the normal nucleus pulposus cells group. These findings suggest that after co-cultured with nucleus pulposus cells, bone marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into nucleus pulposus cells.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, sox9, bone marrow mesenchymal stem cells, alginate, nucleus pulposus, RT-PCR, intervertebral disc degeneration, type Ⅱ collagen, version, Transwell co-culture system, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

陈亮，李大鹏，黄永辉，刘侃. 髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞向髓核方向的分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 992-998.

Chen Liang, Li Da-peng, Huang Yong-hui, Liu Kan. Induced differentiation of nucleus pulposus cells from bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 992-998.

图/表（结果） 11

2.1 骨髓间充质干细胞大体形态学观察 倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞，1 d即贴壁，2 d时贴壁细胞较多。贴壁细胞继续培养3 d后开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等，但仍有较多杂质细胞，见图1。

待贴壁细胞达到80%-90%融合后，见图2，用胰酶消化按1∶2比例传代。当传至第3代时可见细胞密度均匀呈漩涡生长，见图3。

2.2 成骨成脂诱导形态学观察及鉴定 取第3代细胞传代后接种于6孔板中继续置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度37 ℃的培养箱中培养。倒置显微镜下观察待细胞90%融合，弃上清液，PBS反复冲洗3遍，加入成骨诱导培养基(每200 mL成骨诱导培养基含胎牛血清20 mL，谷氨酰胺2 mL，双抗2 mL，抗坏血酸400 μL，β-甘油磷酸钠2 mL，地塞米松20 μL)，2 d全量换液，倒置显微镜下观察细胞形态逐渐由梭形转化为三角形，多角形等，细胞外基质分泌也逐渐增多，胞质内外均可见黑色细小颗粒，胞核颜色较淡，胞浆色变深。3 d后逐渐形成多个散在的细胞结节，见图4。

10 d后vonkossa染色，可见细胞间出现致密的、圆形的不透光团块，呈现片状的棕染至黑染，着色区域范围广，面积大，呈现明显的阳性反应，见图5。

14 d后碱性磷酸酶染色，胞浆内呈深棕色/深黑色颗粒状或大片状黑色沉淀，见图6。成骨诱导21 d后运用茜素红进行钙化结节染色，可见有红色的致密结节出现，见图7。

取第3代细胞传代后接种于6孔板中继续置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度37 ℃的培养箱中培养。倒置显微镜下观察待细胞90%融合，弃上清液，PBS反复冲洗3遍，加入成脂肪诱导培养基A(每200 mL成脂肪诱导培养基A含胎牛血清20 mL，谷氨酰胺2 mL，双抗2 mL，胰岛素400 μL，IBMX 200 μL，吲哚美辛200 μL，地塞米松200 μL)，3 d后弃上清液，PBS冲洗1遍，加入成脂肪诱导培养基B(每200 mL成脂肪诱导培养基含胎牛血清20 mL，双抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，胰岛素400 μL)，1 d后弃上清液，再次加入成脂肪诱导培养基A，3 d后弃上清液加入成脂肪诱导培养基B，重复以上操作，倒置显微镜下观察细胞形态。逐渐由梭形变为圆形、椭圆形和多角形等，见图8。成脂诱导14 d后油红染色显示脂滴呈红色，见图9。

2.3 RT-PCR基因分析结果 见图10。

Ⅱ型胶原、Sox9、多功能蛋白聚糖在单纯骨髓间充质干细胞组未见表达。且共培养组(0.332 9±0.044 1，0.144 6±0.017 3，0.067 9± 0.012 6)接近或超过单纯髓核细胞组(0.267 6±0.032 4，0.226 7±0.082 4，0.063 0± 0.024 6)，

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引言

材料方法

设计：细胞形态学、RT-PCR实验。
时间及地点：实验于2010年10月至2011年10月在江苏大学临床医学院完成。
材料：
实验动物：2只SD大鼠用于分离培养骨髓间充质干细胞，雌性，体质量为80-100 g。40只SD大鼠用于分离培养髓核细胞，雌雄不限，体质量350-400 g，均由江苏大学动物房提供，
主要试剂与仪器：
Main experimental reagents and instruments:

实验方法：
骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定：运用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞^[4]。选取SD大鼠2只，超净台内取双侧股骨，手术剪去除股骨两端，暴露骨髓腔，用无菌注射器抽吸含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液冲出股骨骨髓于无菌培养皿内。在培养皿中轻轻吹打制成单细胞悬液接种于细胞培养瓶中，置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度37 ℃的培养箱中培养，24 h后半量换液，后每3 d全量换液，倒置显微镜下观察。细胞生长密度达90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养，培养至第3代经成骨成脂诱导鉴定。
髓核细胞的分离培养：在无菌超净工作台中，取出SD大鼠的髓核组织，用PBS冲洗3次去除血污。37 ℃下用0.25%胰蛋白酶消化组织20 min。800 r/min离心5 min，弃去上清液。36.5 ℃下用0.2%的Ⅱ型胶原酶静置消化4 h，至组织块逐渐消失。800 r/min离心5 min，去除上清液；用DMEM/F12培养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。用计数板进行细胞计数，按1×10⁷ L^-1与藻酸盐复合后接种于transwell 6孔板下层插槽中，共24孔。加入5 mL含青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL和体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞及髓核细胞藻酸盐复合物制备及transwell板共培养模型建立：制备1%藻酸钠水溶液(溶于0.15 mol/L的氯化钠中)，将骨髓间充质干细胞与藻酸钠溶液混合，至细胞浓度1×10⁷ L^-1。将细胞悬液滴加入CaCl₂溶液(102 mmol/L)，使藻酸钠聚合10 min，形成微珠^[5]，吸出多余胶凝液后接种于已种植髓核细胞的transwell 6孔板上层插槽中，下层为髓核细胞，细胞浓度同样为1×10⁷L^-1，作为骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养组。剩余2块已接种髓核细胞的transwell 6孔培养板作为单独髓核细胞组。另取2块transwell 6孔培养板，按1×10⁷ L^-1接种12孔骨髓间充质干细胞与藻酸纳复合微珠作为单独骨髓间充质干细胞组。加入5 mL含青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL和体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中各培养7 d。
骨髓间充质干细胞与髓核细胞的回收：超净台内取出transwell板上层插槽，将微珠倒入含柠檬酸钠和氯化钠的混合溶液(柠檬酸钠55 mmol/L，氯化钠0.15 mol/L，pH=6.5)的无菌培养皿内，37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中孵育15 min，微珠完全变为液体后吸出液体置于离心管，1 500×g离心5 min，弃上清液。
RT-PCR检测Ⅱ型胶原、sox9、多功能蛋白聚糖表达：RNA提取按Trizol说明书进行。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成提供。
GAPDH反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s， 60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 6 min；36个循环。
Ⅱ型胶原反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 6 min；36个循环。
sox9反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 6 min；36个循环。
多功能蛋白聚糖反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 6 min；36个循环。
聚合酶链反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。测定灰度值并与内参照GAPDH灰度值进行比较，计算其比值。
检测基因引物序列及目的片段长度：
Primer sequence and target fragment length of detected genes:

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞大体形态学观察。②成骨诱导形态学观察及鉴定。③成脂肪诱导形态学观察及鉴定。④RT-PCR方法检测Ⅱ型胶原、Sox-9和多功能蛋白聚糖的mRNA表达情况。

讨论

椎间盘退行性变的具体机制尚不十分清楚，其分子生物学改变为椎间盘细胞坏死、凋亡以及细胞外基质的合成减少；Ⅱ型胶原转化为Ⅰ型胶原、蛋白多糖减少和继发的水分丢失，导致椎间隙减小，椎间盘生物活性降低，最终纤维环破裂、椎间高度下降、周围组织增生、椎管狭窄、压迫神经，以致出现颈肩腰腿痛和下肢放射痛。而退变的始发因素有争议，但是始发于髓核是大多数研究者的观点。Gomes等^[6]发现同种异体髓核细胞移植可抑制椎间盘退变。于是椎间盘退变的细胞治疗也要集中在植入新细胞替代退变的髓核细胞或修复原有髓核细胞的功能上。

有研究报道体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化^[7-9]，而髓核细胞与软骨细胞类似，分泌的细胞外基质也相似。Sakai等^[9]报道诱导骨髓间充质干细胞分化并表达了类似髓核细胞的细胞表型。因此将骨髓间充质干细胞选择为替代髓核细胞的种子细胞。分离骨髓间充质干细胞的方法有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法等，但密度梯度分离法所得细胞活性较差，所以本实验采用贴壁细胞分离法分离骨髓间充质干细胞。通过形态学和多向分化潜能两种方法进行鉴定证实实验用细胞为骨髓间充质干细胞。

细胞复合材料可以为细胞生长提供一个三维结构。而三维结构不仅可以使营养物质自由交换^[10-11]，而且有利于细胞分泌各种因子浓度的保持^[12]。同时复合材料必须具备一定的支撑和防止细胞流失的作用。实验中采用的藻酸盐凝胶具有良好的组织相容性和可降解性，在细胞移植治疗等多个领域有很好的应用前景^[13-16]。文献报道骨髓间充质干细胞复合藻酸盐在体外培养时其细胞增殖和分化等生物活性均较强^[17]。而髓核细胞复合藻酸盐也有利于其分化。

体外构建的共培养系统必须具备与体内移植相类似的微环境。实验所用transwell共培养系统由美国Cornig公司制造^[18]，是一种新兴的实验技术，此项技术的特点在于运用一种特殊的共培养工具进行细胞共培养研究，探讨两种细胞的相互作用情况。其关键部分都在上下两室由一张有通透性的聚碳酸酯膜隔开，这层膜带有微孔，使得培养的两细胞不能相互接触，实现非接触性共培养。而体内退变髓核处于一个相对缺水的环境，干细胞复合载体移植入体内后在这种环境中与退变髓核实际也处于非接触状态，实验在体外很好的模拟了体内的微环境，其结果更接近实际临床研究。

蛋白聚糖在椎间盘组织承受力学负荷中起重要作用，其含量减少是椎间盘退变首先发生的改变。Ⅱ型胶原也是髓核组织产生重要功能的主要成分，退变髓核Ⅱ型胶原减少，Ⅰ型胶原增加。如何能够使再生的椎间盘产生有功能的蛋白聚糖和胶原蛋白是髓核组织工程学中非常重要的指标。本实验结果显示共培养组骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原和多功能蛋白聚糖的mRNA表达指标均接近或超过正常髓核细胞，初步证明了共培养后的骨髓间充质干细胞已经开始发挥正常髓核细胞的部分功能。

Sox9基因在软骨发育、成熟过程中对维持软骨细胞的表型及增强Ⅱ型胶原基因表达和促进Ⅱ型胶原合成增加的作用已十分明确^[19]，而同样以软骨样细胞为主的椎间盘组织中也存在Sox9基因的表达及调控。作者发现在本领域Sox9研究任然十分有限，将Sox9作为检测指标将更全面的探索骨髓间充质干细胞与多功能蛋白聚糖的关系。实验结果显示Sox9的mRNA表达指标已接近正常髓核细胞的表达水平。

目前针对骨髓间充质干细胞的诱导分化并用于体内椎间盘组织修复尚在实验阶段，髓核细胞与骨髓间充质干细胞的三维共同培养不但能更好的促进种子细胞向目的细胞分化，而且能模拟椎间盘内环境有利于今后的体内研究。下一步，将骨髓间充质干细胞植入退变椎间盘模型中进行研究，观察诱导后的细胞能否替代正常髓核细胞发挥功能，为组织工程细胞修复椎间盘退行性变的治疗提供更为有力的理论依据。

基金资助：镇江市科技计划(社会发展支撑)项目(SH2010031)；镇江市医学重点人才项目。
作者贡献：实验设计为李大鹏，实验实施为陈亮，实验评估为黄永辉，资料收集为陈亮。陈亮成文，黄永辉审校，陈亮对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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Induced differentiation of nucleus pulposus cells from bone marrow mesenchymal stem cells

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