构建组织工程化半月板：细胞、支架及生物因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体或异体移植修复损伤的半月板治疗效果并不理想，应用组织工程化技术重建半月板的研究成为目前的研究热点。
目的：探讨组织工程化技术修复重建损伤半月板的可行性。
方法：对体外构建组织工程化半月板的种子细胞进行培养，并制备半月板支架材料，将种子细胞依附于支架材料上，利用细胞因子调控种子细胞的黏附、生长、分化和迁移，组织学检查细胞与支架的结合情况以及细胞的数量等。
结果与结论：组织工程化半月板修复研究主要包括种子细胞、支架材料和细胞因子等方面。构建需要的种子细胞有骨髓间充质干细胞和半月板纤维软骨细胞，半月板纤维软骨细胞传至第3代可得出最佳效应浓度。对组织工程化半月板支架材料进行表面修饰，由多材料组成的复合材料具有更好的生物相容性。应用组织工程化技术修复重建损伤的半月板，是今后半月板损伤修复研究一种新的治疗方法。

关键词: 组织构建, 组织构建学术探讨, 半月板, 细胞因子, 纤维蛋白, 胶原, 聚乳酸, 聚羟基乙酸, 骨髓间充质干细胞, 半月板纤维软骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: The effect of autologous or allogeneic transplantation in the repair of damaged meniscus is not ideal, so the application of tissue engineering technology in meniscus reconstruction has become the research focus.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of tissue engineering technology for repair and reconstruct damaged meniscus.
METHODS: The seed cells used for in vitro construction of tissue engineering meniscus were cultured, and the meniscal scaffold materials were prepared, then the seed cells were attached on the scaffold materials, and the cytokine was used to regulate the adhesion, growth, differentiation and migration of seed cells. Histological examination was performed to observe the binding between cells and scaffolds, as well as the number of the cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The research of tissue-engineered meniscal repair included seed cells, scaffold materials and cytokines. The seed cells were constructed, including bone marrow mesenchymal stem cells and meniscal fibrocartilage cells, and the best effect concentration could be obtained after the meniscal fibrocartilage cells passaged to the third generation. Surface modification of tissue-engineered meniscus scaffold materials was performed, and the multi-material composed composite materials have better biocompatibility. The repair and construction of damaged meniscus with tissue engineering technology is the new treatment mode for repair of meniscus damage.

Key words: tissue construction, tissue construction academic discussion, meniscus, cytokines, fibrin, collagen, polylactic acid, polyglycolic acid, bone marrow mesenchymal stem cells, meniscal fibrocartilage cells

中图分类号:

R318

覃荣周. 构建组织工程化半月板：细胞、支架及生物因子[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3764-3769.

Qin Rong-zhou. Construction of tissue-engineered meniscus: Cells, stents and biological factors [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3764-3769.

图/表（结果） 1

2.1 组织工程化半月板的种子细胞来源 半月板的结构属于纤维软骨，有别于一般的关节透明软骨，主要由纤维软骨细胞、基质和胶原构成，在生物学性质上有其特殊性。目前，组织工程化半月板种子细胞的主要来源有半月板纤维软骨细胞和骨髓间充质干细胞。

半月板纤维软骨细胞：叶川等^[23]研究有胚半月板细胞的优化获取及生物学特性，在胰酶消化的基础上采用胶原酶阶段消化法消化解离8个月人胚半月板中的纤维软骨细胞，并与胶原酶一次消化法所得的细胞进行对比，同时进行原代培养和传代培养，观察细胞存活率、生长曲线、形态学改变、细胞周期并进行酸性糖胺多糖染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定。胶原酶阶段消化法所得细胞的存活率高于一次消化法；原代细胞贴壁时间和潜伏期较传代细胞长；半月板纤维软骨细胞在体外培养至第4代时会发生去分化现象。半月板采用胶原酶阶段消化法可减少酶对细胞的毒性，得到细胞活力较高的纤维软骨细胞，原代细胞贴壁时间和潜伏期较长，第二三代细胞适于作为组织工程用种子细胞。

骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞具有繁殖能力强的特点，可在体外培养30代以上，而且取材方便。解大龙等^[24]对半月板软骨进行脱细胞处理，制备猪脱细胞半月板支架，并与传至第3代的骨髓基质干细胞进行培养。干细胞无血清培养液出现1条负染条带，即基质金属蛋白酶2带，证明培养的骨髓基质干细胞有侵袭性，可以与支架材料结合和生长良好。苏木精伊红染色见脱细胞半月板软骨内无细胞成分，基质间空隙较大，相互连接成网状结构。改良MASSON法染色见脱细胞后半月板软骨基质为绿染，证明留存有大量胶原。电镜下见脱细胞半月板软骨支架的孔隙大，孔隙壁不光滑，孔隙直径20-200 μm，孔隙率为80%以上，且孔隙和孔隙之间相互连通，形成三维网架结构。半月板支架与骨髓基质干细胞结合良好，且伸出伪足，分泌蛋白。徐青镭等^[25]将已分离并经体外传代培养扩增的兔骨髓间充质干细胞在用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1协同刺激后，用逆转录-聚合酶链式反应的方法探明有pC-I的编码基因表达，证明其已经进入软骨细胞分化谱系。碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1协同刺激骨髓间充质干细胞的体外增殖，并且使其进入软骨细胞分化谱系，为半月板组织工程重建提供可靠的自体来源种子细胞。

2.2 组织工程化半月板的支架材料来源 半月板支架材料是组织工程化半月板研究的基本要素，也是目前研究的热点问题。其中包括天然生物材料、人工合成生物材料和复合生物材料的研究，近年来组织工程化半月板支架材料的研究取得了可喜的进展，胶原半月板移植物已经开始应用于临床，由于含水量高，结构与体内细胞外基质类似，具有良好的生物相容性。同时，复合支架材料也是组织工程半月板支架材料研究的重点。

天然生物材料：骨膜、软骨膜、小肠黏膜下层、异体半月板组织等，以及分离合成的天然支架材料如胶原、纤维蛋白等，都是组织工程化半月板的天然材料。

小肠黏膜下层是天然的细胞外基质材料，同时自身含有多种生长因子，对组织修复重建和细胞生长有重要作用，生物相容性良好，目前已用于构建多种组织工程支架材料，如血管、神经、骨、软骨、肌腱、韧带等组织。赵玉鑫等^[26]研究小肠黏膜下层作为组织工程化半月板支架材料的可行性，将猪的小肠通过物理的方法处理后，在100 mmol/L乙二胺四乙酸和 10 mmol/L氢氧化钠浓度中浸泡6-8 h，去离子水冲洗后置于1 mmol/L盐酸和1 mmol/L氯化钠溶液中浸泡6-8 h，冲洗后在 1 mmol/L氯化钠磷酸盐缓冲液中浸泡16 h，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中浸泡 2 h，去离子水冲洗基质2 h，含1 g/L过氧乙酸的体积分数为0.2的乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.5 g/L 过氧化钠的磷酸盐缓冲液清洗 2 h，程序性降温到-80 ℃，冻干后真空包装，γ射线辐照。将小肠黏膜下层在体外复合传至第3代的半月板纤维软骨细胞，在复合培养第1-4天观察细胞增殖不明显，第5天有较多细胞直接贴附于材料边缘，第7天有大量细胞向材料边缘聚集，细胞形态多为梭形或多角形，连成一片。半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合培养7 d可见细胞间通过突起相互连接附着在材料表面，细胞在小肠黏膜下层支架材料上生长、黏附、增殖良好，并分泌大量的细胞外基质成分。

人工合成材料：由于人工合成支架材料的几何形态、孔架结构、机械力学性能和力学强度等是可以调节至合适的大小，目前常用的人工合成材料有聚乳酸、聚羟基乙酸以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

外消旋聚丙交酯是聚乳酸同分异构体的一种，通过水解氧化参与三羧酸循环，降解为二氧化碳和水。叶川等^[27]应用外消旋聚丙交酯作为组织工程化半月板的支架材料，采用胶原酶阶段消化法获取人胚半月板纤维软骨细胞，碱性成纤维细胞生长因子作用于第3代细胞，并用四唑盐比色法得出最佳效应浓度，扩增后的细胞种植于多聚赖氨酸修饰前、后的外消旋聚丙交酯上，观察外消旋聚丙交酯的亲水性、细胞吸附性和细胞增殖情况。碱性成纤维细胞生长因子扩增人胚半月板细胞的最佳效应浓度为50 μg/L(P < 0.05)；外消旋聚丙交酯亲水性及细胞吸附性欠佳，予多聚赖氨酸修饰后明显改善，细胞在外消旋聚丙交酯上生长良好，3周时已有大量细胞生长。50 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子可用于体外大量扩增人胚半月板细胞，外消旋聚丙交酯经多聚赖氨酸修饰后可表现出良好的亲水性、细胞吸附性和体外生物相容性，可作为半月板组织工程细胞培养支架材料应用。

复合材料：胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯是聚羟基丁酸与羟基戊酸的共聚物，聚羟基丁酸是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能量储存而合成的热塑性聚酯，聚羟基丁酸具有良好的机械性能和组织相容性，而且由生物合成，无毒副作用，同时还具有质轻、耐腐蚀、可塑性强、生物可降解等优良特性。聚羟基丁酸通过与羟基戊酸形成共聚物聚羟基丁酸羟基戊酸酯，随着羟基戊酸比例的增高，聚羟基丁酸羟基戊酸酯的强度和韧性得以提高，而且更易被降解。卢华定等^[28]观察Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯对半月板纤维软骨细胞的吸附作用，评价其作为组织工程化半月板支架材料的可行性。制备Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯组织工程化半月板假体，体外分离培养兔半月板纤维软骨细胞，将培养的半月板纤维软骨细胞接种于Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯支架。聚羟基丁酸羟基戊酸酯能制成具有一定力学强度的半月板假体，通过Ⅰ型胶原涂层后增强了其细胞吸附能力，半月板纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯支架细胞相容性良好，能按半月板的大小、形状制成有一定力学强度的半月板假体，是比较理想的半月板组织工程支架材料。

最近在组织工程化半月板支架材料的结构研究中发现，可以通过三维纤维沉积技术来改变支架结构、孔隙率和共聚体的沉积，这样的支架材料可以更好模拟组织的生物力学性能。随着分子生物学与生物材料学的发展，更多的半月板支架材料会不断被研发出来，可以促进组织工程化半月板早日应用于临床。

2.3 构建组织工程化半月板细胞因子的作用

转化生长因子β1：可以起到调节细胞生长和分化的作用。刘和风等^[29]研究蚕丝蛋白纤维(丝素)-胶原复合半月板支架作为兔纤维软骨细胞组织工程支架的可行性，将体外培养扩增的兔半月板纤维软骨细胞接种于该支架上，加入转化生长因子β1三维立体培养，丝素-胶原复合物能制成理想形状和大小的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞能良好的贴附于支架孔壁上。

碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1：叶川等^[20]研究碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1单独或联合作用于人胚半月板细胞，探讨组织工程化半月板种子细胞大量扩增最佳作用组合及浓度。体外分离培养半月板纤维软骨细胞，用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Aggrecan免疫荧光染色检测其性状。取第3代细胞贴壁后使用血清饥饿法同步化细胞，加入3种细胞因子作用于半月板细胞，每样本设8个复孔和阴性对照组，作用48，72 h采用四唑盐比色法检测软骨细胞增殖情况。同法设定7个组，每组8个复孔，分别为阴性对照组、碱性成纤维细胞生长因子最佳效应浓度组(50 μg/L)、转化生长因子β1最佳效应浓度组(5 μg/L)、胰岛素样生长因子1最佳效应浓度组 (50 μg/L)、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1最佳效应浓度联用组、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1最佳效应浓度联用组、转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1最佳效应浓度联用组，48，72 h用四唑盐比色法得出吸光度(A)值并分析软骨细胞的增殖效应。3种细胞因子最佳效应浓度单纯及联合运用对人胚半月板细胞增殖的比较，见表2。

碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1单独使用均可体外扩增人胚半月板细胞。最佳效应浓度联用时，胰岛素样生长因子1/碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1/转化生长因子β1的扩增效果优于各自单独使用，可用于体外大量扩增种子细胞。

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引言

半月板是2个月牙形的纤维软骨，由水和胶原等有机物质组成^[1]，位于胫骨平台内侧和外侧的关节面。其横断面呈三角形，外厚内薄，上面稍呈凹形，以便与股骨髁相吻合，下面为平的，与胫骨平台相接。这样的结构恰好使股骨髁在胫骨平台上形成一较深的凹陷，从而使球形的股骨髁与胫骨平台的稳定性增加，起到传递负荷、吸收冲击、协调膝关节运动等作用。

半月板损伤在体育运动过程中比较常见，好发于青壮年，多伴有外伤史，行走时膝关节疼痛，一部分患者会有交锁症状关节线处有压痛，压痛点会转移，麦氏试验阳性^[2]。磁共振检查对半月板损伤诊断具有特异性和灵敏性，此外，关节镜检查可以准确判断半月板损伤的部位、程度和类型，选择不同的治疗方案。传统的修复方法包括部分切除半月板、全部切除半月板和半月板修复治疗等，可以较快恢复患者的运动功能，短期效果良好，但长期效果不能得到保证，因此，在治疗时尽可能的修复或保留半月板。

利用组织工程化技术修复和重建损伤的半月板研究已成为国内外学者们的研究热点^[3-5]。组织工程化半月板研究主要有半月板种子细胞和支架材料两方面。组织工程化半月板的种子细胞常用骨髓间充质干细胞、半月板纤维软骨细胞、多能纤维细胞等^[6]。种子细胞依附于基质不仅是形态上与基质结合，还要建立起细胞功能代谢和分化的基本调节。理想的种子细胞必须具备取材方便，来源充足，体外有较强的繁殖和定向分化能力，能持续保持细胞表型不变，能适应材料和受区环境，植入体内后能高质量的修复半月板缺损，并能方便通过分子生物学技术进行基因修饰^[7-8]。

组织工程化半月板的支架材料对细胞要起到支撑作用，同时还要起到模板作用，引导组织再生和控制结构。支架材料分为天然生物材料、人工合成材料和复合材料^[9-16]。组织工程化半月板支架材料应具备高孔隙率和高表面积，孔隙率在90%以上，具有良好的生物相容性和可降解性，支架材料表面结构有助于细胞的黏附、增殖和分化，有足够的机械力和强度，支架材料与人体接触无毒性，易塑形和重复操作，具有一定的生物活

性，对环境的刺激能够做出反应，控制种子细胞黏附、分化和增殖等，并最终替代半月

板的功能^[17-19]。

细胞因子在组织工程化半月板修复重建的过程中起到积极的促进作用^[20]，主要的细胞因子有成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子等。研究证实，碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β以及血小板衍生生长因子AB可以促进半月板纤维软骨细胞的增殖，而且转化生长因子α和血小板衍生生长因子AB可以增加半月板胶原和非胶原蛋白的合成。

移植组织工程化半月板不仅可以恢复半月板的形态结构、切除后关节的生物力学平衡，还可以降低骨关节炎的发生率，提高移植的成功率。体外通过组织工程支架构建组织工程化半月板，并利用细胞因子调控种子细胞的生长、分化和迁移，可以为无法保留半月板的患者提供新的治疗方法。

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

半月板损伤发病机制：
半月板的损伤通常是由于膝关节部分屈曲负重状态下突发强力的旋转所致。屈膝状态下股骨髁在胫骨平台强力旋转过程中迫使内侧半月板向后及关节中央移动，当半月板后方周边附着被拉长或撕裂，半月板的后方即被挤向关节中央，嵌在股骨与胫骨之间。此时关节突然地伸直，即造成半月板的纵型撕裂。Smillie认为同样的机理也可造成外侧半月板后缘及纵裂。但由于外侧半月板的移动度大和结构的关系不易形成桶柄裂。然而，由于外侧半月板弧度较大，不附着于外侧副韧带和受其控制，故外侧半月板不完全横裂的发生率大于内侧半月板。

辅助检查：
特殊检查进展：MRI因其对软组织分辨能力高、可显示半月板内部结构、多方位成像和无创伤性，已成为诊断半月板损伤的重要手段。根据MRI信号改变，半月板损伤分为Ⅰ-Ⅲ级。半月板损伤的关节镜下分级目前尚缺乏统一标准。

半月板Ⅰ级损伤：组织学改变为软骨细胞的丢失和粘液样变化，MRI上表现为在半月板内出现点状或小结节状高信号。Ⅰ级信号也可以在无症状的运动员和正常志愿者中见到，提示半月板有轻度损伤。关节镜下半月板形态正常，有时表现为内侧缘毛糙、退变，少数也可正常，而半月板股骨面、胫骨面和外侧缘无明显异常。

半月板Ⅱ级损伤：组织学改变为半月板粘液样或透明性改变加重，MRI上表现为半月板内部出现水平或斜形条状高信号，未达到半月板的关节面，有时可延伸到半月板的关节囊边缘，有发展为前后角破裂的倾向，此型易误诊为Ⅲ度损伤，尤其是内侧半月板后角。关节镜下半月板形态基本正常，多表现为内侧缘和股骨面毛糙、退变加重，或表面呈局灶性“发白”镜像，而半月板胫骨面和外侧缘无明显异常，有时也可出现毛糙、纤维样退变镜像。探钩触之无裂口，退变软骨柔软、硬度下降。

半月板Ⅲ级损伤：组织学改变为半月板已发生纤维软骨板的破裂，关节滑液渗入撕裂的半月板内导致信号增高。Ⅲ级损伤信号为条状或复杂形态高信号，并延伸至半月板表面。根据其形态不同分为两种类型：①A型：高信号线呈线状；②B型：高信号线呈不规则。关节镜下见半月板呈完全盘状10个，表现为半月软骨覆盖整个胫骨关节面，内侧缘钝厚；不完全盘状6个，表现为半月板呈正常附着，但较正常半月板宽大，半月板与胫骨面比例大于1∶3。