软骨细胞膜片的成软骨性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (12): 1843-1848.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.007

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软骨细胞膜片的成软骨性能

周丽斌，吴玮，丁瑞英，徐冰心，韩浩伦，王刚，李保卫，王鸿南

解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科，北京市 100101

收稿日期:2016-12-22 出版日期:2017-04-28 发布日期:2017-05-16
通讯作者: 吴玮，解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科，北京市 100101
作者简介:周丽斌，男，1982年生，江西省余江县人，汉族，2011年解放军第四军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事软骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(81401609)

Chondrogenesis of chondrocyte cell sheets

Zhou Li-bin, Wu Wei, Ding Rui-ying, Xu Bing-xin, Han Hao-lun, Wang Gang, Li Bao-wei, Wang Hong-nan

Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

Received:2016-12-22 Online:2017-04-28 Published:2017-05-16
Contact: Wu Wei, Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China
About author:Zhou Li-bin, M.D., Attending physician, Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81401609

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞膜片：细胞膜片技术是通过物理的方法将扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。
组织工程：从机体获取少量的活体组织细胞，在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

摘要
背景：基于温敏培养皿的细胞膜片技术在组织工程研究中受到越来越多的关注，但是温敏培养皿价格高昂，有必要研究替代方法。
目的：应用普通培养皿进行细胞膜片培养，并分析软骨细胞膜片的成软骨性能。
方法：取1例鼻中隔偏曲患者手术切除的鼻中隔软骨消化提取原代软骨细胞，扩增培养。取第3代细胞在体外密集培养，使之分泌细胞外基质，形成单层细胞膜片；另取第2代软骨细胞，叠加接种于单层细胞膜片上，使其贴覆生长，形成双层细胞膜片。应用细胞刮刀收获细胞膜片，研究其性状，进一步在体外培养、植入裸鼠体内构建出人工软骨块。
结果与结论：①单层细胞膜片和双层细胞膜片均形成质软的凝胶样结构，大体观察两者无明显区别；②新刮起的细胞膜片具有良好的可流动性和成胶性；植入裸鼠体内培育8周之后，均形成成熟的软骨块；③组织学观察见细胞膜片是由成层排列的软骨细胞和细胞外基质组成的薄片，在体外培养过程中即有糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的初步表达，植入体内8周之后形成的软骨呈现为成熟的软骨组织；④生化定量检测结果表明，DNA含量高于天然鼻中隔软骨，而糖胺聚糖和羟基脯氨酸含量与天然软骨差异无显著性意义；⑤结果提示，应用普通培养皿可成功构建并获取细胞膜片，细胞膜片呈现良好的成软骨性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6339-3441(吴玮)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 细胞膜片, 软骨, 培养, 普通培养皿, 糖胺聚糖, Ⅱ型胶原, 成软骨性能, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The cell-sheet technology, based on a temperature-responsive culture, has been drawing more and more attention; however, the temperature-responsive culture dish is quite expensive. Therefore, it is imperative to develop a substitutive technique.
OBJECTIVE: To study the feasibility of cell-sheet culturing using common culture dish, and investigate the chondrogenesis of the cell sheet.
METHODS: A piece of nasal septal cartilage was adopted from a patient with deviation of nasal septum to extract primary chondrocytes that were then cultured and amplified. The passage 3 chondrocytes were used to construct cell sheets. Monolayer cell sheet was formed by intensive culturing and allowing the extracellular matrix secretion. Bilayer cell sheet was constructed by seeding passage 2 chondrocytes on the monolayer cell sheet. The cell sheets were harvested using cell scraper, their properties were investigated prior to implantation into nude mice to construct the tissue-engineered cartilage.
RESULTS AND CONCLUSION: Both bilayer and monolayer cell sheets with soft tremellose structures showed no significant difference through naked eyes. The newly harvested cell sheets appeared to have good fluidity and gelation. Eight weeks after implantation into the nude mice, mature cartilage blocks were obtained. Histologically, the cell sheets were thin films composed by layered chondrocytes and extracellular matrix. Glycosaminoglycan formation and type II collagen expressions were observed in the cell sheets cultured in vitro. The explanted samples exhibited mature cartilaginous tissue at 8 weeks after implantation. Biochemical analysis showed that the DNA contents of the neocartilages were higher than those of native human costal cartilage, while the contents of glycosaminoglycan and hydroxyproline were similar to native human nasal septal cartilage. To conclude, the chondrocyte cell sheets are likely to be constructed and harvested successfully using common culture dish, and the cell sheets exhibit favourable chondrogenesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cartilage, Culture Techniques, Collage Type II, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周丽斌，吴玮，丁瑞英，徐冰心，韩浩伦，王刚，李保卫，王鸿南. 软骨细胞膜片的成软骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1843-1848.

Zhou Li-bin, Wu Wei, Ding Rui-ying, Xu Bing-xin, Han Hao-lun, Wang Gang, Li Bao-wei, Wang Hong-nan. Chondrogenesis of chondrocyte cell sheets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1843-1848.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析细胞膜片植入手术过程顺利。在8周的术后观察周期内，8只裸鼠有2只意外死亡(裸鼠免疫系统缺陷，分析可能死因为全身感染)，其余6只健康存活至8周时取材。

2.2 软骨细胞及细胞膜片原代软骨细胞提取过程中，每克鼻中隔软骨可以提取获得2×10⁶软骨细胞。在体外培养过程中，在达到汇合状态后，鼻中隔软骨细胞开始大量分泌细胞外基质。单层细胞膜片和双层细胞膜片均形成质软的凝胶样结构，肉眼观察两者无明显区别。新刮起的细胞膜片具有良好的可流动性和成胶性。倒置显微镜下可见细胞膜片内细胞密集排列。组织学观察可见细胞膜片是由成层排列的软骨细胞和细胞外基质组成的薄片(图2)。

2.3 体外培养及体内培养细胞膜片刮起后，在培养皿中持续培养12 d后，细胞膜片逐渐皱缩，形成凝胶状的软骨样组织。此时的细胞膜片具有一定的可操作性，可以用镊子夹持(图1C)，但是不具备特定形态(图3)。尽管皱缩后的组织流动性降低，但是仍呈现为质软易碎的胶质结构。组织学观察到标本内由折叠的细胞膜片组成，折叠后的细胞膜片增厚，由于细胞外基质的进一步分泌，相互接触的膜片之间逐渐融合。甲苯胺蓝染色检测到细胞外基质中的软骨基质成分(图4)。免疫组化染色显示体外培养中的细胞膜片的细胞外基质中Ⅱ型胶原的表达(图4)。

植入裸鼠体内培育8周之后，形成成熟的软骨块(图3)。取材时，人工软骨被纤维组织包裹，这层组织囊可以通过剥离而被轻易去除。大体观察，应用细胞膜片构建的软骨块质地中等，富有弹性，与天然人鼻中隔软骨无明显差异。肉眼观察，单层细胞膜片和双层细胞膜片构建出的软骨块无明显体积及质地上的差异。

2.4 组织形态学及免疫组织化学形态学观察发现，单层细胞膜片和双层细胞膜片构建出的人工软骨结构基本相同。软骨细胞位于软骨陷窝之中，软骨陷窝在组织中分布均匀，但较天然软骨更为密集。甲苯胺蓝染色证明人工软骨基质中糖胺聚糖含量丰富，免疫组化染色证明，II型胶原强阳性表达(图5)。

2.5 生物化学定量分析 DNA含量检测结果表明，单层细胞膜片和双层细胞膜片构建出的人工软骨中，每克组织中的DNA含量差异无显著性意义，但均高于人体天然鼻中隔软骨，说明人工软骨组织中单位体积内含有的软骨细胞数量更多(表1)。糖胺聚糖含量检测结果表明，两种细胞膜片构建的人工软骨糖胺聚糖含量差别不大，与人体天然鼻中隔软骨中的含量差异亦无显著性意义(表1)。羟基脯氨酸含量检测结果表明，两种细胞膜片构建的人工软骨羟基脯氨酸含量差别不大，与人体天然鼻中隔软骨中的含量差异亦无显著性意义(表1)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点于2014年12月至2016年1月在解放军第306医院特种医学实验研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验材料取解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科收治1例鼻中隔偏曲患者手术切除的鼻中隔软骨。患者男性，25岁，无系统性疾病史，各项入院常规检查、化验无明显异常。术前获得患者签字授权，同意将手术切除标本用于实验研究。

1.3.2 实验动物 8周龄雌性BALB/c裸鼠8只，体质量18-25 g (北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物饲养于北京大学实验动物科学部SPF级动物中心，动物饲养及实验有创操作执行北大医学部实验动物研究相关标准。本课题获得解放军第306医院伦理委员会审批同意。

1.3.3 实验试剂 Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)，青、链霉素200 mg/L(北京索莱宝科技有限公司)，Ham’s F-12溶液(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)，谷氨酰胺300 mg/L(美国Sigma-Aldrich公司)，L-抗坏血酸50 mg/L(美国Sigma-Aldrich公司)，trypsin-EDTA(美国Sigma-Aldrich公司)，盐酸赛拉嗪注射液(陆眠宁Ⅱ，吉林省华牧兽药)，兔源Ⅱ型胶原抗体(ab34712，Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，蛋白酶K(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人鼻中隔软骨细胞的分离和体外培养将鼻中隔软骨用PBS(含青霉素200 U/mL，链霉素200 mg/L)漂洗3次，用无菌刀片切碎至1 mm³大小，将软骨碎片置于10 mL离心管中，加入10 mL含0.2%Ⅱ型胶原酶及青霉素200 U/mL、链霉素200 mg/L的Ham’s F-12溶液，置于37 ℃恒温震荡器内隔夜消化约14 h，200目不锈钢丝细胞筛过滤，去除未完全消化的软骨碎片，离心，沉淀细胞用PBS洗涤2次，用含

体积分数10%胎牛血清，谷氨酰胺300 mg/L，L-抗坏血酸50 mg/L，青、链霉素各100 U/mL的Ham’s F-12培养液制成原代软骨细胞悬液，应用锥虫蓝染色检查软骨细胞活力，以1×10⁴/cm²的浓度接种于细胞培养皿。置于CO₂细胞培养箱中培养，每隔2 d换液1次。

每日倒置显微镜下观察细胞的生长情况，细胞增殖达到大于80%的汇合状态时，0.25% trypsin-EDTA消化，以1∶4比例进行细胞传代。

1.4.2 单层细胞膜片构建以第3代软骨细胞进行细胞膜片构建，连续培养待细胞达到100%汇合状态后，继续培养2周，可见培养皿底出现乳白色薄膜样物质。用细胞刮刀刮取部分膜片，经中性甲醛固定、梯度乙醇系列脱水、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色，免疫组织化学染色(Ⅱ型胶原)分析其组织学构成。

1.4.3 双层细胞膜片构建单层细胞膜片培养2周后，取第2代软骨细胞，以5×10⁴ /cm²的浓度叠加接种与单层细胞膜片上方，使细胞继续贴覆生长，连续培养2周，形成双层细胞膜片结构。用细胞刮刀刮取部分膜片留作组织学及免疫组化分析。

1.4.4 细胞膜片的收获细胞膜片的收获需采用细胞刮刀。用无菌细胞刮刀从皿底的边缘开始，由外而内小心刮起细胞膜片。刮起过程中，细胞膜片较为脆弱，容易出现破损，但是，小心的操作和积累一定的经验后，可以收获得到完整的软骨细胞膜片。新鲜刮起的细胞膜片质地柔软，可悬浮于培养液中，刮起后的细胞膜片容易发生皱缩。细胞膜片刮起后，置于新鲜的软骨细胞培养液中，继续培养，软骨细胞膜片发生团缩(图1)。

1.4.5 体内培育人工软骨将体外培养2周的单层细胞膜片和培养4周的双层细胞膜片分别植入BALB/c裸鼠。单双层膜片各16张，在每只裸鼠的左右背部制作4个皮下组织袋，各袋内植入一张单层或双层细胞膜片形成的软骨样结构。动物麻醉采用盐酸赛拉嗪注射液0.5 mL/kg。动物麻醉后，用碘伏擦拭消毒裸鼠背部，用剪刀剪开侧背部皮肤，长约0.5 cm，用止血钳沿皮下钝性剥离，形成皮下组织袋，将细胞膜片团块置入袋内，拉拢缝合伤口。术毕。术后给予正常饮食，不限制活动，连续观察8周。

体内培养8周后，注射过量盐酸赛拉嗪注射液，处死动物后取材。将标本与周围包裹软组织剥离，将每个标本分为两部分，其一用作组织学分析，在中性甲醛中固定24 h以上，然后用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制作5 μm厚的切片，行苏木精-伊红染色，软骨细胞外基质的分析采用甲苯胺蓝染色。另一半存于-80 ℃，备用于生化检测。

1.4.6 组织形态学分析 ①甲苯胺蓝染色方法：切片用二甲苯及梯度乙醇中脱蜡水化，在甲苯胺蓝染液(存储液：甲苯胺蓝0.1 g溶于100 mL体积分数75%乙醇；②工作溶液：将存储液用1%氯化钠溶液稀释10倍)中染色3 min，水洗3遍，在95%和2遍100%乙醇中快速脱水，两遍二甲苯中透明，封固。

1.4.7 免疫组织化学分析切片在60 ℃烘箱中加热45 min，然后在二甲苯及梯度乙醇中脱蜡水化，用热修复方法修复抗原，在95-100 ℃的浓度10 mmol/L、pH值6.0的枸橼酸钠溶液中热处理20 min，抗原封闭采用体积分数5%山羊血清室温处理30 min。随后用封闭液以1∶100比例稀释后的兔源Ⅱ型胶原抗体室温孵化45 min，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)室温孵化30 min，用二氨基联苯DAB显色，苏木精复染细胞核。

1.4.8 生化分析冷冻标本用于定量分析DNA和细胞外基质含量。将标本再分为2份，其中一份切碎后用10%蛋白酶K 56 ℃消化过夜，用Qiagen DNeasy试剂盒提取并纯化DNA，DNA含量分析应用Picogreen dsDNA法。

另一份用于分析细胞外基质成分。低温冻干后称质量，用木瓜蛋白酶(含125 g/L木瓜蛋白酶，10 mmol/L L-半胱氨酸和10 mmol/L EDTA，pH 6.3，美国Sigma-Aldrich公司)60 ℃消化16 h。消化液用于行糖胺聚糖和羟基脯氨酸含量。糖胺聚糖含量采用应用二甲基亚甲基蓝染色后分光光度计测量，以硫酸软骨素作为标准液。羟基脯氨酸含量的测量采用Stegemann羟基脯氨酸测定法。

正常人鼻中隔软骨被用于消化提取并生化分析DNA和细胞外基质含量，作为正常对照。方法同上。

1.5 主要观察指标 ①DNA含量：反映人工构建软骨中软骨细胞的密度；②糖胺聚糖和羟基脯氨酸含量：单位质量软骨组织中软骨基质的含量，反映人工软骨软骨基质分泌情况；③通过与天然鼻中隔软骨比较，评价人工软骨的性能。

1.6 统计学分析生化检测结果采用x(_)±s表示，数据统计采用SPSS 17.0软件。均数间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey HSD法进行多重比较。P < 0.05视为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

经典的组织工程中，支架材料和种子细胞一样，是必需的关键因素。经历了二三十年的探索，已有诸多生物材料被用于软骨组织工程研究，然而，每种材料，不论是人工合成的高分子材料，或者天然的纤维材料，均存在或多或少的缺陷^[26-30]，不能完全满足软骨组织工程的要求，导致构建出的人工软骨组织与天然软骨在形态和性能方面差距较大。近年来发展成熟的基于温敏培养皿的细胞膜片技术，使无支架组织工程技术也受到越来越多的关注，也让科学家们重新开始认识支架材料是否真的是必不可少的^[31-33]。

但聚N-异丙基丙烯酰胺涂层的温敏培养皿价格昂贵，大规模应用研究成本巨大。相较于温敏培养皿细胞膜片技术，本研究中的细胞膜片构建方法成本低廉，操作简便。本实验中，仅采用常规的细胞培养皿进行软骨细胞的增殖培养，应用细胞刮刀收获细胞膜片。体内、外实验均证明，这种新的软骨细胞膜片构建方法的可行性，构建形成的软骨组织接近天然软骨。而且，本研究结果验证了在单层细胞膜片上叠加接种软骨细胞构建双层、甚或多层细胞膜片是可行的。本实验中在软骨细胞培养达到汇合状态后，继续持续培养2周，以允许细胞分泌更多的细胞外基质。从而允许细胞膜片能够经受细胞刮刀的剪切力作用，而被整体刮起。

经典软骨组织工程采用离散的软骨细胞或干细胞接种于支架材料上^[34-36]，而细胞膜片技术与之不同，细胞膜片保存了细胞-细胞连接和细胞外基质中的蛋白质成分，使组织的形成更加接近自然的组织发育过程^[37-38]。和细胞注射疗法相比，细胞膜片可以提供三维的组织生长环境，并可以避免注射后的细胞流失^[39]。菲薄的软骨膜片可以用于修复软骨缺损，例如关节软骨表面的软骨缺损^[40]。初级软骨细胞膜片具有良好的流动性，因此也可以用于注射。将细胞膜片剪碎后，通过注射方法将细胞膜片置于缺损部位，修复缺损。因为细胞膜片技术没有辅助构建立体形态的支架材料，因而仅仅采用细胞膜片难以构建特定形态的组织或器官，不过这种缺憾可以通过借助水凝胶和制模技术予以解决。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

软骨细胞膜片的成软骨性能

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[3]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[4]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[5]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[6]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[7]	张键, 林坚平, 周钢, 方业汉, 王本超, 吴永昌. MRI半定量评估早期膝骨关节炎软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 425-429.
[8]	关鸿, 张宏博, 邵焱, 郭栋, 张海严, 蔡道章. PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 182-189.
[9]	黄波, 陈明学, 彭礼庆, 罗旭江, 李获, 王皓, 田沁玉, 鲁晓波, 刘舒云, 郭全义. 可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2600-2606.
[10]	朱春晖, 张宜, 宋黄鹤, 梁文卫. 虾青素对叔丁基过氧化氢诱导软骨细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1648-1655.
[11]	于栋, 刘侃, 时宗庭, 杨骁侠, 刘恒平, 张清烽. 动力失衡模型兔颈椎间盘病理改变及终板软骨细胞的迁移凋亡规律[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1675-1679.
[12]	李婧瑜, 苏盈盈, 白丁. 骨关节炎早期模型小鼠软骨下骨的形态学特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1692-1698.
[13]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[14]	谢兴奇, 胡伟, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 20-26.
[15]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.