1.1 设计 细胞学实验。
1.2 时间及地点 于2015年5月至2016年5月在沈阳医学院中心实验室完成。
1.3 材料 健康新生3 d的SD大鼠2只,体质量6-15 g,雌雄不限,购自沈阳医学院实验动物中心,动物合格证号:2015-0001。
1.4 实验方法
1.4.1 获取神经元分泌因子 ①将1只大鼠麻醉后离断颈椎处死,取其脑组织,用镊子轻轻去除脑组织中的血管和表面被膜,将处理好的脑组织浸入磷酸缓冲盐溶液漂洗2次,充分浸入30-50倍的磷酸缓冲盐溶液中,用吸管反复吹打,使细胞脱落,制备细胞悬液;②为排除细胞成分以外的其他成分,将细胞悬液置于试管中,静止一段时间,直到大量脂肪和其他杂质上浮,细胞组织沉降至试管底,弃去混有杂质的上层液体。反复进行此过程,直至上层液体清澈(约3次);③取细胞悬液,注入适量培养液,用纱网重复过滤,先在计数板上计数,再调节细胞的浓度为1×108 L-1,将调好密度的细胞接种至培养皿中,放入体积分数5%CO2的温箱中开始培养。每天更换细胞培养液,将神经元培养至5 d时,连续2 d不更换培养液,2 d后从温箱中取出培养皿,将培养皿中细胞培养液离心,留取上清液,该上清液中就含有神经元分泌因子。
1.4.2 骨骼肌细胞培养及分组 肌细胞组织块培育法:将另一只大鼠麻醉后离断颈椎处死,取大鼠后肢腓肠肌组织,在培养皿中剪碎的肌肉组织,然后转移到培养瓶, 平铺于培养瓶的底面。将培养瓶倒置,向培养瓶中加入培养液,注意不要使培养液触及瓶底的肌肉碎片。将培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中3 h,取出后缓慢倒转培养瓶,使肌组织充分浸泡在培养液中。培养3 d后换液,以后每天换液1次。用细胞的传代培养法培养肌细胞,待培养瓶内的细胞达到一定浓度后, 将培养瓶中原来的培养液弃去,用胰蛋白酶溶液消化10-30 s,消化结束时,用吸管反复吹打瓶壁细胞,使其完全脱落,将细胞调整浓度为1×108 L-1,然后将细胞移至12孔板。实验分2组:对照组用2倍浓度血清DMEM+磷酸缓冲盐溶液等体积配比培养,实验组用2倍浓度血清DMEM+神经细胞上清液等体积配比培养,每组6孔,两组每日换液1次。
1.4.3 苏木精-伊红染色计数细胞 ①将两组细胞培养6 d,用磷酸缓冲盐溶液冲洗细胞爬片3次;②用胶头滴灌滴加适量体积分数95%乙醇,20 min后用PBS冲洗2次,冲洗时间共2 min;③苏木精染液染色两三分钟,自来水冲洗;④用显微镜观察经苏木素染色的核,如果细胞核颜色过深,用体积分数1%盐酸乙醇溶液分色几秒后,用自来水充分冲洗;⑤放入伊红染液染色1 min,自来水冲洗。
苏木精-伊红染色后,每个细胞染色后爬片在光学显微镜100倍视野下随机选取4个视野拍照,每个图片采用Image Pro Plus 6.0软件进行细胞计数。
1.4.4 免疫组织化学染色 将细胞均接种于12孔板中培养3 d,去除培养基,用PBS洗涤1次,在室温用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,PBS冲洗1次,室温下体积
分数30%过氧化氢∶甲醇(1∶50)孵育30 min(以灭活内源性过氧化物酶),然后PBS冲洗2次,再用体积分数5%牛血清白蛋白进行封闭, 除掉其余液体,加兔抗小鼠α肌动蛋白抗体(1∶200;北京鼎国昌盛生物技术有限公司),4 ℃过夜,第2天,PBS洗涤2次,滴生物-羊抗兔IgG,室温下30 min,PBS清洗3次,滴加生物素化山羊抗兔IgG,室温下30 min,PBS清洗3次,滴加试剂SABC,室温作用20 min后,PBS冲洗3次。取1 mL蒸馏水,加DAB试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后滴入孔中,室温下显色,显微镜下控制时间。然后苏木精复染,脱水,透明。
1.5 主要观察指标 倒置相差显微下观察两组细胞形态及α肌动蛋白的免疫反应。
1.6 统计学分析 计量资料用x±s表示,采用用SPSS 12.0软件进行数据分析,组间数据差异的比较采用两样本t 检验,P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程