热缺血20 min猪心脏死亡供体心冠状动脉内皮功能的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.015

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4362-4367.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.015

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

热缺血20 min猪心脏死亡供体心冠状动脉内皮功能的变化

孙晓柯1，张伟华1，秦广启2，廖秋明2，Stig Steen2，乔晨晖1

1郑州大学第一附属医院心脏外科，河南省郑州市 450052；2隆德大学医院心胸外科，瑞典 22594

收稿日期:2016-04-21 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 乔晨晖，博士，主任医师，教授，郑州大学第一附属医院心外科，河南省郑州市 450052
作者简介:孙晓柯，男，1982年生，河南省内乡县人，郑州大学在读硕士，主治医师，主要从事心脏外科基础与临床的研究。
基金资助:
河南省科技厅科技攻关项目(142102310346)

Effects of 20-minute warm ischemia on coronary endothelial function of pig donor hearts after cardiac death

Sun Xiao-ke1, Zhang Wei-hua1, Qin Guang-qi2, Liao Qiu-ming2, Stig Steen2, Qiao Chen-hui1

1Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China; 2Department of Cardiothoracic Surgery, Lund University Hospital, Sweden 22594

Received:2016-04-21 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
Contact: Qiao Chen-hui, M.D., Professor, Chief physician, Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Sun Xiao-ke, Attending physician, Department of Cardiac Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the Key Science and Technology Program of Henan Province, China, No. 142102310346

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
心脏死亡供体：在供体心脏停止跳动后经历一段热缺血后获得的心脏，按照Maastricht大学医院的标准，心脏死亡供体分为 4 类：到院时已经死亡；复苏失败；撤除生命支持、等待心脏停跳；脑死亡患者的心脏停跳。
热缺血时间：器官从供体供血停止到冷灌注(冷保存)开始的这段时间。这一期间对器官的损害最为严重，一般不应超过10 min，这是因为，热缺血时(器官离体后)，虽然血流中断，但是器官组织仍继续进行代谢，此时，因氧和各种代谢底物供应缺乏而器官的代谢水平仍高，所以器官缺血损害出现较快、程度较重，又因氧消耗完后，仍可进行无氧代谢，但代谢产物无法清除，可引起酸中毒，代谢必需的养料和酶系统亦有消耗。

摘要
背景：心脏移植中，热缺血导致供心的损伤除了心肌损伤，还有冠状动脉血管内皮损伤，而冠状动脉血管内皮结构与功能的完整性是影响心脏移植患者术后近远期疗效的关键因素之一。
目的：观察缺氧诱导的热缺血20 min猪心脏死亡供体供心冠状动脉内皮细胞功能变化。
方法：健康瑞典家猪16头，随机分为对照组6头、心脏死亡供体组和心脏死亡供体+冷保存组各5头。对照组直接切取心脏冠状动脉左前降支远端血管环进行器官浴槽实验；心脏死亡供体组和心脏死亡供体+冷保存组均建立缺氧诱导的热缺血20 min的心脏死亡供体模型，心脏死亡供体组直接切取心脏冠状动脉左前降支远端血管环进行器官浴槽实验；心脏死亡供体+冷保存组切取心脏后保存4 h，再切取心脏冠状动脉左前降支远端血管环进行器官浴槽实验。评价3组冠状动脉内皮依赖性舒张(EDRmax)的变化。
结果与结论：冠状动脉内皮依赖性舒张(EDRmax) 3组间差异无显著性意义(P > 0.05)；50%最大舒张时P物质的浓度对数(pEC50) 3组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示热缺血20 min猪心脏死亡供体心脏冠状动脉内皮功能损伤不明显，心脏死亡供体+冷保存4 h对冠状动脉内皮功能也无显著影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1665-612X(孙晓柯)

关键词: 组织构建, 组织工程, 心脏移植, 心脏死亡供体, 猪, 内皮细胞, 热缺血, 器官浴槽

Abstract:

BACKGROUND: Myocardial and coronary endothelial injury occurs in donor hearts due to warm ischemia during cardiac transplantation. Coronary endothelial structure and function play a critical role in long-term outcomes for patients after cardiac transplantation.
OBJECTIVE: To study the effect of hypoxia-induced warm ischemia (20 minutes) on coronary endothelial function of porcine donor hearts after cardiac death (DCD).
METHODS: Sixteen healthy Swedish domestic pigs were randomized into control (n=6), DCD (n=5), and DCD plus cold storage (n=5) groups, respectively. A DCD model in pigs was established using the method of hypoxia-induced 20-minute warm ischemia in the DCD and DCD plus cold storage groups. Isolation of the heart left anterior descending coronary artery or combined with heart preservation pretreatment for 4 hours was performed in the DCD and DCD plus cold storage groups. The maximum coronary endothelium-dependent relaxation was determined in the three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in the maximum coronary endothelium-dependent relaxation and the minus logarithmic of substance concentration induced 50%maximal relaxation among three groups (P > 0.05). These results indicate that 20-minute warm ischemia cannot lead to obvious coronary endothelial dysfunction. In addition, DCD combined with 4-hour cold storage does not affect coronary endothelial function.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Heart, Transplantation, Endothelial Cells, Swine

中图分类号:

R318

孙晓柯，张伟华，秦广启，廖秋明，Stig Steen，乔晨晖. 热缺血20 min猪心脏死亡供体心冠状动脉内皮功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4362-4367.

Sun Xiao-ke, Zhang Wei-hua, Qin Guang-qi, Liao Qiu-ming, Stig Steen, Qiao Chen-hui. Effects of 20-minute warm ischemia on coronary endothelial function of pig donor hearts after cardiac death[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4362-4367.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

心脏移植作为终末期心脏疾病最有效的治疗措施，已在全世界范围内被广泛接受和应用^[1-2]，供心严重匮乏是临床心脏移植面临的最大难题^[3]。心脏死亡供体(donation after cardiac death，DCD)供心心脏移植的概念出现于20世纪60年代，世界第1例成功的同种异体心脏移植应用的正是心脏死亡供体供心^[4-5]。数十年来，心脏死亡供体供心心脏移植相关动物实验已经取得良好的结果。

Martint等^[6]对猪和Repse等^[7]对狗的研究均报道了心脏死亡供体供心心脏移植后成功早期复跳，并能提供有效的循环支持；Shirakura等^[8]报道热缺血30 min的狗心脏死亡供体供心心脏移植后受体心功能成功恢复；而狒狒接受心脏死亡供体供心心脏移植后能够长期生存也被Gundry等^[9]及其同事所报道。非心脏器官移植的临床研究显示，心脏死亡供体是可靠的器官来源，在肾脏和肝脏移植方面已经取得较好临床效果并增加了此类器官移植术的数量^[10-14]，应用心脏死亡供体供心同样能为心脏移植提供额外的供心来源^[15-16]，但是受心脏自身高代谢及耐缺氧能力差等生理特点以及难以避免的热缺血带来的损伤，心脏死亡供体供心的使用还存在较大争议^[17]。

心脏移植过程中热缺血是难以避免的过程^[18-20]，其所导致的供心损伤除心肌损伤外，还有冠状动脉血管内皮损伤，而冠状动脉血管内皮结构与功能的完整性是影响心脏移植患者术后近远期疗效的关键因素之一，与之相关的研究较少。实验通过观察缺氧诱导的热缺血20 min猪心脏死亡供体供心冠状动脉内皮细胞的功能变化，为心脏死亡供体供心的临床应用提供相应依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计内皮细胞功能观察实验。

1.2 时间及地点于2015年2月至6月在瑞典LUND大学心胸外科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组健康瑞典家猪16头，雌雄不限，体质量25-28 kg，由瑞典隆德大学医院心胸外科研究中心提供，将16头猪随机分为对照组6头、心脏死亡供体组和心脏死亡供体+冷保存组各5头。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 溶液和试剂改良St.Thomas’ Hospital溶液(含NaCI 120 mmol/ L，KCI 25 mmol/L，MgCI₂ 16 mmol/L，CaCI₂ 1.2 mmol/ L，Dextran 40 35 g/L)；Krebs 溶液(含NaCI 119 mmol/L，NaHCO₃ 15 mmol/L，KCI 4.6 mmol/ L，NaH₂PO₄ 1.2 mmol/L，MgCI₂ 1.2 mmol/L，CaCI₂ 1.5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L)。溶液均为新鲜配制，所有化学药品均购自德国Merck Darmstadt 公司。将血栓素A2类似物U46619(美国Cayman化学药品公司)溶解于乙醇，P物质(美国Sigma化学药品公司)溶解于蒸馏水作为原液，两者均-20 ℃保存。在实验前，用0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液将U46619原液稀释至5.7×10^-⁷ mol/L，pH值至中性；用蒸馏水稀释P物质原液至1×10^{-9^-⁴ mol/L梯度浓度。所示浓度为器官浴槽内值。}-1×10

1.3.3 主要仪器呼吸机300A型(德国Siemens公司)；手术显微镜(德国Zeiss公司)；7E型多导记录仪及FT03D型张力传感器(美国Grass Instrument公司)；肌动描记器(隆德大学医院医疗器械科定制)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物准备实验动物麻醉前禁食2 h，自由饮水。麻醉成功后气管切开插管，呼吸机维持通气，采用容量控制压力辅助通气。心电监测，颈静脉穿刺置管建立静脉输液通道并监测中心静脉压，颈动脉穿刺置管监测动脉血压。

1.4.2 心脏死亡供体模型建立正中开胸，打开心包。静脉注射肝素300 IU/kg。静注肌松剂，停呼吸机，断开气管插管连接，开始记录热缺血时间20 min。在热缺血时间内不触碰心脏，不做任何处理。热缺血时间是从中止呼吸到灌注心肌保护液。

1.4.3 心脏死亡供体组在热缺血20 min后，立即阻断上下腔静脉，阻断主动脉。经主动脉根部Y型灌注针灌注心肌保护液(St.Thomas晶体液，20 mL/kg，灌注压力40 mm Hg，1 mm Hg=0.133 kPa)，于阻断钳远心端切断下腔静脉，使右心减压，并剪开左心耳行左心减压。灌注完毕后切取心脏。取冠状动脉左前降支远端血管环行器官浴槽实验。

1.4.4 心脏死亡供体+冷保存组在热缺血20 min后，心麻液灌注后直接切取心脏，放置于存有St.Thomas’ Hospital溶液作为保存液的隆德大学特制心脏保存容器中，温度设定为4 ℃，保存4 h。然后同样取心脏冠状动脉左前降支远端血管环进行器官浴槽实验。

1.4.5 对照组直接正中开胸切取心脏，取心脏冠状动脉左前降支远端血管环进行器官浴槽实验。

1.4.6 冠状动脉内皮功能测定

(1)各组均应用手术显微镜，取冠状动脉的左前降支中下1/3段，截取成长度为2.0-3.0 mm的血管环。一般6段。

(2)将血管环悬挂固定于盛有5 mL 37 ℃ Krebs液的浴槽中的金属挂钩上，Krebs液持续吹入充满体积分数95%O₂和5%CO₂混合气体以供氧和维持pH为7.4左右，金属挂钩一端连接张力传感器，并与7E型多导记录仪连接，另一端与一可移动装置连接牵拉血管，将其张力调节至生理状态(10 mN)，为基础张力。平衡60 min，期间每隔15 min更换Krebs液1次。

(3)血管张力稳定后，先2次以127 mmol/L KCl溶液预收缩血管环，获得最大收缩力。待收缩反应曲线至平台期后，用Krebs液灌洗，达到基础张力稳定后，用50 μL浓度为5.7×10^-⁷ mol/L的U46619诱导血管环预收缩，达到最大张力后用Krebs溶液反复冲洗血管直至恢复基础张力，再次加入相同剂量的U46619诱导血管环收缩，稳定时的张力值作为最大收缩值。

(4)依次向浴槽内加入50 μL、浓度递增的P物质(10^{-9^-⁴ mol/L)，观测每个浓度P物质诱导的血管舒张值占预收缩值的百分数、最大舒张值、50%最大舒张时P物质的浓度对数(pEC₅₀，代表血管对药物的敏感性)。实验中，不加入P物质时均无自发性舒张发生，不论 P物质有没有诱导完全舒张，均加入罂粟碱(10^-⁴ mmol/L)诱导完全舒张。}-10

1.5 主要观察指标 P物质引发的血管内皮细胞源性舒张变化。

1.6 统计学分析所有实验数据采用x(_)±s表示。采用单因素方差分析，应用SPSS 21.0进行统计分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

研究通过建立缺氧诱导的心脏死亡供体模型证实了热缺血20 min的猪心脏死亡供体心脏冠状动脉内皮功能损伤不明显，冷保存4 h对冠状动脉内皮功能也无显著影响。心脏死亡供体供心是在供体心脏停止跳动后经历一段热缺血后获得的心脏，由于死亡过程中的热缺血损伤^[21-22]，使供心遭受低压灌注、缺氧性损伤，心肌细胞的能量代谢紊乱，低温保存进一步加重了心肌能量的消耗，引起心肌细胞坏死，因此复苏成功率较低，心脏死亡供体供心的使用存在争议^[18]。关于人类应用心脏死亡供者供心心脏移植的经验较少，除了早期南非医生班纳德报道外，仅有Ali等^[16]报道1例57岁女性心脏死亡供者供心移植后左右心室功能恢复；Rosefeldt等^[23]报道1例42岁男性心脏死亡供者供心移植后能够维持正常左室压力超过12 h；Boucek等^[17]报道3例婴幼儿心脏死亡供者供心心脏移植手术成功，以上结果都支持心脏死亡供体供心的应用。如果能够限制热缺血时间，并经过适当的心肌保护和内皮保护措施，心脏死亡供体供心将有很好的利用价值^[7,16]，能使心脏移植数量增加24%-45%^[24]。

心脏移植中，维持供心冠脉内皮结构与功能的完整是影响心脏移植患者近远期疗效的关键因素之一。如果冠状动脉血管内皮一旦受到损害，就会造成毛细血管通透性增加、心肌水肿、微循环灌注不足，甚至出现无复流现象，导致冠状动脉阻力升高、血流下降，发生术后早期的心功能障碍^[25-26]，远期可致心脏移植物血管受到损害，而心脏移植物血管病变是导致心脏移植术后死亡的重要原因之一^[27]，从而严重影响手术患者早期和远期的存活率^[28]。

血管内皮结构和功能的完整性可通过测定血管EDR来评价^[29-32]。研究中，先使用U46619 对血管环进行预收缩，使各组血管张力无显著性差异。随后依次加入不同浓度(10^{-9^-⁴ mol/L)的P物质，血管内皮舒张百分比随P物质浓度升高而逐渐升高，在10^-5mol/L时均达到最大舒张，P物质浓度反应曲线十分接近。心脏死亡供体组相比心脏死亡供体+冷保存组，在各个浓度点反应敏感性及舒张程度均相近，EDR_max及pEC₅₀无显著差异(P > 0.05)，血管内皮功能基本正常，而冠状动脉内径无显著差异(P > 0.05)，显示了内皮结构的完整；心脏死亡供体组和对照组相比，在各个浓度点反应敏感性及舒张程度均低于对照组，EDR_max及pEC₅₀无显著差异(P > 0.05)，血管内皮功能基本正常，而冠状动脉内径无显著差异(P > 0.05)，显示了内皮结构的完整；心脏死亡供体+冷保存组在各个浓度点反应敏感性及舒张程度均低于对照组，但是EDR_max及pEC₅₀无显著差异(P > 0.05)，血管内皮功能基本正常，而冠状动脉内径无显著差异(P > 0.05)，显示了内皮结构的完整。3组血管内皮的血管内径、EDR_max和pEC₅₀无显著差异，说明了猪心脏死亡供体供心遭受20 min热缺血及随后4 h的冷保存后冠状动脉内皮的舒张功能及结构相比正常猪心没有受到影响，没有破坏内皮细胞的结构和功能的完整性，与正常心脏相比不会增加移植术后移植物血管病的发生率。}-10

而现有人类相关的临床研究发现热缺血20 min内的心脏可以成功复跳，并且心功能及血流动力学恢复^[16,18]。Boucek等^[17]报道3例儿童心脏死亡供体心脏移植并获得成功，平均热缺血时间为18 min，Iyer等^[15]报道热缺血20 min的心脏死亡供体供心可以成功复跳，心功能和生理机制恢复，而本实验运用器官浴槽实验证实缺氧诱导的热缺血20 min的心脏死亡供体供心冠脉内皮结构和功能的完整，进一步提示心脏死亡供体供心在心脏移植中的可行性，为心脏死亡供体供心的临床应用提供相应的实验支持。但是实验一方面未能对复跳后心脏的冠脉内皮结构和功能的完整性做出评估，另一方面未能观察不同热缺血时间下内皮功能和结构的完整，需要在下一步实验中完善。

此外研究中建立了窒息诱导缺氧心脏停跳模型，除了肝素抗凝剂外没有采取任何预处理措施，采用改良St.Thomas’ Hospital 溶液进行心肌保护。与动物实验中常用的放血诱导建立心脏停跳模型相比^[33]，缺氧心脏停跳模型存在一个较长的缺氧过程，导致代谢快速从有氧代谢转换为无氧代谢，ATP快速消耗，大量代谢废物堆积，心脏膨胀明显，心肌损伤更加严重，但是更好的模拟了临床中的实际情况。实验动物选用猪，猪心在解剖结构、病理生理机制等方面和人非常类似，所以研究猪供心的热缺血、冷保存过程中损伤的病理生理机制对人类心脏移植具有重要指导意义。

综上所述，缺氧诱导的热缺血20 min的猪心脏死亡供体心脏冠状动脉内皮功能损伤不明显，心脏死亡供体+冷保存4 h对冠状动脉内皮功能也无显著影响，为心脏死亡供体供心的可能应用提供相应的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

热缺血20 min猪心脏死亡供体心冠状动脉内皮功能的变化

Effects of 20-minute warm ischemia on coronary endothelial function of pig donor hearts after cardiac death

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