草酸钙晶体刺激下人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现在肾结石模型中肾间质晶体周围存在大量单核/巨噬细胞浸润，显示巨噬细胞可能参与晶体在肾脏中的沉积过程，而巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞，在肾脏中沉积的大量的单核/巨噬细胞吞噬晶体，会产生一些炎症因子损伤和破坏肾小管上皮细胞，最终有利于结石的形成。

目的：探讨一水草酸钙晶体刺激人巨噬细胞后高迁移率族蛋白B1的表达水平。

方法：用100 mg/L的一水草酸钙刺激巨噬细胞，分别于刺激后0，6，12，24和36 h，用Western blot检测细胞总蛋白和细胞浆内高迁移率族蛋白B1的含量；用实时荧光定量PCR，检测细胞中高迁移率族蛋白B1 mRNA表达情况；分别于一水草酸钙刺激后0，1，2和4 h，用酶联免疫吸附实验测定细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平。

结果与结论：一水草酸钙刺激后0-6 h细胞浆内高迁移率族蛋白B1的含量较低，刺激后12-36 h细胞浆内高迁移率族蛋白B1逐渐增加。一水草酸钙刺激后0-6 h，巨噬细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1含量不高，在刺激后12 h细胞总蛋白高迁移率族蛋白B1的含量开始增加，并且在刺激后24-36 h保持在较高水平。RT-PCR结果显示，一水草酸钙刺激后0-12 h，培养细胞中高迁移率族蛋白B1的mRNA表达量无明显变化，刺激后18-24 h培养细胞中高迁移率族蛋白B1的mRNA表达量明显增加。ELISA结果显示，一水草酸钙刺激后2 h，细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达和释放增加，4 h达到明显高峰。结果表明，一水草酸钙可以诱导人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的表达及mRNA表达增加；诱导人巨噬细胞内肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达增加，且高迁移率族蛋白B1表达的时间明显晚于肿瘤坏死因子a和白细胞介素6的释放时间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 高迁移率族B1, 一水草酸钙, 巨噬细胞

Abstract:

BACKGROUND: There are a large amount of infiltrated monocytes and macrophages around the renal interstitial crystals in a kidney model, indicating that macrophages may be involved in the process of crystal deposition in the kidney. As macrophages are important human innate immune cells, a large number of infiltrated monocytes and macrophages in the kidney will produce some inflammatory injuries and damage renal tubular epithelial cells, which ultimately lead to the formation of stones.

OBJECTIVE: To study the expression of after high mobility group box-1 protein (HMGB1) in macrophages stimulated by calcium oxalate monohydrate crystals.

METHODS: Western blot assay was used to detect total protein and HMGB1 levels in the cytoplasm of macrophages under 100 mg/L calcium oxalate monohydrate stimulation for 0, 6, 12, 24, 36 hours. Meanwhile, real-time quantitative PCR was adopted to determine the mRNA expression of HMGB1. Tumor necrosis factor α and interleukin-6 levels in the cultured cell supernatant at 0, 1, 2 and 4 hours after calcium oxalate monohydrate stimulation were measured using ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: Under the calcium oxalate monohydrate stimulation, the level of HMGB1 in the cytoplasm of macrophages was lower within 0-6 hours, but gradually increased within 12-36 hours; the level of HMGB1 in the total protein of macrophages was not high within 0-6 hours, began to increase at 12 hours, and then kept at a higher level within 24-36 hours. RT-PCR results showed that under the calcium oxalate monohydrate stimulation, the mRNA level of HMGB1 in the cultured cells had no changes within 0-12 hours, but significantly increased within 18-24 hours. ELISA results showed that the levels of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the cultured cell supernatant subject to calcium oxalate monohydrate were increased at 2 hours and peaked at 4 hours. These findings indicate that calcium oxalate monohydrate can increase the HMGB1 expression in macrophages at mRNA and protein levels, and also induce the increase in tumor necrosis factor α and interleukin-6 expression in macrophages. Moreover, the expression of HMGB1 is later than the release of tumor necrosis factor α and interleukin-6.

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Key words: High Mobility Group Proteins, Calcium Oxalate, Macrophages

中图分类号:

R318

黄鹏，邓耀良，黎承杨，陶芝伟，王翔，奉有才，吴博. 草酸钙晶体刺激下人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1712-1716.

Huang Peng, Deng Yao-liang, Li Cheng-yang, Tao Zhi-wei, Wang Xiang, Feng You-cai, Wu Bo . Calcium oxalate crystals stimulate expression of high mobility group box-1 protein in human macrophages [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1712-1716.

图/表（结果） 1

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引言

肾结石中80%以上的结石成分是草酸钙晶体。De Water等^[1]和Khan等^[2]的研究发现在肾结石模型中肾间质晶体周围存在大量单核/巨噬细胞浸润，显示巨噬细胞可能参与晶体在肾脏中的沉积过程，而巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞，在肾脏中沉积的大量的单核/巨噬细胞吞噬晶体，会产生一些炎症因子损伤和破坏肾小管上皮细胞，最终有利于结石的形成。

高迁移率族蛋白B1是近年来发现的一种重要的“晚期炎症因子”，是一类含量丰富的低分子量核内非组蛋白，由215个氨基酸残基组成，在进化中高度保守^[3]。细胞核内的高迁移率族蛋白B1可通过结合染色体DNA，从而参与细胞分化和成熟、DNA修复和重组、类固醇激素调控、基因转录调控等活动^[4]。与其他核蛋白不同，高迁移率族蛋白B1可释放到细胞外，作为细胞因子发挥着促炎、调节神经细胞轴突生长、肿瘤转移以及动脉粥样硬化和血管损伤后再狭窄等多种病理生理效应^[5-6]。在感染或者机体损伤情况下，高迁移率族蛋白B1可以由坏死的细胞被动释放和活化的单核-巨噬细胞主动分泌，以出现时间晚、高峰持续时间长为特点，在炎症反应中发挥十分重要促炎的作用。因此，可能成为治疗疾病的一个潜在的靶点^[7-8]。然而，高迁移率族蛋白B1在肾结石中表达的研究尚未完全明确。

目前认为，炎症反应在肾结石Randall斑的形成中发挥重要作用，细胞-晶体反应必然会有炎症因子的释放及对肾间质、上皮细胞的破坏，而磷酸钙具有诱导草酸钙成核及可能直接引起肾小管上皮损伤的能力，为巨噬细胞吞噬和转运晶体创造条件^[9]。由于高迁移率族蛋白B1释放时间晚、高峰持续时间长，因此以其作为治疗炎症的靶点可获得较为宽广的治疗时间窗，但在肾结石形成过程中，一水草酸钙诱导巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的释放规律尚不清除。实验拟采用一水草酸钙晶体刺激巨噬细胞，观察刺激后高迁移率族蛋白B1表达的情况，以阐明在肾结石中高迁移率族蛋白B1的表达规律，为临床治疗肾结石提供实验依据。

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2013年5月至2014年2月在广西医科大学实验中心完成。

材料：

细胞株：人组织淋巴瘤细胞株U937，购自中科院上海细胞库，由广西医科大学实验中心保存。

实验方法：

细胞培养及处理：将对数生长期的U937人巨噬细胞加入PMA接种于培养瓶，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱内培养 24 h。加入含一水草酸钙100 mg/L的RPMI1640培养液培养0，6，12，24和36 h，用Western blot检测细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1的含量；提取培养细胞胞浆蛋白，用Western blot检测细胞浆内高迁移率族蛋白B1含量；提取细胞总RNA，用实时荧光定量PCR(Real time-PCR，RT-PCR)检测培养细胞中高迁移率族蛋白B1的mRNA表达情况；加入含一水草酸钙100 mg/L的RPMI1640培养液培养1，2，4 h，按ELISA试剂盒说明书测定培养细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平。

Western蛋白印迹分析(Western blot)：采用BIO-RAD垂直直板电泳槽、转移电泳芯、电泳仪，按说明步骤进行。将处理好的样品加入电泳槽，每孔25-30 μL，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，在5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗高迁移率族蛋白B1多克隆抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，1×TBST洗涤PVDF膜 5 min×5次，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶8 000)，室温孵育1.5 h，1×TTBST洗涤5 min×5次，ECL显影，压片。采用凝胶成像系统分析结果。Western blot图片用Image J软件采集条带吸光度，取目的条带吸光度与相应内参条带吸光度的比值为相对表达量。

反转录-多聚酶链聚合物反应(RT-PCR)：按RNA提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。引物由TaKaRa公司设计合成。

收到引物后离心1 000 r/min×5 min，用灭菌生理盐水充分溶解，调整浓度至100 μmol/L后保存于-20 ℃，备用。

RT-PCR反应：使用美国ABI公司的7500实时荧光定量PCR仪进行PCR反应。在基因扩增过程中，反应体系内的荧光染料能结合双链结构并发出荧光信号，而7500PCR仪能实时监测和自动分析荧光信号，经过系统软件对荧光强度分析得出基因相对表达量。参照TaKaRa实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作。

细胞浆蛋白的提取：按试剂盒说明书进行。具体步骤如下：收集细胞沉淀，加入5-10倍细胞沉淀体积的细胞浆蛋白提取试剂，剧烈振荡15 s，冰上孵育10-10 min，4 ℃、15 000×g离心10 min，立即吸取上清放至预冷的塑料管中，即为细胞浆蛋白，放于-20 ℃冰箱保存。

细胞总蛋白的提取：倒掉培养液，每瓶细胞加3 mL 4 ℃预冷的PBS(0.01 mol/L pH 7.2-7.3)。平放轻轻摇动 1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作2次，共洗细胞3次以洗去培养液。每瓶细胞加400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，培养瓶要经常来回摇动使细胞充分裂解。然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中，于 4 ℃下12 000 r/mim离心5 min。将离心后的上清即为细胞总蛋白，分装转移倒0.5 min 的离心管中，放于 -20 ℃保存。

ELISA检测-水草酸钙刺激后巨噬细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平：按双抗夹心法ELISA检测试剂盒说明书进行。加入含一水草酸钙100 mg/L的RPMI1640培养液培养1，2，4 h，按ELISA试剂盒说明书测定培养细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平。

主要观察指标：①一水草酸钙刺激后人巨噬细胞总高迁移率族蛋白B1含量。②一水草酸钙刺激后人巨噬细胞细胞浆蛋白含量。③一水草酸钙刺激后人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1 mRNA的表达。④一水草酸钙刺激后人巨噬细胞培养液中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平。

统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件，计量数据以 x(_)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。±s

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讨论

目前关于活化的巨噬细胞内高迁移率族蛋白B1 mRNA基因表达有无变化及如何变化尚存在争议。文献报道用内毒素(LPS)刺激巨噬细胞后24 h以内细胞内高迁移率族蛋白B1mRNA基因表达无明显变化^[10]。本实验观察到一水草酸钙刺激巨噬细胞0-12 h后，细胞内的高迁移率族蛋白B1 mRNA基因表达无明显变化，刺激18-24 h后，细胞内的高迁移率族蛋白B1mRNA基因表达明显增高，说明在一水草酸钙刺激后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1 mRNA基因表达出现上调，而基因上调的时间在刺激18 h后出现，其具体机制尚需要进一步的研究。

尽管目前对巨噬细胞释放高迁移率族蛋白B1有较多的研究，但在肾结石中的高迁移率族蛋白B1的释放尚缺乏深入的研究。文献报道用内毒素刺激巨噬细胞后，12-24 h细胞浆高迁移率族蛋白B1含量逐渐增高，细胞核内高迁移率族蛋白B1含量逐渐减少^[11-13]，但是刺激时间再24 h以上的报道罕见。有研究观察高迁移率族蛋白B1对磷酸钙诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1的协同作用，结果表明，磷酸钙及高迁移率族蛋白B1均可诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1；高迁移率族蛋白B1可协同磷酸钙诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1^[14]。

本实验采用一水草酸钙刺激巨噬细胞，用Western blot检测高迁移率族蛋白B1的释放和细胞内含量的变化，结果显示，一水草酸钙刺激后12 h开始，巨噬细胞总蛋白中的高迁移率族蛋白B1含量逐渐增高，刺激24 h后达到高峰，并一直持续到36 h。观察一水草酸钙刺激后巨噬细胞细胞浆高迁移率族蛋白B1含量的变化，结果显示，一水草酸钙刺激前，细胞浆中高迁移率族蛋白B1的含量较少，刺激12-36 h后细胞浆中高迁移率族蛋白B1含量逐渐增加，并且保持在较高水平。以上实验结果表明，一水草酸钙刺激后12-36 h，巨噬细胞内高迁移率族蛋白B1逐渐由细胞核转移到细胞浆，导致一水草酸钙刺激后12-36 h细胞浆的高迁移率族蛋白B1含量不断增加的趋势；刺激18-24 h后细胞内高迁移率族蛋白B1 mRNA基因表达上调，细胞开始合成新的高迁移率族蛋白B1，以补充细胞核内转移到细胞浆并释放到细胞外的高迁移率族蛋白B1，所以巨噬细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1的含量在24 h达到高峰，并且由于巨噬细胞合成新的高迁移率族蛋白B1不断的释放，巨噬细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1的含量在一水草酸钙刺激后24-36 h保持较高的水平。

本实验用ELISA检测了一水草酸钙刺激后巨噬细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，结果显示，细胞培养液中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平在一水草酸钙刺激后2 h开始增加，4 h达到高峰，而一水草酸钙刺激后巨噬细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1含量的增加出现在刺激12 h后，高迁移率族蛋白B1mRNA的上调在刺激18 h后，表明一水草酸钙刺激后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1合成和释放的时间明显晚于肿瘤坏死因子α和白细胞介素6释放的时间。

本实验结果表明一水草酸钙刺激巨噬细胞后，高迁移率族蛋白B1由细胞核内逐渐转移到细胞浆，并持续较长的高峰时间，且高迁移率族蛋白B1释放的时间明显晚于肿瘤坏死因子α和白细胞介素6释放的时间。一水草酸钙可以刺激巨噬细胞高迁移率族蛋白B1 mRNA基因表达的上调，但高迁移率族蛋白B1释放到细胞外后如何发挥其作用仍需进一步研究。

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