激光对炎症牙髓中碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：激光应用于口腔临床主要用于龋齿的早期诊断、龋坏组织的清除、活髓切断术牙髓止血、牙本质过敏治疗、感染的根管消毒、牙周炎治疗。

目的：观察炎症牙髓使用激光处理后碱性成纤维细胞生长因子的变化。

方法：5只成年健康beagle犬，每只随机选择6颗牙齿，分为3组，每组10颗，分别使用激光、生理盐水、庆大霉素处理，于术后第1，2，3天用纸尖收集牙髓分泌物检测碱性成纤维细胞生长因子的含量，并进行牙髓苏木精-伊红染色和免疫组织化学检查。

结果与结论：生理盐水处理组、庆大霉素处理组及激光处理组第3天碱性成纤维细胞生长因子表达量均明显多于第1天和第2天，第1天和第2天比较差异无显著性意义，3种处理方法之间比较差异无显著性意义。牙髓苏木精-伊红染色和免疫组织学检查显示，髓腔血管状况良好，牙髓排列紧密良好。结果表明，激光治疗对炎症牙髓中碱性成纤维细胞生长因子的释放没有影响。提示激光在口腔临床上的应用是安全、方便、有效的，不会对炎症牙髓组织造成损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 激光, 牙髓炎, 碱性成纤维细胞生长因子

Abstract:

BACKGROUND: The laser applied in the clinical oral medicine is mainly for early diagnosis of caries, removal of carious tissue, pulpotomy for pulp bleeding, dentin hypersensitivity treatment, disinfection of infected root canals, and periodontitis treatment.

OBJECTIVE: To explore the changes of basic fibroblast growth factor in inflammatory pulp after laser treatment.

METHODS: Five healthy adult beagle dogs were enrolled, and six teeth were randomly selected from each dog. Then, these teeth were randomly divided into three groups, 10 teeth in a group, and they were treated with laser irradiation, saline and gentamicin irrigation respectively. At days 1, 2, 3 after operation, exudates from the pulp were collected for detection of basic fibroblast growth factor expression. Meanwhile, the dental pulp was detected by hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry method.

RESULTS AND CONCLUSION: In the all three groups, the expression of basic fibroblast growth factor at day 3 was significantly higher than that at days 1 and 2, and there were no differences between days 1 and 2. Moreover, these three groups also showed no significant differences. Under hematoxylin-eosin and immunohistochemical staining, blood vessels in the pulp cavity were in good condition and the pulp arranged tightly. These findings suggest that the laser is safe, convenient and effective for oral clinical application, and has no injury to the inflammatory pulp.

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Key words: pulpitis, lasers, fibroblast growth factor 2

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

牙髓炎是口腔临床常见病、多发病，而激光在口腔的应用越来越广泛。碱性成纤维细胞生长因子作为一种多肽生长因子，主要作用于中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，对神经元的存活及突起再生有促进作用，是一种广谱神经营养因子^[1]。不仅可通过趋化作用使中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等向损伤部位聚集，而且能促进肉芽组织和血管的生成，促进软组织和骨组织中各种与损伤修复重建有关的细胞分裂增殖，对组织的损伤修复起至关重要的作用。

碱性成纤维细胞生长因子对创伤修复的3个阶段有促进作用^[2]：①在局部炎症反应期，对创伤细胞有明显的趋化活性，诱导成纤维细胞、血管内皮细胞、炎症细胞等向创面部位移动，激活巨噬细胞的吞噬功能，清除局部细菌和坏死组织，提高机体免疫活性，明显降低创面组织被感染的机会。②在细胞增殖修复期，有促进成纤维细胞迅速增殖作用，在合成大量胶原的同时促进血管内皮细胞、血管平滑肌细胞增殖和分化，促进新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织、毛细血管数量和血流量，改善创面微循环，为组织修复提供必需的氧及丰富的营养物质；促进神经纤维再生，恢复损伤部位的组织功能，增强创面抗感染能力。③在组织重建期，有促进上皮细胞增殖，再生上皮覆盖，缩短创面愈合时间，同时激活胶原酶，降解瘢痕组织中过多的胶原，抑制病理性瘢痕的增生^[3]。

激光因微创、安全、无痛及应用范围广的优点越来越受到人们的重视^[4]。口腔临床主要用于龋齿的早期诊断、龋坏组织的清除、活髓切断术牙髓止血、牙本质过敏治疗、感染的根管消毒^[5]、牙周炎治疗。但这一技术目前还有一些问题没有解决，高频率的切割，容易产生热积累、特别是机械刺激积累的不良反应；对牙髓组织造成损伤主要来源于激光的热效应，有可能对牙髓造成不可逆的损伤^[6-8]。

文章拟对临床可能造成牙髓损伤的激光治疗设计实验，通过检测碱性成纤维细胞生长因子释放量，判断牙髓的修复状况，为口腔临床治疗提供依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2012至2013年在中南大学湘雅医学院附属海口医院完成。

材料：

实验动物：成年健康beagle犬，雌雄不限，体质量11-15 kg，共5只，均购自沈阳康平实验动物研究所；HSM-III脉冲Nd:YAG激光治疗机，购自四川航天制导公司。

实验方法：

建立牙髓炎模型：5只Beagle犬，在犬牙面钻孔，用变形链球菌感染牙髓(细菌浓度为9×10⁸ cfu/mL)^[9]，髓室内先滴入细菌液，再用棉球蘸细菌液置入髓室，一般3 d可感染成功。

实验分组：牙髓炎模型成功建立之后，每只犬随机选择6颗牙进行实验，分为3组：其中2颗牙使用庆大霉素处理，2颗使用生理盐水处理，2颗使用激光处理。作好记录。连续处理3 d。

各组处理方法：实验牙均在牙颈部钻2个引流孔(图1A)；使用庆大霉素或生理盐水冲洗，安置自制的引流管，并接2支注射器，一支注射器抽吸使髓腔形成负压，另一支进行冲洗(图1B)；使用激光组参数选择200 mJ、30 Hz、 1 min，光纤直径0.5 mm进行处理(图1C)。

每次处理后均使用消毒纸尖收集牙髓分泌物(图1D)，再使用玻璃离子封闭引流孔，下次处理时再打开引流孔，重复上述处理过程。

标本取材及处理：3组犬牙髓分别使用Nd:YAG激光处理、庆大霉素及生理盐水处理后，于第1，2，3天用纸尖收集牙髓分泌物检测碱性成纤维细胞生长因子的含量，并做牙髓苏木精-伊红染色和免疫组织化学检查。在牙髓组织标本收集过程中，先将拔出的整个牙齿及时固定，24 h后再用涡轮机剖开牙齿，将已经固定的牙髓组织完整取出，这样可以最大限度保留牙髓组织；实验室部分是由经验丰富中心实验室的专业人员操作完成。

主要观察指标：①不同处理方法对犬牙髓碱性成纤维细胞生长因子的表达量。②不同处理方法犬牙髓苏木精-伊红染色和免疫组织化学检查结果。

统计学分析：用SPSS 13.0 for Windows统计软件包对数据进行统计描述分析：各样本数据不服从正态分布时用非参数检验；服从正态分布时以x(_)±s表示。分析结果P < 0.05为差异有显著性意义；P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

激光是LASER(light amplification by stimulated emission of radiation)的译称^[10]，即利用受激发射放大原理产生的单色光。Nd:YAG激光为不可见红外光^[11]，穿透力强，可向深层辐射，而向周围辐射小；具有亮度高及方向性、单色性、相干性良好等光学特性。

国内外学者在激光的热效应、光化学效应、电磁效应、生物刺激效应、压力效应进行了大量研究，口腔临床主要用于牙周炎治疗、牙本质脱敏、龋坏组织去除、活髓切断、感染根管消毒、龋病早期诊断等。

铒激光治疗中、重度慢性牙周炎，认为是一种适合根面容易敏感牙周炎患者的安全、有效的治疗方法^[12-13]。Matsumoto等^[14]首先尝试将Nd:YAG激光用于治疗牙本质敏感，激光光热效应、降低神经敏感性等作用可达到治疗牙本质敏感的目的^[15-16]，一方面激光照射牙本质产生的热效应可使牙本质表面熔融-再结晶，从而减少开放牙本质小管的数目、直径，降低牙本质通透性而缓解牙本质敏感症状^[17-18]。激光也会使牙体表面产生白垩色外观，能有效消融牙体硬组织^[19]，去除龋坏组织，有利于龋病的诊断和治疗；还能改变牙本质表面结构，使牙体表面粗糙，对牙本质有蚀刻作用，牙体组织表面清洁，无玷污层，管周牙本质突出，这些“酸蚀”样改变有利于牙本质黏结修复等^[20]。

碱性成纤维细胞生长因子具有多种生物学活性^[21-23]，是细胞增殖、分化与凋亡的重要调节因子。由成纤维细胞、上皮细胞等产生，具有促进组织创伤愈合，修复软硬组织，促进胚胎发育、血管增生以及分化等多项功能。针对激光在临床进行口腔治疗时是否会对牙髓造成损伤，影响牙髓组织的生理功能，本文就碱性成纤维细胞生长因子的释放进行探讨。

实验性牙髓炎建模过程中要求牙髓组织形成炎症而不进一步坏死，标本的收集过程中牙髓组织尽量保存在牙齿髓腔中而没有浪费；否则将影响实验结果；标本必须及时固定，防止抗原在组织细胞内弥散、丢失或失去免疫活性；组织经过甲醛固定、脱水透明及浸蜡过程，组织中的抗原成分已被破坏或封闭，因此一般需修复抗原，以恢复组织的抗原性和提高组织对抗体的敏感性；抗体是免疫组织化学最基本的试剂与材料，因为抗体是蛋白质构成，保存或使用不当，不但会造成浪费，而试剂变质会出现假阴性结果。

本实验根据预实验病理切片得出的结果及时进行实验，因此，牙髓组织没有进一步坏死；在牙髓组织标本收集过程中，先将拔出的整个牙齿及时固定，24 h后再用涡轮机剖开牙齿，将已经固定的牙髓组织完整取出，这样可以最大限度保留牙髓组织；实验室部分是由经验丰富中心实验室的专业人员操作完成。

实验结果显示，碱性成纤维细胞生长因子的释放随着时间的增加释放量增加，特别是第3天之后，释放量和第2、第1天比较，有显著统计学意义；而激光、庆大霉素、生理盐水3种不同的处理方法之间没有统计学意义，因此碱性成纤维细胞生长因子的释放随着时间的延长，释放量不断增加，不同的处理方法对生长因子的释放没有影响。

有研究认为，低强度激光在0.5-2.0 cm深度可达到0.01 J/cm²的强度^[24]，这个深度可到达浅表的神经组织，可以产生一定的生物刺激作用。本实验使用的激光的参数是200 mJ、30 Hz、1 min，但实验结果碱性成纤维细胞生长因子释放量激光组明显低于生理盐水组，虽然激光和生理盐水处理均对牙髓组织没有明显影响，但也没有发现激光对牙髓组织的生物刺激作用，和以上研究有所不同。

脉冲Nd:YAG激光因其操作简便、临床效果显著等优点，已得到广泛应用^[25]，但有研究认为激光在作用于硬组织及微生物的同时，还可能造成周围组织损害^[26-27]。而Ismikawa等的研究证明使用适当能量的激光而不损伤牙齿正常组织^[28-29]。因此针对临床使用激光可能对牙髓造成的热损伤，有专家提出弱激光疗法(low level laser therapy，LLLT)：激光照射生物组织后，局部组织温度不超过36.5 ℃或正常体温，不会造成不可逆损伤^[30-31]。

从实验的结果来看，激光、庆大霉素、生理盐水处理炎症牙髓，并没有对碱性成纤维细胞因子的释放产生影响，因此激光在临床上的应用是安全的，不必担心激光对牙髓造成热损伤，和弱激光治疗的研究相似^[32]。

陆铃等^[33]使用激光(参数60 W、0.5 s)照射狗牙活髓切断面，发现断面可形成0.2 mm厚的凝固层，根髓内无出血，炎性浸润及组织损伤均小，认为激光应用于切髓术可避免传统切髓法造成的牙髓损伤。本研究结果和以上结果相似。

综上所述，本实验使用激光处理炎症牙髓后，没有对牙髓造成热损伤，没有影响牙髓组织释放碱性成纤维细胞生长因子，因此可以推断激光在口腔治疗时并不影响炎症牙髓的修复过程。

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