化学去细胞尿道在大鼠皮下的埋置

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究提出了移植排斥反应的实质是受者免疫系统对供者移植物抗原的免疫应答反应。
目的：验证化学萃取去细胞处理对同种异体尿道移植抗原性的影响。
方法：取SD大鼠尿道共20根，每段长1 cm。其中10根采用化学去细胞法处理大鼠尿道的免疫原性成分，使其成为去细胞尿道；另外10根不做去细胞处理为新鲜尿道。在10只Wistar大鼠背部皮下植入去细胞尿道，另取10只大鼠背部皮下植入新鲜同种异体尿道。6周后取材行大体和组织学检查。
结果与结论：20只Wistar大鼠在皮下埋植尿道后均无自嗜肢体现象，切口愈合良好，饮食正常，无溃疡发生。6周后取材大体观察可见去细胞尿道周围有组织膜形成，而新鲜尿道未见组织膜形成。苏木精-伊红染色可见去细胞尿道逐渐被吸收，被平滑肌组织取代，并可见大小不等血管长入去细胞尿道内，部分有形成血窦的倾向；对照组尿道未见吸收，未见血管长入。提示化学去细胞尿道在大鼠体内逐渐形成类似正常尿道的组织材料，说明化学去细胞同种异体尿道移植的抗原性明显降低，可替代正常尿道海绵体组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 尿道, 同种异体移植, 去细胞, 免疫反应, 排斥反应

Abstract:

BACKGROUND: The nature of graft rejective reaction is the antigen immunological reaction of recipient’s immune system in response to donor’s graft.
OBJECTIVE: To observe the effect of chemical extraction on the immunogenicity of acellular peripheral urethral isografts.
METHODS: Twenty urethras of Sprague-Dawley rats, 1 cm long, were included in this study. Ten urethras were treated with chemical acellular method to remove immunogenic component, thus prepared into acellular urethras; another ten urethras were fresh, without any acellular treatment. Acellular urethras were implanted into the back of ten Wistar rats, while fresh urethras into another ten rats. 6 weeks after transplantation, the specimens were harvested for gross and histological observations.
RESULTS AND CONCLUSION: After acellular or fresh urethras were implanted into the rats, no autotomy was observed, the incision healed well, the diet and activities of the rat were normal, and no ulcer formation was found. At 6 weeks, tissue membrane formed around the acellular urethra, while no formation was visible around fresh urethra by gross observation. Hematoxylin-eosin staining showed that, acellular urethras were gradually absorbed and replaced by smooth muscular tissue. And unequal blood vessels grew in the acellular urethra, even formed blood sinusoid. In the control group, the urethras were not absorbed and no blood vessels were grown. The acellular urethras can gradually form normal urethra in rats, indicating that the acellular urethral autograft has a lower antigenicity and can replace the cavernous body of normal urethra.

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Key words: urethra, transplantation, homologous, immunity

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

目前由于许多先天疾病或后天因素，导致尿道缺损或严重狭窄者在临床上并不少见。除先天性畸形外，细菌性炎症、非细菌性炎症、肿瘤、医源因素等各种原因均可导致尿道损伤，这些疾病的中后期常常需要进行尿道的修复和重建^[1]。一些异体器官、自体组织及人工合成材料等曾被应用于填充修复，如：阴茎包皮、膀胱黏膜、臀部皮肤、小肠、大肠、大网膜等。自体组织器官是临床医生最常使用的替代材料，但在临床使用后常伴有不同程度的并发症，如尿道狭窄、闭塞、形成泌尿系结石、严重感染等，有时甚至导致修复失败，这种拆东墙补西墙的方法，给患者造成了额外的痛苦。使上述办法在治疗中受到了很大的限制；而同种异体移植组织因其来源有限，且易发生免疫排斥反应，同时还存在伦理道德方面因素，在一定程度上也限制了它在临床上的广泛使用；这就使寻找新的组织替代材料成为人们关注的焦点。有人最早在重建尿道组织中尝试采用了细胞外基质、聚明胶海绵、胶原基质、乙烯海绵、树脂喷雾纸和硅酮等材料进行替代修复，但这些替代材料普遍存在着功能学、力学、组织结构、或生物相容性等方面的缺陷，从而导致移植的失败，造成严重并发症，故目前未能被临床所采纳^[2]。因此需要研究开发一种无论在器官功能上，还是在组织结构上，都与缺损尿道相一致的新型组织工程材料。早在10年前Campodonico^[3]首次提出了应用“组织工程” 技术进行尿道修复的设想，这一理念一提出就备受临床医生和科学家的关注。其理论模式就是首先在体外构建一个有生物活性的“支架”也就是细胞外基质，然后将其植入受者体内，以便修复受者缺损、替代病变组织的功能，进而达到提高患者生活质量、延长患者寿命的目的^[4]。尿道组织工程技术则利用正常的平滑肌组织、制备出细胞外基质，进而构建形成新的组织工程尿道。

最早在英国对同种异体组织移植的免疫排斥反应的本质进行研究的是著名生物学家Stack^[5]。他采用家兔皮肤进行同种异体移植实验，提出了移植排斥反应的实质是受者免疫系统对供者移植物抗原的免疫应答反应^[6]。而某些特殊组织器官的移植，如干细胞移植，角膜移植，次要组织相容性抗原也发挥一定的作用^[7]。介导同种异体移植免疫排斥反应的主要效应细胞是T淋巴细胞，T淋巴细胞介导的细胞免疫应答在移植排斥免疫反应的效应机制中发挥关键作用。受者体内的反应性T淋巴细胞可通过直接或间接的途径识别同种异体主要组织相容性复合体提成抗原^[8]，不同记忆的T淋巴细胞可能通过交叉免疫反应而参与排斥反应的发生^[9]。

目前降低同种异体移植免疫排斥反应的方法有以下4种：

(1)对供者移植物和受者进行预处理。对供者移植物的预处理包括两大方面：①清除移植物中的免疫细胞如T淋巴细胞等，有助于减轻或预防宿主抗移植物免疫排斥反应的发生^[10]。②紫外线照射、超低温冻存、化学试剂如Triton X-100液等对移植物进行的处理，这在一定程度上降低了移植物的免疫原性，减轻了排斥反应的发生^[11] 。

(2)诱导免疫受者的耐受。即：诱导受者产生针对供者移植抗原的特异性免疫耐受，而减少或降低免疫排斥反应的发生。目前诱导同种异体移植免疫耐受的方法有很多，但是多数仍处于实验研究阶段，尚不能应用于临床，而器官移植中诱导完全的免疫耐受也存在耗时较多的问题，这严重的限制其在临床上的应用^[12]。

(3)配型。配型：即供者与受者之间的HLA尽可能的相同或相符，进而达到降低移植物的免疫原性。大量临床及实验资料表明，组织器官移植成功与否的关键取决于供者、受者间的组织相容性，即配型是否相同，但此方法具有不可预测性，在无关个体中，HLA相同的个体是十分罕见的(约1/100 000)^[13]。所以该法实际应用中也不太可行。

(4)使用免疫抑制剂。免疫抑制剂能够有效的抑制受者免疫应答反应能力，强力高效的免疫抑制剂药物的应用，使移植物的存活率有了很大的提高。但目前应用的免疫抑制剂也存在较大的弊端，长期服用对肝肾毒性较大，存在诱导肿瘤发生的危险，且可能发生难以控制的感染如巨噬细胞病毒感染等^[12]。并且患者的经济负担也较重。

为此，本课题应用尿道趋化性再生原理和技术对大鼠尿道缺损进行修复研究，期望能提高尿道再生速度，改进再生尿道选择性对接，达到提高尿道修复效果的目的。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年6月在辽宁医学院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性3月龄SPF级SD大鼠20只，体质量280-300 g，用于取材。3月龄SPF级Wistar大鼠20只，体质量300-320 g。实验动物由解放军总医院实验动物中心提供(许可证号：SCXK京2009-2007)。

实验方法：

去细胞异体尿道的制备：取20只SD大鼠用100 g/L水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后切取尿道每根长约1 cm共20根，其中10根仔细剔除尿道外脂肪﹑血管及结缔组织，室温下于PBS复水，进行化学去细胞处理，蒸馏水浸泡12 h(20 ℃)在3 g/L Triton-100溶液萃取12 h(20 ℃，110 r/min)，蒸馏水清洗3次，用4 g/L脱氧胆酸钠溶液萃取12 h(20 ℃， 110 r/min)蒸馏水清洗3次，取出萃取后的尿道外观略呈乳白色^[3]。置入无菌PBS(pH 7.4)，5 ℃冰箱保存。另外10根不做去细胞处理为新鲜尿道。

去细胞尿道皮下埋植：取20只Wistar大鼠用100 g/L水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，取俯卧位，四肢外展固定于实验台上，常规消毒，切开背部皮肤，随机取10只大鼠在皮下植入一段1 cm长的化学去细胞尿道；另外10大鼠在皮下植入1 cm长未经去细胞处理的新鲜尿道^[4-5]。

大体行为学观察：尿道埋植后6周，观察实验动物的切口愈合，饮食饮水情况，有无自嗜肢体现象及足底溃疡发生。

Hoechst-33258荧光染色：每只SD大鼠取下的尿道进行切片染色，室温放置30 min后丙酮进行固定，PBS进行冲洗，滴加Hoechst-33258荧光染色^[7]。在荧光显微镜下进行观察^[6]。

苏木精-伊红染色： ①苏木精染色液染色5 min，水洗至切片返蓝。②伊红液染色5 min。③乙醇脱水。④透明、封固、镜检^[7]。

主要观察指标： ①大鼠行为学观察。②大鼠植入尿道Hoechst-33258荧光染色。③大鼠植入尿道苏木精-伊红染色结果。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软包进行分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05差异有显著性意义。

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讨论

许多先天畸形和某些后天因素均可造成尿道缺损、狭窄和功能不全。并且临床上还尚缺乏较理想的修复替代材料，故尿道修复重建一直是困扰泌尿外科医生的一大难题^[14]。尽管多种组织替代材料被应用于尿道修复和重建，但各类材料各有其优势和弊病^[15]。早在20年前修复尿道缺损大都应用自体组织，如泌尿生殖系或非泌尿生殖系皮片，如阴茎包皮、膀胱黏膜片、口腔黏膜片等，这种方法需要额外附加手术，给患者增加不必要的经济负担，并且这种修复方法造成患者较多并发症，增加了患者的痛苦^[16]。而且有些替代材料还能带来如毛发生长、移植物皱缩、移植物坏死、形成泌尿系结石、尿路狭窄、膀胱憩室、尿道口粘连、尿道闭塞、尿道黏膜腺性增生等多种并发症，进而造成手术失败，使患者难以接受，这就促使临床医生去研究更为理想的替代修复材料^[17-18]。从而使先天结构异常或后天获得性疾病而导致的尿道缺损恢复正常。

近些年，组织工程技术的飞速发展和人工可降解生物材料的迅速崛起，为病变组织、损伤器官的修复提供了新的技术理念和方法^[19]。目前有很多种生物材料被研发和应用，其中以人工合成的生物材料，尤为受到关注，主要因为它具有生物相容性好、且取材丰富、来源广泛，可根据患者的需要进行改造等优点，所以在组织工程修复领域中占有重要地位^[20]。

由于去细胞尿道上的免疫细胞(如T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等)是否残存，决定了免疫排斥反应是否发生，以及免疫排斥反应的程度强烈与否，所以这一步骤决定整个实验的成败^[16]。本实验制备的去细胞尿道，主要是将供体尿道通过特殊的去细胞(triton-100)处理，去除了原尿道上的免疫细胞，且保留了胶原蛋白、蛋白多糖、等低免疫原性物质，同时还保留了各种生物因子。具有原有组织保留完整的特点，还具备组织相容性好等优点。

Eltahawy等^[21]应用混合液等处理兔尿道7 d，组织病理学染色观察尿道基质组织中未见免疫细胞成分残存，而且兔尿道中弹力纤维及胶原排列规则，管腔光滑完整，并且组织结构保留良好，上述方法证明去细胞尿道基质制备的可行性^[22-26]。

化学去细胞尿道制备公认原则是在保留弹力纤维及胶原蛋白完整的前提下^[21,27]，并尽可能的去除尿道中的免疫细胞，要求制备出去细胞尿道都需证明无免疫细胞残存。实验主要采用酶TritonX-100消化、化学去污剂脱氧胆酸钠、三烝水等三联合的方法制备脱细胞尿道，行组织学检查及33258免疫荧光染色均未见免疫细胞残存，并且去细胞尿道呈网状结构，组织结构保留完好。在制备的3个步骤中均反复采用机械振荡的方法，同时还应用大量的三蒸水冲洗，更有利于组织深层的细胞脱出并随同细胞碎屑冲洗入残液中去，进而达到彻底去细胞的目的，该方法制备的脱细胞尿道效果较为理想，为下一步用去细胞鼠尿道修复大鼠尿道整段缺损研究打下了良好的实验基础^[9]。

目前对去细胞尿道的组织相容性评价包括两方面^[22]：一是体外试验，首先对材料进行大体评估；二在生长代谢方面进行评估。实验通过病理学染色观察，去细胞尿道植入大鼠皮下后部分尿道被吸收，再生血管长入去细胞尿道内并有血窦形成倾向，而对照组未见再生血管生长及无尿道被吸收，说明去细胞尿道能形成和正常尿道相似的组织结构。再次证明了化学去细胞尿道的免疫原性弱，组织相容性比同种异体未经去细胞处理尿道好等优点，进而为再造有功能尿道提供了组织学依据。

尿道损伤后的修复最终目的是功能上的恢复。因此大体行为学观察是最为直接的评价方法，更能反映功能的恢复情况。实验的行为学观察显示，Wistar大鼠在皮下埋植尿道后均无自嗜肢体现象，切口愈合良好，饮食正常，及无溃疡发生，无植入物排出现象。取出植入大鼠皮下的尿道及周围组织可见去细胞尿道周围有组织膜形成并且部分被吸收，而未去细胞尿道未见组织膜形成没有被吸收。苏木精-伊红染色可见去细胞尿道周围有血管形成而未去细胞尿道周围无血管形成。说明去细胞尿道与未经去细胞处理的尿道相比具有更好的组织相容性。

尿道海绵体和阴茎海绵体是男性尿道的支持结构同时也是男性尿道血供的主要来源^[16]。去细胞尿道替代自体尿道修复重建中，具有尿道结构保存完整，且还克服了单纯黏膜组织替代强度和韧度不足等缺陷，而且能最大程度的恢复尿道生理功能，有望为泌尿外科临床治疗开辟新的道路和提供新的临床思维。

总之，实验结果证明化学去细胞同种异体尿道移植可有效修复尿道缺损，表明同种异体尿道，经正确处理后可以成为自体尿道移植的替代物，为临床修复尿道缺损提供了新的途径。

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