坐骨神经瓦勒变性大鼠许旺细胞生物学特性及分泌功能变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明外周神经损伤后，许旺细胞在基底膜管内形成Bunger带，引导再生轴突延伸，但具体作用机制目前尚不清楚。
目的：观察大鼠坐骨神经损伤后瓦勒变性对许旺细胞生物学特性及分泌功能的影响。
方法：建立大鼠坐骨神经横切模型，分为坐骨神经瓦勒变性组(坐骨神经横断组)和手术对照组。采用神经段单酶消化法分离培养许旺细胞，光镜下观察细胞形态变化，S-100免疫荧光鉴定。取第1代许旺细胞，利用计数法绘制14 d内许旺细胞的生长曲线，MTT法检测14 d内许旺细胞增殖活性，酸性磷酸酶法检测许旺细胞黏附能力，ELISA法检测神经生长因子浓度。
结果与结论：坐骨神经段培养第14天，坐骨神经横断组神经段边缘可见大量许旺细胞，呈线形排列；手术对照组许旺细胞数量少，呈散在分布，两组许旺细胞S-100均呈阳性表达。许旺细胞传代培养第3天，两组许旺细胞均进入对数增长期，随时间延长，细胞数及细胞增殖吸光度值均呈上升趋势，坐骨神经横断组细胞数及增殖吸光度值明显高于手术对照组(P < 0.05)；坐骨神经横断组许旺细胞黏附能力明显高于手术对照组(P < 0.05)；ELISA法检测示，坐骨神经横断组神经生长因子浓度在培养第4，6，8，10，12，14天时均高于手术对照组(P < 0.05)。结果表明大鼠坐骨神经损伤后两三周，瓦勒变性对许旺细胞生物学功能具有显著影响，可诱导许旺细胞幼稚化，促使许旺细胞在短期内迅速分裂增殖，并分泌大量神经营养因子及细胞外黏附成分，为再生轴突的延伸提供适宜的神经微环境；并增加细胞黏附能力，为外周神经损伤修复提供适宜的神经微环境。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 坐骨神经, 瓦勒变性, 许旺细胞, 神经生长因子, 生物学特性, 酸性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that Schwann cells form a Bunger band in the basement tube and guide the extension of regenerating axons after peripheral nerve injury, but the exact mechanism remains to be explored.
OBJECTIVE: To explore the effect of Wallerian degeneration on biological characteristics and secretory function of Schwann cells in rats with sciatic nerve injury.
METHODS: A rat model of sciatic nerve injury was established and divided into two groups: sciatic nerve transection group and surgical control group. Schwann cells were isolated and cultured from sciatic nerve segments by one enzyme digestion. The cell morphology was observed under light microscope and S-100 protein expression was determined by immunofluorescence staining. After subculture, the first generation of Schwann cells were chosen to draw the growth curve by the counting method within 14 days. The cell activity was detected by MTT assay. The adhesion of Schwann cells was examined by acid phosphatase analysis and the concentration of nerve growth factor was detected by ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: At 14 days after primary culture, a great number of Schwann cells were observed near the edges of nerve segments in the sciatic nerve transection group, but only small number of Schwann cells scattered around nerve segments in the control group. Schwann cells in both groups showed S-100 positive expression. At 3 days after subculture, Schwann cells reached the logarithm proliferative phase, the cell number and proliferation absorbance values in both groups were increased along with time extension. Furthermore, the number of Schwann cells and absorbance value in the sciatic nerve transection group were significantly higher than those of control group (P < 0.05). The adhesion ability in the sciatic nerve transection group was also significantly higher than those in the control group (P < 0.05). ELISA results showed that, the concentrations of nerve growth factor in the sciatic nerve transection group were significantly higher than those in the control group at 4, 6, 8, 10, 12 and 14 days (P < 0.05). After sciatic nerve injury, Wallerian degeneration can induce Schwann cells dedifferentiate into the precursors, significantly influence the biological function of Schwann cells, promote the proliferation of Schwann cells within the short term, secrete large amounts of neurotrophic factors, enhance cell adhesion, and provide a suitable microenvironment for regenerated axons. In addition, it creates the necessary microenvironment for peripheral nerve regeneration.

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Key words: sciatic nerve, nerve growth factor, Schwann cells

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 大鼠许旺细胞分离培养及鉴定坐骨神经横断组，原代培养第5天，局部有许旺细胞从神经段边缘爬出；第7天可见典型许旺细胞，胞体细长呈极性生长；第14天细胞数量显著增多，呈线状排列，细胞端与端连成长串(图1A)；手术对照组，许旺细胞增殖缓慢，在原代培养第14天时，神经段边缘可见少许三极或多极散在分布许旺细胞(图1B)；传代培养第7天，坐骨神经横断组许旺细胞分裂增殖旺盛，呈涡流状排列或编织袋状生长(图1C)。手术对照组许旺细胞形态呈梭形，突起细长呈肩并肩状生长(图1D)。S-100免疫荧光鉴定，两组许旺细胞均呈阳性，胞体呈梭形，两端伸出纤长突起(图1E、F)。

2.2 许旺细胞生长曲线传代培养第3天，两组许旺细胞均进入对数增长期，随时间延长，许旺细胞生长速度逐渐加快，从培养第11天开始许旺细胞生长进入平台期。传代培养前1，2 d，两组许旺细胞数比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；在培养第3，4，5，6，7，9，10，11，12，13，14天，坐骨神经横断组许旺细胞数明显多于手术对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 许旺细胞增殖活性检测许旺细胞传代培养第2天，两组A值比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；传代培养4，6，8，10，12，14 d，坐骨神经横断组A值显著高于手术对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表1)。

2.4 许旺细胞黏附能力检测许旺细胞传代培养后 4 h，坐骨神经横断组吸光度(A)值为0.736±0.059，手术对照组吸光度(A)值为0.631±0.053，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，表明瓦勒变性可显著增加许旺细胞黏附能力。

2.5 神经生长因子浓度检测许旺细胞传代培养第2天，坐骨神经横断组神经生长因子浓度与手术对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；在传代培养4，6，8，10，12，14 d，坐骨神经横断组神经生长因子浓度均显著高于手术对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

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引言

外周神经损伤修复和神经残端支配区功能重建一直是临床研究的难题。坐骨神经损伤后，其远端轴突和髓鞘发生瓦勒变性，许旺细胞呈现幼稚化而重新获得分裂增殖能力，参与清除轴突溃变碎片，并在基底膜管内形成Bunger带，引导再生轴突延伸，最终形成新的髓鞘；同时许旺细胞还分泌多种神经生长因子促进轴突向远端生长，并与再生轴突形成缝隙连接和紧密连接，从而促进坐骨神经功能的恢复^[1-2]。研究表明，Bunger带-许旺细胞-基底膜结构是外周神经再生所必需的微环境，这一结构在神经损伤后两三周形成^[3-4]。Torigoe等^[5-6]研究发现，在大鼠坐骨神经神经损伤数小时后，近断端神经纤维许旺细胞可大量增殖，并分泌多种神经生长因子，如神经生长因子，促进神经损伤修复，形成索状细胞带。

外周神经损伤后残端修复与再生依赖于神经周围微环境。在神经损伤局部，许旺细胞分裂增殖形成Bunger带，并分泌多种神经营养因子，形成髓鞘引导轴突再生，从而促进损伤神经功能的恢复^[7-8]。因此，许旺细胞及其神经营养活性物质在外周神经损伤修复中的作用已成为神经生物学研究热点^[9]。

1850年，Waller^[10]最早报道了周围神经损伤后，损伤远端的神经纤维全长及近端长度不等的髓鞘和轴突崩解破坏，即瓦勒变性。随后，损伤近端的轴突出芽、延伸并与许旺细胞表面的黏附分子结合，完成轴突的再髓鞘化过程。在神经纤维再生修复过程中，许旺细胞起着极为重要的作用，包括吞噬功能，为神经纤维的再生提供支架以及分泌各种神经生长因子等。赵富强等^[11]研究发现，周围神经损伤后远端神经内许旺细胞在48 h后开始增生，在1周左右达到高峰，增加6-8倍，且以非成髓鞘许旺细胞为主。

本实验通过大鼠坐骨神经横切模型，探讨瓦勒变性对许旺细胞形态、分裂增殖能力、神经生长因子特定蛋白表达及细胞外黏附成分的影响，旨在为临床应用许旺细胞治疗外周神经损伤治疗提供理论依据。

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材料方法

设计：动物实验，细胞学观察。

时间及地点：实验于2013年6至11月在牡丹江医学院完成。

材料：

实验动物：SD大鼠20只，2月龄，雌雄不限，体质量(300±20) g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(黑)2012-010，昼夜12 h交替光照，自由食水，室温(20±2) ℃条件下饲养。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

大鼠坐骨神经横切模型的建立：20只SD大鼠随机数字表法分为坐骨神经横断组(n=10)和手术对照组(n=10)。坐骨神经横断组，取SD大鼠，戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌条件下暴露左侧坐骨神经，于坐骨切迹远侧 5 mm处横断坐骨神经，以5-0尼龙线分别结扎两断端，并将远端神经断端埋植于股二头肌中，防止两断端粘连，然后逐层缝合肌肉，浅筋膜和皮肤，同时肌注青霉素1×10⁴ U连续3 d。将饲料、饮水置于动物可及范围，保持垫料干燥。手术对照组，麻醉、手术入路、术后处置方式同坐骨神经横断组，暴露左侧坐骨神经，不横断损伤。

大鼠许旺细胞分离培养及鉴定^[9]：术后第7天，重新暴露两组大鼠术侧坐骨神经，分别切取10 mm远端坐骨神经，体式显微镜下剥离神经外膜，剪成1 mm小段，0.08% Ⅳ型胶原酶37 ℃消化20 min。将神经段植于60 mm培养皿(未涂多聚赖氨酸)，相互间隔3 mm，加H-DMEM培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，第3天半量换液。第6，12天，将神经段移于涂有多聚赖氨酸的培养皿中，分别更换含2.5%和体积分数10%胎牛血清的H-DMEM培养基，倒置相差显微镜观察许旺细胞形态变化。待许旺细胞铺满培养皿80%时，进行传代培养，观察两组许旺细胞生长情况；取传代培养第1天许旺细胞，以S-100免疫荧光鉴定。

许旺细胞生长曲线绘制：取第1代许旺细胞，按 0.7×10⁴/孔接种于2块96孔培养板，每组84孔/板，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。接种后每天上午8:00，各组随机取6孔，PBS洗2次，0.1%胰蛋白酶消化3 min；弃去胰蛋白酶，每孔加H-DMEM培养基200 μL吹打使细胞完全分散后，取10 μL细胞悬液加入血球计数板计数室内；在低倍镜下(10倍)计数四角中方格内的许旺细胞数，重复计数3次，取其平均值，计算各组细胞数。连续计数14 d，绘制许旺细胞生长曲线。

许旺细胞增殖检测：将许旺细胞接种至7块96孔培养板中，每组8孔/板，另设8孔作为空白对照，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。隔日上午8:00，随机抽取1块培养板，吸弃培养液；每孔加入MTT 10 μL及H-DMEM培养基90 μL；置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育 4 h，吸去MTT液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡 15 min，在酶标仪570 nm处测量吸光度(A)值，分别于细胞接种第2，4，6，8，10，12，14天进行检测。

许旺细胞黏附实验：将许旺细胞接种至1块96孔板中，每组接种8孔，另设8孔作为空白对照，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养4 h；用H-DMEM轻柔冲洗3次除去未贴壁的许旺细胞，加入酸性磷酸酶底物工作液(0.2 mol/L乙酸钠缓冲液，含2 g/L Triton X-100、20 mmol/L硝基苯磷酸盐，pH 5.5)，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；加1 mol/L NaOH 10 μL/孔终止反应，室温放置10 min；在酶标仪405 nm处检测每孔吸光度(A)值。实验重复3次。

神经生长因子浓度检测：将许旺细胞接种至7块96孔板中，每组8孔/板，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。于接种第2，4，6，8，10，12，14天上午8:00，随机抽取1块培养板分别吸取两组许旺细胞培养液，以离心半径 12 cm、1 000 r/min离心5 min后取上清，根据ELISA试剂盒说明操作，测定两组许旺细胞上清中神经生长因子浓度。

主要观察指标：大鼠坐骨神经瓦勒变性对许旺细胞形态学、分裂增殖、细胞外黏附成分以及神经生长因子蛋白表达的影响

统计学分析：数据以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件分析数据，组间比较采用独立样本t 检验，显著性检验水准为P < 0.05。

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讨论

为了研究神经损伤后许旺细胞的变化的规律以及瓦勒变性对许旺细胞生物学特性的影响，在实验中作者采用横断损伤7 d的大鼠坐骨神经段进行许旺细胞培养，观察瓦勒变性对许旺细胞分裂增殖以及分泌功能的影响。

周围神经损伤后，损伤端神经纤维发生瓦勒变性，诱导许旺细胞幼稚化进入增殖状态，分泌多种具有支持神经元存活、轴突再生的神经营养因子神经营养因子，形成一个有利于神经再生的微环境，促进神经功能恢复^[2]。Li等和付国强等^[12-13]研究认为，外周神经损伤后，许旺细胞可去分化形成许旺细胞前体细胞，在短时间内分化增殖生成大量许旺细胞，参与吞噬髓鞘碎屑和形成Bunger带，引导轴突再生。实验结果显示，切取横断损伤1周成年大鼠坐骨神经分离许旺细胞，在培养第5天时，许旺细胞即可从神经段边缘爬出，培养第14天可见大量呈极性生长许旺细胞；而切取未受损坐骨神经分离许旺细胞时，培养14 d仅有少量许旺细胞散在分布或呈线形排列于神经段边缘。由此可见，当外周神经损伤后，瓦勒变性可促进许旺细胞幼稚化，在短期内快速分裂增殖。

本实验通过细胞计数和MTT法观察传代后许旺细胞的生长增殖情况，确定瓦勒变性对许旺细胞生物学特性的影响。文献报道，许旺细胞在神经元存活和神经纤维正常功能维持中发挥重要作用^[14]。作为外周神经系统特定的胶质细胞，许旺细胞参与髓鞘形成，包绕轴突并引导神经元定向生长。周围神经损伤后，神经组织发生瓦勒氏变性，远端轴索及髓鞘损伤后数小时即发生结构改变，逐渐分解成小段或碎片。此时，许旺细胞迅速进行有丝分裂，参与吞噬清除碎裂溶解的轴索和髓鞘，并引导再生轴突长入许旺细胞形成的鞘中^[15]。许旺细胞生长曲线和MTT结果均显示，许旺细胞在传代培养第3天进入对数增殖期，在培养第4-11天快速分裂，且坐骨神经横断组许旺细胞生长速度和增殖活性明显快于手术对照组。实验结果进一步证实，当外周神经损伤后，许旺细胞通过去分化机制快速参与神经损伤的修复过程。

许旺细胞在分裂增殖过程中可分泌多种细胞外基质成分，形成类似髓鞘的神经内膜管，为再生轴突的延伸和生长提供隧道。细胞外基质中的非胶原糖蛋白，层黏连蛋白和Ⅳ型胶原、着位素、硫酸乙酰肝素以及其他糖蛋白相结合，构成许旺细胞附着的基本框架和代谢场所，这对于维持基膜的正常结构与功能、许旺细胞包绕轴突形成髓鞘、促进周围神经再生具有非常重要的意义^[16-17]。本实验通过酸性磷酸酶检测许旺细胞黏附特性显示，当外周神经损伤后，许旺细胞可分泌多种细胞外基质成分，为再生轴突的延伸提供必要的神经微环境。

神经生长因子是神经营养因子家族中最早发现的神经生长调节因子，对胚胎发育以及对神经嵴起源的神经元功能的维持具有重要作用^[18-19]。研究表明，神经损伤后局部神经生长因子分泌水平明显增高，有利于神经再生。外周神经损伤局部神经生长因子主要来源于局部增殖的许旺细胞^[20]。有文献报道，神经生长因子mRNA在神经受损后迅速增高^[7]，持续高表达一两周，这与本实验检测结果相一致。本实验结果显示，采用正常坐骨神经体外培养许旺细胞，培养液上清中神经生长因子含量很低，提示当外周神经在未受到损伤正常情况下，许旺细胞合成的神经生长因子蛋白很少。然而，这种低水平表达状态在坐骨神经横断后1周发生了急剧改变，神经生长因子水平迅速增高，达到了正常水平的2.0倍，并且这种升高持续一两周。

综上所述，外周神经损伤后，其远端轴突和髓鞘发生瓦勒变性可诱导许旺细胞幼稚化^[21-26]，在短期内迅速分裂增殖，分泌大量神经营养因子和细胞外黏附成分，并增加细胞黏附能力，为外周神经损伤修复提供适宜的神经微环境^[27-32]。

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