突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (24): 3878-3884.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.018

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突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

胡永波，高励，王丹，曾仲，徐朝义，肖兵，骆飞飞，杨志勇，周嫱

成都市第三人民医院，重庆医科大学附属成都第二临床学院神经内科，四川省成都市 610031

修回日期:2014-04-23 出版日期:2014-06-11 发布日期:2014-06-11
通讯作者: 高励，主任医师，教授，硕士生导师，成都市第三人民医院，重庆医科大学附属成都第二临床学院神经内科，四川省成都市 610031
作者简介:胡永波，男，1978年生，重庆市人，汉族，2011年重庆医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事抑郁症突触蛋白分析及发病机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(81101009)

Optimization of two-dimensional gel electrophoresis for synaptic proteomics

Hu Yong-bo, Gao Li, Wang Dan, Zeng Zhong, Xu Chao-yi, Xiao Bing, Luo Fei-fei, Yang Zhi-yong, Zhou Qiang

Department of Neurology, the Third People’s Hospital of Chengdu & the Second Affiliated Hospital of Chengdu, Chongqing Medical University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China

Revised:2014-04-23 Online:2014-06-11 Published:2014-06-11
Contact: Gao Li, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Neurology, the Third People’s Hospital of Chengdu & the Second Affiliated Hospital of Chengdu, Chongqing Medical University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China
About author:Hu Yong-bo, Ph.D., M.D., Attending physician, Department of Neurology, the Third People’s Hospital of Chengdu & the Second Affiliated Hospital of Chengdu, Chongqing Medical University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81101009

摘要/Abstract

摘要：

背景：双向电泳是突触蛋白质组学分析中最流行最通用的蛋白质分离方法之一。但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis，SDS-PAGE)浓度的选择很多，尚未见统一标准。
目的：对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化，以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱。
方法：以大鼠海马突触蛋白为试材，比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条，线性与非线性pH 3.0-10.0 IPG胶条，以及单一浓度10%与12% SDS-PAGE对双向电泳的影响。此外，还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献，对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价，并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征。
结果与结论：结果表明，使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10% SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜，电泳图谱质量好，实验操作便利；同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条，以及线性梯度浓度9%-16% SDS-PAGE凝胶，也适用于突触蛋白双向电泳分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 突触, 双向电泳, 蛋白质组学, IPG胶条, SDS-PAGE, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Two-dimensional electrophoresis (2-DE) is one of the most popular methods of protein separation in synaptic proteomic analysis. However, there was no agreed standard on selection of immobilized pH gradients (IPG) strips and concentration of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in the research literature on 2-DE of synaptic proteins.
OBJECTIVE: To optimize IPG strips and concentration of SDS-PAGE in 2-DE for synaptic proteomic analysis, and to get high-quality 2-DE maps of synaptic proteins.
METHODS: Rat hippocampal synapses were adopted in this experiment to compare the effect of 2-DE, which were involved with IPG strips with the linear range of pH 5.0-8.0 and pH 3.0-10.0, IPG strips with the linear and nonlinear range of pH 3.0-10.0, as well as single 10% and 12% SDS-PAGE. Meanwhile, a computer-based online search of PubMed (1989/2013) and CNKI (1989/2013) was performed for the articles about 2-DE of synaptic proteins. The selection of IPG strips and concentration of SDS-PAGE in the research literature were summarized and evaluated, and the distribution characteristics of the synaptic proteins in 2-DE maps of IPG strips with various pH range and SDS-PAGE gels with different concentration were summarized.
RESULTS AND CONCLUSION: The results demonstrated that the synaptic proteins were well separated conveniently and obtained high quality 2-DE maps by nonlinear IPG strips range of pH 3.0-10.0 and single 10% SDS-PAGE gels. At the same time, it was also recommended that combination use of IPG strips range of pH 4.0-7.0 and pH 6.0-11.0, as well as linear gradient 9-16% SDS-PAGE gels. They were all suitable for 2-DE of synaptic proteins.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: synapses, two-dimensional gel electrophoresis, proteomics, SDS-PAGE, rats

中图分类号:

R318

胡永波，高励，王丹，曾仲，徐朝义，肖兵，骆飞飞，杨志勇，周嫱. 突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(24): 3878-3884.

Hu Yong-bo, Gao Li, Wang Dan, Zeng Zhong, Xu Chao-yi, Xiao Bing, Luo Fei-fei, Yang Zhi-yong, Zhou Qiang. Optimization of two-dimensional gel electrophoresis for synaptic proteomics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(24): 3878-3884.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠海马突触超微结构 大鼠海马匀浆样品在超速离心管中形成了4个条带，位于1.0-1.2 mol/L蔗糖溶液区间的条带为突触组分，随后的透射电镜检测进一步表明该组分确实为海马突触，见图1。

2.2 不同条件下进行的突触蛋白双向电泳图比较 实验共进行了两组突触蛋白双向电泳，第一组使用17 cm的pH 3.0-10.0 L、17 cm的pH 5.0-8.0 L IPG胶条，单一浓度 12% SDS-PAGE凝胶，700 μg蛋白质上样量，考马斯亮蓝染色(图2A，B)；第二组使用pH 3.0-10.0 NL、pH 5.0-8.0 L 17 cm IPG胶条，单一浓度10% SDS-PAGE凝胶，120 μg蛋白质上样量，硝酸银染色(图2C，D)。

首先，实验对窄谱(pH 5.0-8.0)和宽谱(pH 3.0-10.0) IPG胶条突触双向电泳图进行了比较。从图2中可看出，IPG 胶条两端区域均存在横条纹，但窄谱(pH 5.0-8.0)较宽谱 (pH 3.0-10.0)胶条两端横条纹明显要少些。此外，经双向电泳分析软件PDQuest 2-DE 8.01分析，窄谱(pH 5.0-8.0)胶条(图2D)分离出效蛋白质点1 560±22个，宽谱(pH 3.0- 10.0)IPG胶条(图2C)分离出有效蛋白质点1 370±19个。也就是说，窄谱(pH 5.0-8.0)相对于宽谱(pH 3.0-10.0)胶条，虽然pH范围变窄，但因展示了部分重叠的蛋白质点，蛋白点的数量不但没有下降，反而平均值还增加了13.84%。从电泳图比较中还看到，窄谱(pH 5.0-8.0)胶条双向电泳图谱效果好，蛋白分离充分、蛋白点圆润、背景清晰，更有利于图谱的分析与比较。不足之处是会损失窄谱pH范围外的突触蛋白点。

其次，实验对10%与12%两种不同单一SDS-PAGE凝胶浓度对突触蛋白分离的影响进行了比较。可以看出，第二向电泳采用10% SDS-PAGE(图2C，D)和12% SDS-PAGE凝胶(图2A，B)，蛋白点展示的相对分子质量范围更广，蛋白点分离得更充分。10% SDS-PAGE凝胶分离的蛋白相对分子质量在20 000-170 000的范围内，蛋白点可在整张凝胶上充分展开，而12% SDS-PAGE凝胶分离的蛋白分子量主要集中于14 400-66 200狭窄区域内，多数蛋白点紧密聚集于分子量为35 000-66 200间狭小的凝胶区域，难于分辨。

最后，实验比较了线性和非线性宽谱(pH 3.0-10.0) IPG胶条对突触蛋白分离的影响。从图2A，C的比较中不难看出，突触蛋白质等电点大多数还是集中于中段pH范围(pH 5.0-9.0)内，使用非线性pH 3-10 IPG胶条，较线性胶条更能充分展开等电点处于中段pH范围内的突触蛋白。

2.3 突触蛋白双向电泳文献对IPG胶条和SDS-PAGE浓度的选择 通过突触蛋白双向电泳相关文献查询，在PubMed数据库中查询到外文文献255篇，在CNKI数据库中查询到中文文献27篇，经阅读，筛选出以突触(排除突触亚组分：突触膜、突触后致密物和突触囊泡)为样品，进行IEF/SDS-PAGE双向电泳的文献有14篇。从表1中可看出，对于IPG胶条的选择，绝大多数实验选择的是pH 3.0-10.0NL文章11篇^{[4, 15-24]}，少数选择了pH 3.0-10.0 L及pH 3.0-11.0 NL各1篇^[7，25]，还有1篇文献是合并使用两根pH值相重叠的窄谱IPG胶条(pH 4.0-7.0/pH 6.0-11.0 L)^[26]；而对于SDS-PAGE凝胶浓度，选择单一浓度的，5篇选择的是10%^{[4, 16, 18, 21, 23]}，2篇选择11%^{[15, 25]}、1篇选择12.5%^[17]，1篇选择13%^[26]；选择线性梯度浓度的3篇选择的是9%-16%^{[19-20, 22]}，1篇为8%-18%^[24]，1篇为11%-17%^[7]。

2.4 不同浓度SDS-PAGE凝胶对突触蛋白分离能力的比较 根据Bio-Rad公司实验操作指南(Ready Gel System RESOURCE GUIDE)上标准蛋白在不同浓度SDS-PAGE凝胶上电泳迁移分布图(图3A)，可见不同浓度(10%，12%，8%-16%，10%-20%)的SDS-PAGE凝胶对相对分子质量为0-116 000的蛋白的分离能力是不同的，10%凝胶对这些蛋白的分离最充分，但会损失大量的0-21 500的小相对分子质量蛋白；8%-16%凝胶的分离能力要大于10%-20%凝胶，尤其是对相对分子质量0-66 000的蛋白。

实际的突触蛋白双向电泳图也符合这一规律。实验从实验及文献中共选出了3个代表性浓度(10%，9%-16%，11%-17%)SDS-PAGE凝胶的突触蛋白双向电泳图，实验的10% SDS-PAGE凝胶(图2C，3B)，Buonocore等^[22]的9%-16%(接近于8%-16%)SDS-PAGE凝胶(图3C)和Witzmann等^[7]的11%-17%(接近于10%-20%)SDS-PAGE凝胶(图3D)。从3张电泳图的比较可发现，10% SDS- PAGE凝胶损失了大量0-21 500的小相对分子质量蛋白，但对于相对分子质量21 500-116 000(尤其是相对分子质量 21 500-66 000)的蛋白比9%-16%和11%-17% SDS- PAGE凝胶分离得更充分；此外，9%-16%比11%-17% SDS-PAGE凝胶对相对分子质量0-116 000(尤其是相对分子质量0-66 000)蛋白的分离更充分，且两者均极少损失小相对分子质量0-21 500的蛋白。

2.5 突触蛋白在双向电泳图中等电点和相对分子质量分布趋势 从图3B-D中突触蛋白双向电泳图还可看出，突触蛋白在双向电泳中，等电点主要集中于pH 4-9区域，分子量大多数处于0-120 000，以10 000-70 000区域最集中。其后的MALDI-TOF/TOF质谱鉴定得到突触蛋白等电点和分子量信息也证实了这一结论。例如，Witzman等^[7]进行了大鼠脑皮质突触全蛋白质组学分析(图3D)，用MALDI-TOF/ TOF质谱成功鉴定出163个突触蛋白点。实验对其成功鉴定突触蛋白的分子量和等电点信息进行了直方图分析，可以看出，突触蛋白等电点分布于pH 4-11区域(主要集中于pH 4-9，图4A)；相对分子质量分布于0-90 000(集中于10 000-70 000的范围，图4B)。又如，根据本课题组前期所做的慢性轻度应激抑郁大鼠与正常大鼠海马突触差异蛋白质组学实验数据^{[4, 27]}，实验描绘了差异表达的突触蛋白的等电点和相对分子质量散点分布图，可以看出差异突触蛋白等电点分布于 pH 4-9区域内，相对分子质量处于10 000-110 000范围，以 20 000-70 000为其分布高峰(图4C)。

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引言

蛋白质组学最早于1994年由Wilkins和Williams提出^[1]。而突触蛋白质组学是近10年才快速发展起来的细胞器蛋白质组学之一，是研究突触蛋白组成，以及各种生理、病理条件下突触蛋白可塑性变化的最重要高通量工具之一^[2]，广泛应用于阿尔茨海默病、唐氏综合征、抑郁症、精神分裂症及吗啡成瘾等疾病的突触发病机制研究^[2-5]。目前，突触蛋白质组学中蛋白质分离主要有双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis 2-DE)及液相色谱(liquid chromatography，LC)两种技术，两种技术各具优势，可形成互补^[6-7]。然而，双向电泳实验设备相对独立，可脱离质谱离线操作，费用低、操作简单，技术成熟，也是目前分辨率最高的工具之一，故广泛应用于国内外蛋白质组学实验室^[7-11]。

突触蛋白质组学及适用于该组学分析的双向电泳技术在科研中应用广泛，然而，文献中突触蛋白的双向电泳实验，对线性固相pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis，SDS-PAGE)浓度的选择很多，尚无统一标准^{[2-5, 7]}。那么，选择何种IPG胶条和浓度的SDS-PAGE凝胶，才能在双向电泳中充分分离突触蛋白，从而获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱呢？为了优化这种选择，实验提取Sprague-Dawley(SD)大鼠海马突触蛋白, 在重庆医科大学神经科学研究中心蛋白质组学平台，比较了pH 5.0-8.0线性(linear，L)、 pH 3.0-10.0 L及pH 3.0-10.0非线性(nonlinear，NL)的IPG胶条，以及单一浓度10%与12% SDS-PAGE凝胶对突触蛋白双向电泳的影响。此外，实验还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed 数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献，对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳图谱进行了统计、分析和评价，从而提出了突触蛋白双向电泳IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度选择的优化策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：蛋白质组学实验。

时间及地点：于2010年5至11月在重庆医科大学神经科学研究中心实验室完成。

材料：成年雄性清洁级SD大鼠40只，由重庆医科大学实验动物中心提供。鼠龄70天左右，体质量180-230 g，实验动物许可证号：SCXK(渝) 2007-0001。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[12]。

方法：

大鼠海马突触蛋白的提取：将SD大鼠麻醉后处死取脑组织，置于冰上的无菌纱布，眼科镊剥离出海马。按照文献[13]中突触提取方法，收集大鼠新鲜海马组织进行匀浆。差速离心后，沉淀重悬于匀浆缓冲液(0.32 mol/L蔗糖，1 mmol/L NaHCO₃，蛋白酶抑制剂cocktail，pH 7.4)中(为粗突触样品)。紧接着进行蔗糖密度梯度离心，离心管中由下至上分别铺1.2、1.0、0.85 mol/L蔗糖溶液和粗突触样品，在4 ℃下82 500×g超速离心2 h后，收集介于浓度1.0-1.2 mol/L之间突触组分。取少部分样品进行透射电镜检测，余下样品使用裂解液(7 mol/L Urea，2 mol/L thiourea，体积分数4% CHAPS，50 mmol/L DTT)进行蛋白质提取，冰上裂解1 h后离心30 min(4 ℃，40 000×g)，收集上清。将上清蛋白质样品用Clean-up试剂盒处理后，Bradford法进行蛋白质含量测定，最后置-80 ℃下保存。

双向凝胶电泳(IEF/SDS-PAGE, 2-DE)分析：突触蛋白质样品和水化液(7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，4% CHAPS，50 mmol/L DTT，0.5% IPG缓冲液，以及体积分数0.001%溴酚蓝)混合至总体积350 μL。15 000×g离心 10 min，将上清液加入胶条槽后缓慢放入17 cm IPG(pH 5-8线性，pH 3-10线性，pH 3-10非线性)预制胶条，在 20 ℃下进行等电聚焦。主要运行参数：50 V 12 h(水化)，250 V 30 min(除盐)，1 000 V 1 h(快速除盐)，1 000- 10 000 V 5 h(线性升压)，10 000 V，60 000 vh(聚焦)， 500 V(维持)。等电聚焦结束后，将胶条分别用平衡液A(0.375 mol/L Tris-HCl，6 mol/L Urea，体积分数20% glycerol，2% SDS，2% DTT， pH 8.8)和平衡液B(体积分数2.5% IAA替换2% DTT)平衡15 min后，转移至单一体积分数10%或12% SDS-PAGE凝胶上在20 ℃下进行第二向垂直电泳，在12.5 mA恒流电泳30 min后，调整电流为25 mA电泳5.0-5.5 h(10% SDS-PAGE)；或在13 mA恒流电泳 30 min后，调整电流为30 mA电泳4-6 h(12% SDS-PAGE)。为技术重复，每组双向电泳实验均重复进行3次。

染色与数据分析：按照Yan等^[14]染色方法将电泳后的凝胶置于硝酸银染液中染色，然后脱色；或将电泳后的凝胶置于考马斯亮蓝G-250染色液(体积分数0.12%考马斯亮蓝G250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇)中染色，然后脱色。使用Epson 10000XL扫描仪进行凝胶扫描后。用PDQuest Advanced 8.0.1图像分析软件依次进行点检测、背景消减、标准化、虚拟凝胶的建立、匹配、比较差异等分析。

突触蛋白双向电泳文献查询：在PubMed数据库中以主题词“synapses” OR “synaptosomes” AND “Electrophoresis， Gel， Two-Dimensional”、 “synapses” OR “synaptosomes” AND “proteomics”、 “synapses”OR “synaptosomes” AND “proteome”分别进行查询；在中国知网(CNKI)数据库中以主题词“双向电泳”或 “蛋白质组学”与“突触”、主题词“蛋白质组”与“突触”分别进行查询，对查询到的所有文献逐一阅读题目和摘要，选择以突触蛋白为样品，IEF/SDS-PAGE双向电泳方法学进行突触蛋白质组学研究的文献，获取全文，对其选择的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行统计。并根据相关文献，总结了突触蛋白在不同浓度SDS-PAGE凝胶上分布特征，以及在双向电泳图上的等电点和分子量分布范围。

主要观察指标：双向电泳实验中突触蛋白在不同IPG胶条和浓度的SDS-PAGE凝胶上分离的效果、有效蛋白点数，以及蛋白损失度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

根据实验研究结论，实验可以对突触蛋白双向电泳进行IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化。

首先，根据突触蛋白等电点主要分布于pH 4-9区域，可选择24 cm pH 3.0-10.0 NL IPG胶条。因为双向电泳时IPG胶条的两端都有横条纹，故需选择较pH 4-9两端pH范围更大的胶条以避免干扰。另外，根据实验，选择较长的(24 cm)非线性IPG胶条进行突触蛋白双向电泳^[23]，可进一步增加双向电泳分辨率。

其次，可使用pH值相重叠的窄谱IPG胶条合并使用。实验证明窄谱IPG胶条能减少2-DE图中胶条两端的横条纹、将重叠蛋白点充分展开，所以在相应的pH范围内能展示出更多的蛋白点。近年来的研究也显示了使用窄谱较宽谱IPG胶条的巨大优势^[28-29]，Robert等^[30]利用pH值为4.0-5.0，4.5-5.5，5.0-6.0和6.0-9.0一系列窄范围pH胶条分离出2 286个酵母蛋白质点，而用pH值为3.0-10.0的胶条只鉴定出755个蛋白质点。Oguri等^[31]用7种1个pH单位的窄范围IPG胶条，共分离出6 677个蛋白点，比直接使用pH值3.0-10.0的胶条分离的蛋白点提高了783.0%。选择pH值相重叠的IPG胶条合并使用，既可以发挥窄谱胶条分辨率高的优势，又可以避免损失胶条各自pH范围外的突触蛋白点，pH值重叠还可避免在2-DE上胶条两端横条纹的影响。有意思的是，Eravci等^[26]在突触蛋白双向电泳中就合并选择了pH值重叠的pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0 IPG胶条，值得实验借鉴。

最后，根据突触蛋白分子量绝大多数处于0-120 000，尤其以10 000-70 000区域最集中的特征，推荐选择单一浓度为10% SDS-PAGE凝胶进行电泳。在实验中，已经证明10%比12% SDS-PAGE凝胶更能充分展示突触蛋白。同时，文献中Buonocore等^[22]选用线性梯度9-16% SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳，对相对分子质量为0-120 000的突触蛋白分离得也较为充分，并避免了相对分子质量为 0-21 500突触蛋白的大量损失(图3C)，但线性梯度胶的配制比较繁琐，实验操作不便，对相对分子质量20 000-70 000范围的蛋白分离也不如10% SDS-PAGE凝胶充分。

总之，实验推荐使用24 cm的pH 3.0-10.0 NL IPG胶条及单一10% SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳，实验操作便利；具备条件的实验室，也推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条，以及线性梯度浓度9%-16% SDS-PAGE凝胶，虽然双向电泳实验工作量会加大，但可提高突触蛋白的分辨率和减少突触蛋白电泳损失。众所周知，双向电泳的样品宝贵、制备复杂、实验周期长、实验试剂及耗材价格较贵^[32]，实验的上述结论，可为其它突触蛋白双向电泳研究人员提供良好的方法学参考，减少实验时间和资金的浪费，得到高质量的突触蛋白双向电泳图谱，从而更加顺利的完成突触蛋白质组学研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

Optimization of two-dimensional gel electrophoresis for synaptic proteomics

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