依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (24): 3814-3820.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.24.008

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用

孙海波¹，魏俊强²，陈伟²，张英泽²，郑占乐²，潘进社²

1北京市通州区中西医结合医院骨科，北京市 101100
2河北医科大学第三医院创伤急救中心，河北省石家庄市 050051

修回日期:2014-03-25 出版日期:2014-06-11 发布日期:2014-06-11
作者简介:孙海波，男，1984年生，河北省衡水市人，2011年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事临床骨科疾病治疗方面的研究。
基金资助:
河北省自然科学基金项目(C2008000926)；延时高位断肢再植早期处理措施实验研究

Prophylactic effects of edaravone on the extremity after limb replantation

Sun Hai-bo¹, Wei Jun-qiang², Chen Wei², Zhang Ying-ze², Zheng Zhan-le², Pan Jin-she²

1Department of Orthopedics, Tongzhou District Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine, Beijing 101100, China
2Trauma Center, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Revised:2014-03-25 Online:2014-06-11 Published:2014-06-11
About author:Sun Hai-bo, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Tongzhou District Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine, Beijing 101100, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. C2008000926

摘要/Abstract

摘要：

背景：怎样减轻断肢再植后缺血再灌注损伤的严重程度，目前尚无有效方法。
目的：探讨依达拉奉能否对断肢再植术后肢体起到保护作用。
方法：根据不同的干预方法，将18只健康兔随机数字表法均分为3组(n=6)，分别为依达拉奉组、缺血再灌注组和空白对照组。建立左下肢的离断肢体模型，其中，依达拉奉组于再灌注前给予以依达拉奉为主的灌注液进行灌注(1.5 mg/kg)，分别于2，4，8，12 h于兔的胫骨前肌取材，分别测定骨骼肌超氧化物歧化酶、髓过氧化物酶、丙二醛、Ca²⁺-ATP酶、Na⁺-K⁺-ATP酶，湿质量/干质量比值，光镜下观察骨骼肌结构的病理变化。
结果与结论：缺血再灌注后兔骨骼肌的肌纤维水肿，损伤明显，大量炎性细胞浸润，依达拉奉干预后损伤程度减轻，但均随时间增加而加剧。依达拉奉能够明显提高缺血再灌注后机体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶、Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶含量，降低丙二醛、湿质量/干质量比值，各项指标差异均存在显著性意义(P < 0.05)，可见依达拉奉对断肢再植后肢体有着明显的保护作用。依达拉奉为主的混合灌注液能够有效地预防再植后肢体(特别是骨骼肌)的缺血再灌注损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 断肢(指)再植, 依达拉奉, 缺血再灌注损伤, 兔, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, there is no effective method to attenuate the severity of ischemia/reperfusion injury after limb replantation.
OBJECTIVE: To investigate the prophylactic effects of edaravone solution on extremity after limb replantation.
METHODS: According to different interventions, 18 healthy rabbits were randomly divided into three groups (n=6): edaravone group, control group and ischemia/reperfusion injury group. The replantation models in the left hindlimbs were established. In edaravone group, rabbits were perfused with edaravone solution (1.5 mg/kg) before the reperfusion. At 2, 4, 8, 12 hours, the tibialis anterior muscles tissues of rabbits were harvested, and the following levels were determined, including superoxide dismutase, myeloperoxidase, malondialdehyde, Ca²⁺-ATPase, Na⁺-K⁺-ATPase, wet weight/dry weight ratio. The morphology of tibialis anterior muscles was observed under light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After ischemia and reperfusion, the skeletal muscle fibers appeared edema and apparent damage, a large number of inflammatory cells infiltrated. After the intervention of edaravone solution, the damage was attenuated, but aggravated along the time. Edaravone solution significantly increased the level of superoxide dismutase, myeloperoxidase, Ca²⁺-ATPase, Na⁺-K⁺-ATPase, and significantly decreased the level of malondialdehyde and wet weight/dry weight ratio (P < 0.05). Edaravone solution exerts apparent protective effects on extremity after limb replantation, and can improve the ischemia/reperfusion injury in the extremity (especially skeletal muscle) after limb replantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: organ transplantation, transplantation, tibia, reperfusion injury, extremities, myoblasts, skeletal, biological markers

中图分类号:

R318

孙海波，魏俊强，陈伟，张英泽，郑占乐，潘进社. 依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(24): 3814-3820.

Sun Hai-bo, Wei Jun-qiang, Chen Wei, Zhang Ying-ze, Zheng Zhan-le, Pan Jin-she. Prophylactic effects of edaravone on the extremity after limb replantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(24): 3814-3820.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 选用健康兔18只，根据不同的干预方法分为3组，实验过程中无脱失，均进入结果分析。

2.2 骨骼肌光镜的动态观察结果

2.3 生化指标检测结果

2.3.1 超氧化物歧化酶活性的变化 超氧化物歧化酶是体内主要的氧自由基清除剂，通过不同时间点检测观察，各组均随着时间的增加，活性降低，差异均有显著性意义(P < 0.05，表1)。

2.3.2 丙二醛含量的变化 该指标为骨骼肌发生过氧化反应后的主要底物，缺血再灌注后丙二醛含量显著增加，且随时间的增加而增加，经过依达拉奉治疗后含量降低，但仍高于对照组(P < 0.05)，该指标与缺血再灌注损伤的程度呈正相关(表2)。

2.3.3 过氧化物酶含量的变化 中性粒细胞嗜天青颗粒中含量较高且恒定的酶，可反映中性粒细胞在组织内聚集的程度，缺血再灌注兔体内骨骼肌过氧化物酶含量显著增加(P < 0.05)，而经过依达拉奉保护后，个时间点指标均降低，随着时间的增加而逐渐增加，该指标与缺血再灌注损伤的程度呈正相关(表3)。

2.3.4 Na⁺-K⁺-ATP酶含量的变化 是细胞膜上的固有蛋白，其活性的下降是膜结构损伤的敏感性指标，兔缺血再灌注损伤时，Na⁺-K⁺-ATP酶含量各时间均降低，却随着时间的增加而逐渐降低，经过依达拉奉保护后，各时间点各均有所增加，但仍显著低于对照组(P < 0.0)，该指标与缺血再灌注损伤的程度呈负相关(表4)。

2.3.5 Ca²⁺-ATP酶含量的变化 是细胞膜上的固有蛋白，其活性的下降是膜结构损伤的敏感性指标，兔缺血再灌注损伤时，过氧化物酶含量显著降低(P < 0.05)，且随着时间的增加下降更多，给予依达拉奉治疗后各指标上调，但仍低于对照组(P < 0.05)，该指标与缺血再灌注损伤的程度呈负相关(表5)。
2.3.6 湿质量/干质量比值的变化 该指标反映组织水肿程度，兔缺血再灌注后水肿程度明显加剧，随时间增加而加重(P < 0.05)，但给予依达拉奉保护后不同时间湿质量/干质量比值指标均下降，但仍高于对照组(P < 0.05)，与缺血再灌注损伤的程度呈正相关(表6)。

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引言

关于断肢再植损伤机制，不少学者重视缺血再灌注损伤和钙超载的作用，提出组织缺血再灌注后生成和释放活性物质和自由基，血管内皮细胞膜受损，间质水肿形成，组织微循环血栓形成致组织缺氧加重，使断肢组织细胞的活性和功能受损。张震宇等^[1]通过动物实验证实断肢再植肌组织缺血再灌注损伤的细胞发生凋亡及Bax、Bcl-2表达发生相应的变化，并且王悦书等^[2]研究证实组织细胞微观结构的改变，断肢组织细胞的活性和功能发生改变，许多学者进行研究提出不同的指标判断损伤程度，指导是否行再植。张志新等^[3]认为短时内可以应用生物发光法测定兔离断肢体骨骼肌三磷酸腺苷(ATP)含量下降程度与骨骼肌的变性程度的关系来判断温缺血断肢再植时限。骨骼肌细胞内含有丰富的肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)，其中以肌酸磷酸激酶含量最多，当肢体缺血达到一定程度，骨骼肌细胞受损，细胞内酶释放入血，因此血清中酶含量的变化可作为判断缺血后骨骼肌损伤的指征。超氧化物歧化酶、丙二醛及线粒体三磷酸腺苷酶活性是反应缺血再灌注损伤的重要指标。

大量实验证实依达拉奉有着强效的细胞内氧自由基清除的能力，在治疗神经系统和心血管系统的疾病中已经得到了广泛的应用。Yoshida和Fu等^[4-5]学者研究分别证实了依达拉奉在神经系统发生缺血再灌注损伤中，不仅可以清除大量的氧自由基，同时可以促进神经生长因子的表达，使神经细胞和星形胶质细胞得到再生和修复。Srinivasan等^[6]学者发现在脑卒中合并糖尿病患者中，依达拉奉可以通过CHOP/GADD153和caspase-12等途径，保护细胞内质网，从而减轻神经细胞的缺血再灌注损伤。Connell等^[7]学者应用一种硫辛酸和依达拉奉的混合制剂(UPEI-300)，发现其对脑卒中后的神经组织可以起到有效的保护性作用，并且可以有效地降低依达拉奉带来的肾毒性。Yao等^[8]学者通过新生大鼠的动物实验表明，应用依达拉奉和异丙酚的混合制剂，可对大脑皮质神经细胞起到保护性作用，并且24 h的药物预处理是保护神经细胞的最佳窗口期。Jiao等^[9]认为，神经细胞经过短暂局灶性缺血后，依达拉奉可有效抑制海马体的长期认知功能障碍。Herlambang等^[10]学者通过制作兔子脊髓缺血再灌注损伤模型，发现依达拉奉配合低温处理受试对象，对脊髓起到了明显的保护作用。Ergenoglu和Karad等^[11-12]大鼠动物实验研究表明，依达拉奉可以有效地减弱卵巢腹腔积气后的缺血再灌注损伤。Shimoda等^[13]通过制作猪肝脏的缺血再灌注损伤动物，表明依达拉奉可有效抑制细胞凋亡，从而对肝脏起到保护性作用。Yamamura等^[14]肌病肾病代谢综合征患者中，依达拉奉可对肾脏和肺脏起到明显的保护作用。Kikuchi和Zhang等^[15-16]的研究表明依达拉奉可有效减轻肺脏的缺血再灌注损伤，不仅通过消除氧自由基，而且能通过减轻肺脏的炎症反应途径产生效果。Zhang等^[17]学者应用低剂量的依达拉奉和乳酸的混合液，发现该混合液可通过影响线粒体凋亡途径，有效地保护心肌发生缺血在灌注损伤。Yamamura等^[18-19]学者通过透射电子显微观察发现，依达拉奉可以有效提高缺血再灌注损伤后老鼠下肢骨骼肌中的糖原颗粒，减轻线粒体肿胀程度。段永壮等^[20]学者的研究发现，依达拉奉可以有效减轻深低温保存大鼠断肢再植后的缺血再灌注损伤。Hori等^[21]通过动物实验发现强效的自由基清除剂依达拉奉可以有效地预防外科止血带导致的骨骼肌的缺血再灌注损伤。

根据缺血再灌注损伤发生机制的认识，本实验将依达拉奉(5 mL)+肝素(12 500 U)+甘露醇(5 mL)+地塞米松(10 mg)用林格氏液配成混合灌注液，并在不同时段对依达拉奉组、缺血再灌注组和空白对照组中的不同指标的变化进行统计学分析，探讨其对断肢再植后肢体的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞生物学指标检测。

时间及地点：于2008年8月至2009年2月在河北医科大学第三医院动物实验中心完成。

材料：

实验动物：选用18只健康成年兔，雌雄不限，体质量2.0-3.0 kg，一级，购于河北医科大学动物实验中心提供，饲养环境清洁，随机数字表法均分为依达拉奉组、缺血再灌注组和空白对照组。实验过程中对动物的处置符合医学动物伦理学标准。

方法：

建立动物模型：

诱导麻醉：自耳缘静脉推注戊巴比妥钠(40-60 mg/kg)诱导麻醉。兔的角膜反射消失后实施手术操作。

处理相应血管：沿兔的左腹股沟区股动静脉血管束的走形方向，依次切开皮肤、皮下组织，暴露并游离股动静脉和腹壁浅动静脉。自腹壁浅动静脉起始1 cm处，切断并结扎自腹壁浅动静脉远端，腹壁浅动脉近端插入硅胶管。

离断肢体：离断除股动脉、静脉以外所有的结构(包括股骨干)，同时对断面进行缝扎止血。再用无创动脉血管夹在腹壁浅动脉分支的远、近端加闭股动静脉，建立兔左下肢断肢模型。术后用37 ℃林格氏液纱布覆盖创面。

各组干预措施：

空白对照组：单纯游离股动静脉后，无其他处理。

缺血再灌注组：将该组兔左下肢离断缺血2.5 h后，用适宜直径的克氏针行股骨干髓内固定，将离断的肌肉进行缝合(此过程于30 min内完成)，之后松开动脉血管夹恢复肢体血供。

依达拉奉组：将该组兔左下肢缺血2.5 h后，重复再植过程。但是，在松开股动脉远端血管夹后，用静脉输液泵自腹壁浅动脉硅胶管处，以50 mL/h的速度进行灌注，待清亮的灌注液从腹壁浅静脉流出后，松开股动脉近端的动脉血管夹，以恢复再植后肢体的血供。于再灌注后的2，4，8，12 h取材。

主要观察指标：

骨骼肌显微结构变化的观察：取各组兔的胫前肌标本，按照标准方法制作切片，光镜下观察骨骼肌结构的病理变化。

湿质量/干质量比值：取各组兔的胫前肌标本并称其湿质量，放入70 ℃烘箱中烘烤24 h，再称其干质量。骨骼肌含水量=[(湿质量-干质量)/湿质量]×100%，来反应骨骼肌的水肿程度。

生化指标：丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定：脂类和氧自由基反应的主要代谢产物；超氧化物歧化酶采用黄嘌呤氧化酶法测定：机体内主要的抗氧化物；过氧化物酶：中性粒细胞嗜天青颗粒内含量较高且恒定的酶，可反映炎症反应的严重程度；Ca²⁺-ATP酶、Na⁺-K⁺-ATP酶(无机磷测定法)：二者均是细胞膜的固有蛋白，反映了细胞膜的稳定性。具体操作均严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所(批号: 060720)。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，各组数据用x(_)±s表示，采取重复测量设计，以球对称性(P > 0.1)为标准，组间比较采取SNK法，以P < 0.05为标准，表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

依达拉奉(化学名：3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是近年来新发现的一种强效的细胞内氧自由基清除剂，在断肢保护和再植后减轻再灌注损伤方面有着广泛的前景，实验旨在研究依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用，同时对实验做了相关的改进^[22]。

3.1 动物模型的建立 “温缺血模型”是断指再植试验中最常用的实验模型，该方法并不离断肢体，而是通过大腿根部的止血带来阻断动物下肢的血液供给，缺血一定时间后，松开止血带产生缺血再灌注损伤。但是这一模型有很多缺点，主要表现在：①离断肢体平面所有组织的解剖连续性并不能通过再植手术来重建。②在“温缺血模型”中，长时间应用止血带会造成受压组织的坏死。③在“温缺血模型”中，股骨干髓腔内未切断的血供，对肢体缺血的完全性产生一定的影响。④在“温缺血模型”中，由于深筋膜没有破坏，缺血再灌注会使是骨骼肌产生严重的水肿，发生骨筋膜室综合征的概率很高。这些原因都会对实验数据的真实性产生影响。

基于“温缺血模型”的以上缺点，实验改进了动物模型，称为“完全性缺血模型”。即夹闭股动静脉后，切断动物下肢中的所有组织，以确保完全性缺血。缺血3 h之后，在缺血再灌注组中，松开动脉血管夹恢复肢体的血液循环；而依达拉奉组则通过腹壁浅动脉向离断肢体进行灌注后，再恢复肢体的血运。所以，该试验方法更具有真实性、可行性及实用性。

3.2 灌注液的成分对断肢的保护作用 依达拉奉对中枢神经系统的缺血再灌注损伤有明确保护作用，主要是通过与羟自由基反应形成一个稳定的氧化产物，减轻自由基造成的脂质过氧化反应及神经细胞凋亡^[23-24]。依达拉奉是一种细胞内型自由基清除剂，可在再植之前进入骨骼肌细胞，有效的预防缺血再灌注损伤^[25]。一方面，通过提供电子直接清除已生成的羟自由基(OH)，抑制自由基的生成，并减轻细胞膜过氧化连锁反应；另一方面，依达拉奉在一定程度上增加了线粒体超氧化物歧化酶活性，从而增强抗自由基损伤能力，保证线粒体结构的完整性和细胞正常的氧化磷酸化，促进再植后的骨骼肌ATP合成能力的恢复，本组实验中依达拉奉组超氧化物歧化酶值在缺血再灌注损伤 2 h后高于对照组，说明依达拉奉激活了某种内源性保护机制^[26]。光镜下，依达拉奉组的骨骼肌纤维的完整性要明显好于缺血再灌注组，这一点也说明了其的保护作用。在兔的后肢截肢模型中发现早期给予依达拉奉可以减轻自由基引起的脂质过氧化反应和随后的炎症细胞浸润，减轻骨骼肌细胞损伤，提高骨骼肌收缩能力^[27]。在本实验中，湿质量/干质量比值的减少说明依达拉奉可有效地减轻细胞水肿；超氧化物歧化酶活性的提高、丙二醛产物的降低说明依达拉奉可有效抑制细胞遭受氧自由基的损伤；Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶的下降减缓说明依达拉奉可有效保护细胞膜的稳定性；过氧化物酶的减少说明依达拉奉可有效减轻炎症反应，有效的减少血管扩张导致的渗出和炎性细胞因子的释放，从而进一步减轻缺血再灌注损伤。

缺血再灌注损伤具有复杂的损伤机制和病理环节，因此，将多种药物联合应用是预防缺血再灌注损伤的有效方法。地塞米松是一种糖皮质激素，几乎可以阻断炎症反应的所有环节，一方面可以有效的抑制中性粒细胞的聚集和血栓阻塞微循环的发生，减少“继发性无复流现象”的发生；另一方面可以抑制中性粒细胞激活后所释放的一系列炎性介质和“呼吸暴发”所产生的大量氧自由基^[28]。甘露醇是一种高渗性溶液，可以有效的预防组织水肿。低分子肝素是普通肝素的衍生物，具有抗凝和调节血脂等功能，抑制白细胞的激活，促进高能磷酸化合物的合成，提供能量，从而减轻再灌注损伤。

临床中断肢再植的患者，由于巨大的创伤致使一般情况较差，若此时发生全身炎症反应综合征，或是MODS，那将出现灾难性的后果^[29]。因此，以依达拉奉为主的混合灌注液可有效减少致炎因子的释放，减轻全身的炎症反应，可清除自由基对全身的影响，保证一般生命体征的平稳。

3.3 注意事项

低压灌注：离断肢体经历长时间的缺血后，骨骼肌纤维明显水肿，组织脆性显著增加，使其不能耐受较高的机械性损伤。所以，进行灌注操作时，灌注液的压力应当低于机体的正常血压(实验的标准为50-60 mm Hg，1 mm Hg= 0.133 kPa)，一方面可以让灌注液带走因缺血而产生有害物质，另一方面有效的避免因较高的灌注压力所产生的副损伤^[30]。

尽量缩短再植时间：尽管保存断肢有很多有效的方法，但是尽早的恢复离断肢体的血供是再植手术的关键环节，二者的关系不能本末倒置。通过本实验可以看出，依达拉奉组中的指标要明显好于缺血再灌注组，但次于对照组，说明再植前进行灌注这一措施对肢体有保护性作用，但是随着时间的延长，其保护性作用也相应的减弱，所以再植前的保护措施和尽快恢复血供同等重要，这样可有效的提高断肢再植术后肢体的功能恢复。

依达拉奉与能量合剂的关系：众所周知，缺血再灌注损伤的启动因素是肢体的能量代谢障碍，能量合剂可给断肢提供能量，预防线粒体的损伤和细胞核的凋亡，有效的保护离断肢体，延长断肢的保存时间。但是依达拉奉原则上必须用生理盐水稀释，不能与高能灌注液、氨基酸制剂混合或由同一通道静滴，因为各种含有糖分的输液混合时，可使依达拉奉的浓度降低。这一点有待于同仁进一步的探讨。

依达拉奉是一种强效的细胞内氧自由基清除剂，可有效地防治断肢再植手术后引起的缺血再灌注损伤，为减少其并发症提供了一条新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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依达拉奉对断肢再植后肢体的保护作用

Prophylactic effects of edaravone on the extremity after limb replantation

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