下肢缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡和内质网应激的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：近几年来研究发现内质网应激导致细胞凋亡在细胞缺血性损害中起重要作用，成为缺血心肌的研究热点。下肢缺血预处理对未成熟心肌具有明显保护作用，但下肢缺血预处理对未成熟心肌内质网应激细胞凋亡是否存在影响至今未知。
目的：探讨下肢缺血预处理对未成熟心肌内质网应激和细胞凋亡的影响。
方法：采用兔离体心脏Langendorff灌注模型，24只幼兔随机分为3组：对照组仅灌注KH液180 min；缺血再灌注组心脏灌注20 min后，停灌60 min，复灌100 min；下肢缺血预处理组，反复3次阻断双下肢血流5 min/放5 min，建立Langendorff模型，然后重复缺血再灌注组方法。TUNEL法检测心肌细胞凋亡率、Western blot检测GRP78、Bcl-2、Bax和Fas蛋白表达。
结果与结论：下肢缺血预处理组与缺血再灌注组比较，心肌细胞凋亡率明显减少；Bcl-2表达明显增多，GRP78、Bax、Fas表达明显减少。结果表明下肢缺血预处理可能通过调控内质网过度应激GRP78表达以及Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表达调控心肌细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 下肢缺血预处理, 内质网应激, 葡萄糖调节蛋白78, 细胞凋亡, B淋巴细胞瘤/白血病2蛋白

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, endoplasmic reticulum stress-caused apoptosis plays a crucial role in ischemia impairment and has become the hotspot of studies addressing myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. The lower limb ischemic preconditioning (LIP) has the obvious protective effect on the immature myocardium, but until now, no study reports whether LIP effects on endoplasmic reticulum stress apoptosis in immature myocardial cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of LIP on endoplasmic reticulum stress and apoptosis.
METHODS: Langendorff-perfused isolated rabbit hearts were used in this study. Twenty-four immature rabbits were randomized into three groups. Control group: Isolated rabbit heart was only perfused with Krebs-Henseleit for 180 minutes. I/R group: Isolated rabbit heart was perfused 20 minutes, and then ischemia for 60 minutes followed by reperfusion 100 minutes. LIP group: Limbs were repeatedly obstructed 5 minutes and relaxed 5 minutes for three times, to establish Langendorff models, and then repeated the method of ischemia/reperfusion in I/R group. The myocardial apoptosis was assayed with TUNEL method. The expression of glucose-regulated protein 78, Bcl-2, Bax and Fas was detected with western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with I/R group, apoptosis rate was significantly lower, the expression of Bcl-2 was significantly higher, and the expression of glucose-regulated protein 78, Bax and Fas was significantly lower in LIP group. This study demonstrated that LIP regulates myocardial cell apoptosis through
reducing the expression of endopasmic reticulum stress GRP78, Bax and Fas and increasing the expression of Bcl-2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: lower extremity, ischemic preconditioning, myocytes, cardiac, apoptosis, endoplasmic reticulum

中图分类号:

R318

孙忠东，宋玉娥，刘国栋，张杰，郑建伟 . 下肢缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡和内质网应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3153-3157.

Sun Zhong-dong, Song Yu-e, Liu Guo-dong, Zhang Jie, Zheng Jian-wei . Effect of limb ischemic preconditioning on immature myocardial cells apoptosis and endopasmic reticulum stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3153-3157.

图/表（结果） 1

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引言

未成熟心肌具有明显不同于成熟心肌的结构和功能特点^[1]，随着心脏手术的日趋幼龄化，探讨对未成熟心肌的保护方法及机制具有重要的临床意义。实验证实，心脏外器官和组织缺血预处理，如肾、骨骼肌、小肠等的缺血预处理对成熟心肌具有保护作用^[2-4]，然而其机制未明，可能与PKC通路激活和mitoKATP开放相关^[5]。

细胞凋亡与心肌保护密切相关，是目前心肌保护的研究重点。内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径^[6]。内质网凭借着其庞大的膜结构基础，在完成基本生理功能的同时，作为信号传导的枢纽平台，可以通过特有的Caspase-12、CHOP(C/EBP homologous protein，C/EBP同源蛋白)、Bcl-2家族及JNK (c-Junamino- terminal kinase)等通路引起细胞凋亡，具体机制亦未明确^[7-8]。其中伴侣蛋白：热休克蛋白家族的糖调节蛋白GRP78 (immunoglobulin binding protein/glucose-regulated protein 78，BIP/GRP78)起着重要作用^[9]。GRP78是内质网应激的标志性分子伴侣蛋白，内质网应激时，GRP78与聚集的未折叠蛋白结合，促进其折叠，GRP78适度表达可增强内质网处理未折叠蛋白的能力。

近年来的实验和临床研究已证实，下肢缺血预处理对未成熟心肌具有明显的保护作用，其作用与氧自由基等密切相关^[10-12]，心肌缺血再灌注期间，缺血缺氧、ATP耗竭、钙稳态破坏等会扰乱内质网功能，导致过度内质网应激，并通过内质网相关凋亡途径引起细胞凋亡而导致心肌损伤^[13-14]。下肢缺血预处理是否影响心肌细胞内质网应激导致细胞凋亡，尚未可知。本实验通过观察下肢缺血预处理对未成熟心肌内质网应激GRP78蛋白和Bcl-2、Bax、Fas等蛋白表达的影响，探讨下肢缺血预处理对未成熟心肌的保护是否与内质网应激导致的细胞凋亡相关。

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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2010年1月至2011年12月在青岛市立医院中心实验室完成。

材料：

未成熟心肌内质网应激相关蛋白表达所需试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
KH盐缓冲液配制试剂	上海生化制药厂
细胞凋亡试剂盒	南京建成生物技术有限公司
MPIAS-1000型多媒体病理图像分析系统	华中科技大学同济医学院清平影像工程公司

实验动物：出生14-21 d的健康新生长耳大白兔24只，雌雄不拘，体质量180-300 g，普通级。购于青岛市实验动物和动物实验中心，饲养于青岛市市立医院中心实验室。

KH缓冲液成分：
成分	浓度(mmol/L)
NaCl	118.50
KCl	4.70
CaCl₂	2.50
MgSO₄	1.20
NaHCO₃	25.00
KH₂PO₄	1.20
Glucose	11.10
Na₂EDTA	0.50

KH缓冲液使用时新鲜配制，经0.45 μm 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O₂和5%CO₂混合气体按1.5 L/min向储液瓶内的灌流液中通气30 min，灌流液维持在37 ℃，pH为7.4，渗透压为320-330 mOsm/L。

实验方法：

Langendorff离体心脏灌注模型建立：动物称质量，腹腔注射20%乌拉坦(1 g/kg)麻醉，固定动物四肢仰卧于手术台上。气管切开插管呼吸机维持呼吸(9 mL/次，30次/min)。剪开胸骨，右心耳注入肝素(300 IU/kg)，切开主动脉插入灌注管，切取心脏，即行KH液Langendorff灌流，灌注压为5.985 kPa。

实验分组：健康新生长耳大白兔24只，随机数字法分为3组：①对照组(n=8)：常规建立Langendorff灌注模型，仅灌注KH液180 min，然后取标本。②缺血再灌注组(n=8)：常规建立Langendorff灌注模型，灌注20 min后，全心停灌60 min，复灌100 min。③下肢缺血预处理组(n=8)：反复3次于大腿根部上止血带阻断双下肢血流5 min/放开5 min，建立Langendorff模型，然后重复缺血再灌注组方法。

标本采集：实验结束后，取大鼠左心室前壁同一部位心肌组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定，用于心肌细胞凋亡检测及免疫组化分析；其余左心室心肌组织放于冻存管中，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存待测。

主要观察指标：①心肌细胞凋亡指数测定：采用TUNEL法，按试剂盒说明进行心肌细胞凋亡的原位检测。光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。每张切片于凋亡细胞分布区域随机各取10个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数(%)表示凋亡指数。凋亡指数=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数×100%。②GRP78、Bcl-2、Bax、Fas蛋白表达：采用Western blot法。各组实验结束后，取左心室心肌，加入胰酶消化按常规程序获取心肌细胞，用2×SDS样品缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，经SDS-PAGE分离后迅速转移至尼龙膜，按《分子克隆实验指南》加入第二抗体室温孵育及碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG(1∶1 000)用BCIP/NBT显色^[15]。应用MPIAS- 1000型多媒体彩色病理图像分析系统进行定量测定吸光度。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，由第一作者利用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近年来的研究证实，细胞凋亡已成为再灌注损伤发病机制中一个重要环节，通过干预凋亡基因的表达来阻断细胞凋亡以减轻再灌注损伤的研究是近年来细胞分子生物学研究的重点之一^[16-29]。内质网在细胞内分布广泛，是细胞内重要的细胞器。内质网内膜面积占细胞所有膜结构的50%，体积占细胞总体积的10%，具有非常重要的生理功能，不仅是合成的蛋白质折叠和运输以及细胞内Ca²⁺储存的主要场所，同时也是胆固醇、类固醇以及许多脂质合成的场所。内质网巨大的膜结构在细胞内提供了一个宽广的分子组装、反应平台，因而在多信号调控中起到关键作用，特别是在调节蛋白质合成及合成后折叠、脂质的合成、细胞应激反应、细胞钙水平等方面具有重要作用^[30]。

缺血再灌注过程中的多种刺激因素导致内质网内未折叠或错误折叠蛋白质聚集以及钙稳态失衡等均可引起内质网功能障碍，触发内质网应激。在内质网中，蛋白质折叠成原始的构象，经过修饰最终成为具有活性的功能性蛋白质。只有正确折叠的蛋白质才能分泌进入高尔基体，而错误或未折叠的蛋白质则留在内质网中继续完成蛋白质折叠过程，或进入内质网降解途径，即被转运至细胞浆中，通过泛素-蛋白酶体系统降解。蛋白质的正确折叠需要内质网中的蛋白质分子参加。主要有3种伴侣蛋白：热休克蛋白家族的糖调节蛋白GRP78，蛋白二硫化物异构酶家族中的巯基氧化还原酶，外源凝集素类的钙联接蛋白/钙网织蛋白。这些伴侣蛋白参与新蛋白的折叠、寡聚化、成熟等修饰过程。研究表明，未折叠蛋白反应是细胞的保护性反应，然而，这种反应是否能够恢复内质网稳态，取决于刺激的强度和持续的时间。如果刺激过强或持续过久，这些反应不足以恢复和维持内质网稳态，则启动程序性死亡，走向细胞凋亡^[9]。适度内质网应激导致内质网内促生存的蛋白分子表达增加，从而减轻心肌损伤；但若内质网损伤太过严重，内环境稳定不能及时恢复，内质网应激将诱导促凋亡因子活化，导致细胞凋亡^[31-32]。

GRP78是内质网应激的标志性分子伴侣蛋白，GRP78适度表达可增强内质网处理未折叠蛋白的能力^[33-34]。本实验结果显示，下肢缺血再灌注使心肌细胞GRP78表达过度上调，而下肢缺血预处理可降低心肌细胞GRP78表达升高的幅度，诱导GRP78表达适度增加，表明下肢缺血预处理产生的心肌保护作用与心肌细胞内质网应激有关，且可减轻缺血再灌注导致的过度内质网应激。然而，下肢缺血预处理如何通过细胞内信号转导调节心肌细胞内质网应激细胞凋亡目前仍然不清楚。活性氧作为第二信使，在细胞生物学功能的调节中起着重要作用，细胞内氧化还原状态的改变促进了活性氧的产生和凋亡诱导因子的激活，致使细胞凋亡的同时又加剧了细胞内氧化还原状态的改变，研究表明活性氧可能是触发内质网应激介导的凋亡通路的上游信号分子之一，启动了内质网应激介导的细胞凋亡^[35]。

Bcl-2主要表达于内质网膜上，其表达可抑制细胞凋亡，Bax表达则促进细胞凋亡。细胞凋亡是一种受促凋亡基因如fas和抗凋亡基因如bcl-2调控的主动性细胞死亡过程。很多外源性因素可以影响Bcl-2、Bax、Fas的表达，下肢缺血预处理影响内质网Bcl-2、Bax、Fas表达，下肢缺血预处理发挥心肌保护作用减少细胞凋亡可能亦与心肌细胞内质网应激Bcl-2、Bax、Fas表达相关^[36]。

实验通过建立Langendorff灌注模型检验了下肢缺血预处理对未成熟心肌内质网应激细胞凋亡时GRP78、Bcl-2、Bax、Fas表达的影响。实验结果发现，下肢缺血预处理使缺血再灌注后未成熟心肌细胞凋亡明显减少，其机制可能通过调控心肌细胞内质网应激时GRP78适度表达及Bcl-2、Bax、Fas表达发挥其机制，但GRP78、Bcl-2、Bax、Fas间是否存在相互作用，目前尚不清楚，需要进一步研究阐明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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