组织工程化成年心肌细胞的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3127-3132.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.003

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组织工程化成年心肌细胞的构建

白辰光¹，刘晓红²

长海医院，¹病理科，²胸心外科实验室，上海市 200433

收稿日期:2014-02-23 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 刘晓红，博士，副研究员，长海医院胸心外科实验室，上海市 200433
作者简介:白辰光，男，1976年生，河北省邢台市人，满族，2010年解放军第二军医大学毕业，硕士，副主任医师、副教授，主要从事心血管疾病和软组织疾病的发病机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(30800229)

Construction of tissue engineering adult cardiac myocytes

Bai Chen-guang1, Liu Xiao-hong2

1Department of Pathology, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China; 2Laboratory of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China

Received:2014-02-23 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Liu Xiao-hong, M.D., Associate investigator, Laboratory of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
About author:Bai Chen-guang, Master, Associate chief physician, Associate professor, Department of Pathology, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30800229

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用成年心肌细胞构建组织工程细胞已成为心脏疾病领域新的科研热点。
目的：探讨简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，并初步探索组织工程化成年心肌细胞的构建方式。
方法：采用分段式酶消化方法消化成年大鼠心室肌心肌细胞。分别转染腺病毒和脂质体介导的红色荧光蛋白基因，倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测组织工程细胞的构建效率。转染腺病毒介导的缺氧诱导因子1a，采用Western blot检测目标蛋白的表达。
结果与结论：采用分段式酶消化方法可获得大量心肌细胞。流式细胞分析表明所获得的成年心肌细胞的存活率为(87.03±0.70)%。与脂质体转染相比(转染效率为0)，腺病毒感染效率高，为(70.31±1.39)%，荧光显微镜下细胞发出红色荧光。在腺病毒转染第4天后，可有效表达目标蛋白缺氧诱导因子1a。以上结果表明分段式酶消化法是成熟心肌细胞的快速分离方式，并明确重组腺病毒载体是转染心肌细胞的最佳基因载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 成年, 组织工程, 腺病毒, 多段式酶消化, 心肌细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Construction of tissue engineering adult cardiac myocytes has been a new research hotspot in cardiovascular fields.
OBJECTIVE: To explore a simple, fast method for the separation of adult rat cardiomyocytes, and preliminarily explore the construction methods of tissue engineering adult cardiac myocytes.
METHODS: Segmented enzymatic digestion method was used to isolate cardiac myocytes from adult rats. Subsequently, cardiac myocytes were transfected with adenovirus and liposome-mediated red fluorescent protein gene. Construction efficiency of tissue engineering cells was qualified using inverted fluorescence microscopy and flow cytometry. Finally, cardiac myocytes were transfected with adenovirus-mediated hypoxia-inducible factor-1a, and the expression of hypoxia-inducible factor-1a was examined by western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: A lot of cardiac myocytes were collected using the segmented enzyme digestion method. Flow cytometric analysis showed that the survival of adult cardiomyocytes was (87.03±0.70)%. Compared with liposomal transfection (transfection efficiency was 0), adenovirus infection efficiency was (70.31± 1.39)%, and the cells expressed red fluorescence under fluorescence microscope. After 4 days of adenovirus infection, transfected cells expressed hypoxia-inducible factor-1a protein. These results showed that segmented enzyme digestion is a fast way to isolate adult cardiac myocytes, and recombinant adenovirus vector is a good vector to transfect cardiac myocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: myocytes, cardiac, adenoviruses, human, hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit, anoxia, tissue engineering

中图分类号:

R318

白辰光，刘晓红. 组织工程化成年心肌细胞的构建[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3127-3132.

Bai Chen-guang, Liu Xiao-hong. Construction of tissue engineering adult cardiac myocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3127-3132.

图/表（结果） 2

2.1 成年大鼠心肌细胞的形态倒置显微镜下，新分离的成年大鼠心室肌细胞呈杆状或矩形，横纹清晰，菱角分明，长宽比为4-5∶1。当细胞贴壁后，苏木精-伊红染色可见明显的细胞横纹(图1)。
2.2 细胞存活效率由于活性细胞的细胞膜完整，所以PI不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞则由
于细胞膜缺乏完整性，为PI所着色。根据流式细胞检测结果，实验观察到应用此分离方法可获得(87.03±0.70)%的活性成年大鼠成年心肌细胞(图2)。
2.3 组织工程化成年心肌细胞的构建效率实验中制备的重组腺病毒以MOI值为50感染大鼠心肌细胞后，细胞未出现肿胀、漂浮、死亡等病态反应；在荧光倒置显微镜下，携带RFP的心肌细胞发出红色的荧光(图3A)；流式细胞仪检测结果显示，当MOI值为50时，红色荧光细胞的百分比为(70.31±1.39)%(图3C)。说明重组腺病毒体外转染效率高，目的基因能得以有效地表达。按照Lipofectamine 2000脂质体转染说明书转染pcDNA3.0质粒，在荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率，一直到第5天，均未见表达红色荧光的细胞(图3B)；流式细胞仪检测结果亦显示红色荧光细胞比例为0(图3D)，与Ad-RFP转染组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.4 组织工程化成熟心肌细胞构建为观察腺病毒转染的基因在成熟心肌细胞中是否能够有效表达，采用Western blot检测缺氧诱导因子1a蛋白的表达。如图4所示，当心肌细胞感染Ad-HIF-1a后，可大量表达Mr 25 000的缺氧诱导因子1a，而当心肌细胞感染Ad-GFP后，未有目标蛋白表达，说明重组腺病毒体外转染心肌细胞后，可有效表达目标蛋白，提示携带缺氧诱导因子1a基因的组织工程细胞构建成功。

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引言

随着人口的老龄化，心脏疾病的发病率和死亡率均逐年增高^[1-4]，但迄今为止，临床上对各类心脏疾病的治疗尚缺乏有效的手段。由于心肌不像心瓣膜或血管，没有可用来替换的组织或生物材料，因此，心血管再生医学与组织工程领域中面临的最大挑战就是如何再造组织工程化心肌组织。近年来针对心肌修复的研究主要集中在细胞注射治疗，但随着组织工程领域研究的发展，使工程化心肌组织成为可能。随着组织工程研究的进展，采用转基因的方式构建组织工程细胞已成为心脏疾病领域新的科研热点，并有望为心脏疾病的基因治疗提供新思路^[5-6]。

当前，大多数研究用的心肌细胞都来自于培养的乳鼠心脏，由于乳鼠心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构和功能上存在很大的差异。例如成年心肌细胞几乎不分裂、其ATP能量合成主要以长链脂肪酸以为底物，而新生心肌细胞的细胞增殖快，其能量来源主要为糖酵解^[7-9]。尤为重要的是，成年心肌细胞在组织缺氧环境下易损伤，而新生心肌细胞对缺氧更加耐受^[10-12]，这使得在缺血性心脏病研究领域中，大量来自于乳鼠心肌细胞的实验结论很难用于成年心肌细胞研究。

随着基因治疗的广泛研究和应用，越来越多的实验需要以成年心肌细胞为靶细胞进行组织工程细胞的构建研究。按照最初Jacobson和Piper(1986)所定义的^[13]，有两种最基本的培养成熟心室肌细胞方法。第一种方法是将心肌细胞保存于含血清的培养基中，细胞通常不吸附于培养基表面，在这种情况下心肌细胞保持悬浮状态并且变为球形，失去其体内的柱状形态，悬浮2-4 d后，细胞吸附于培养基表面并开始“扩展”，向各个方向伸出伪足样突起。第二种培养技术被称作“快速吸附”方法^[14]，它是预先用吸附因子对培养基表面进行处理，并将心肌细胞在无血清培养基中铺开，而后3 h内细胞就会吸附于培养基表面。使用这种技术，细胞能在一两周内保持急性分离心肌细胞的柱形、纹状形态。使用“快速吸附”方法培养的心肌细胞不自发收缩，也不需要血清，并且能存活14 d。

但是，目前分离成年心肌细胞应用较多的是Langendorff灌流胶原酶消化法，其所消化出的心肌细胞是全心脏细胞，这造成缺血性心肌病等具有特定发病部分的心脏疾病的研究困难^[15-16]。为此，实验根据文献报道的方法加以改进，探讨简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，并初步探索组织工程化成年心肌细胞的构建方式，为今后的基因治疗提供研究基础。

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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：于2011年6月至2012年12月在解放军第二军医大学病理科实验室完成。

材料：

实验动物：选取健康成年SD大鼠20只，2-6月龄，体质量25-35 g，雌雄不限，由解放军第二军医大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(沪)：2012-0003。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

心脏的取出和组织机械分离：大鼠称质量后用戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸游离出心脏，自主动脉根部剪除心脏，取左侧心室肌组织转移至装有 0 ℃无钙台式液培养皿中(培养皿置于冰台上，PBS提前预冷)漂洗。漂洗后的心脏转移到青霉素玻璃小瓶中，无菌眼科剪将心脏剪碎至1 mm³大的小块，无钙台式液多次清洗至液体清亮，清洗去较多的红细胞。

心肌细胞的酶消化：漂洗组织块，吸净PBS，加入酶溶液6 mL，37 ℃水浴15 min(每5 min吹打1次，每次30 s，吹打轻柔)之后弃上清；再次加入同上的酶溶液5 mL，37 ℃水浴15 min(操作同上)，收集上清，移至预先准备好的约15 mL含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基中，并轻轻吹打混匀，以彻底终止胰蛋白酶的活性。然后，向已经吸去上清液的组织块沉淀物中，加入与前几次等量、等浓度的酶溶液，同样方法水浴消化，同等时间收集上清液，共计收集6次，直至组织块变为糊状，最后将其弃之。最后，200目滤网过滤组织上清去除小组织块。

心肌细胞的培养：采用差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞，每1 h换液1次，连续2次；收集上清，细胞计数，按照(0.5-1.0)×10⁸L^-1细胞浓度接种于6孔培养板中，37 ℃，体积分数5%的CO₂条件下培养，48 h后换液，除去未贴壁细胞，之后每2 d换液1次。苏木精-伊红染色观察细胞形态。

心肌细胞存活效率的检测：取单细胞悬液用1×Binding Buffer将细胞浓度调整至1×10⁹L^-1，取100 μL转至5 mL流式专用试管，分别加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混匀细胞，避光孵育15 min后，加入400 μL 1×Binding Buffer。1 h之内上机检测。

心肌细胞的基因感染效率的检测：调整心肌细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1并接种到6孔板中。当细胞完全贴壁后，分别转染Ad-RFP、pcDNA3.0-RFP(脂质体法)。第2天，荧光显微镜下观察细胞形态。随后，收集细胞并调整浓度到1×10⁹ L^-1，流式细胞仪检测绿色荧光细胞的比例。

Western blot检测目标蛋白的表达：调整心肌细胞浓度为1×10⁹L^-1并接种到6孔板中。当细胞完全贴壁后，分别转染Ad-HIF-1a、Ad-RFP。第4天，收集细胞、裂解、BCA法测定蛋白浓度。取40 μL蛋白经10% SDS-PAGE垂直凝胶电泳、转膜、封闭，分别用的一抗(1∶500)、二抗 (1∶1 000)孵育。ECL显影剂显影、拍照。

主要观察指标：获得高效、高存活率的成年大鼠心肌细胞分离方法；并以成年大鼠心肌细胞为靶细胞，构建组织工程化成年心肌细胞，明确构建效率和目标蛋白的表达情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量数据以x(_)±s表示，采用t 检验分析数据，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

以心肌细胞为靶细胞，通过基因转染的方式增强心肌细胞的存活、自身修复和功能收缩等能力，是病态窦房结综合征、缺血性心脏病、扩张性心肌病等心脏疾病新的治疗思路和方法^[17-20]。但遗憾的是，当前的研究结果多来自于新生幼稚心肌细胞，而心脏疾病的发生又高发于成年人。因此，以成熟心肌细胞为靶细胞，探讨简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，并初步探索组织工程化成熟心肌细胞的构建方式，将能为今后心肌组织工程研究提供更多的实验数据和研究基础。

王慧玲等^[21]将成年SD大鼠心肌细胞经消化培养并纯化后，种植到Atelocol agen胶原支架上进行成年大鼠心肌细胞三维培养，结果发现成年SD大鼠心肌细胞接种12 h开始贴附支架生长，24 h与支架汇合、紧密黏附，但心肌细胞并不产生自律性搏动，细胞之间夹杂少量崩解的细胞碎片；48 h换液后支架网孔中崩解的细胞被换掉，剩下大部分细胞贴附在支架壁边缘生长，形态学鉴定证明支架网孔中生长的主要是心肌细胞，免疫组织化学和免疫荧光显色均显示在支架内生长的大部分是心肌细胞，并且紧贴支架，生长良好。韦丽兰等^[22]通过SD大鼠颈椎脱臼后迅速开胸取心脏，将心脏悬挂于Langendorff 装置上进行主动脉逆流灌流，先用无钙台式液灌流5 min，然后换上酶液灌流消化20 min，最后用终止液灌流3 min终止反应，取心肌细胞置于HK液中保存，可获得60%-80%的横纹清晰，透亮的长杆状的心肌细胞，说明调节和控制细胞分离过程中的各影响因素可以保证分离的心肌细胞的数量和质量，实验探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞过程中的各影响因素，建立一种可以稳定获取高活性心肌细胞的急性分离方法，为心肌细胞电生理研究和分子生物学研究提供细胞。常惠等^[23]采用Langendorff系统灌流心脏，胶原酶消化法分离成年大鼠心肌细胞，通过探寻增加培养成年大鼠心肌细胞存活率以及防止再分化的方法,揭示培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志。结果培养前3 d杆状心肌细胞比例逐渐降低,无血清培养组比血清培养组降低程度大。培养前3 d凋亡率逐渐升高，无血清培养组比血清培养组凋亡率高，加入凋亡抑制剂对凋亡率无影响。有血清培养两三天的成年大鼠心肌细胞闰盘部位伸出伪足，促使细胞贴壁生长。而无血清培养的细胞无伪足生成，随着培养时间增加，细胞末端变圆钝，横纹变模糊。凋亡抑制剂对伪足形成率无影响。培养存活的成年大鼠心肌细胞骨架重排，发生再分化。血清培养组细胞胞内核间距离随着培养时间的增加而减小，无血清培养组则保持不变。实验说明成年大鼠心肌细胞培养至第二三天时，闰盘部位形成伪足是细胞存活的形态标志，加入血清是伪足形成的必要条件。

回顾当前成熟心肌细胞的分离文献，报道最多的分离方法是Langendorff逆行主动脉灌流酶溶液消化方法，该方法所需时间长，可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞/分子生物学研究。所获得的细胞数量少、活性低，而且无法获得特定部分的细胞^[24-27]。为此，在本实验中，作者尝试切取大鼠左侧心室肌组织进行快速酶消化法。结果表明成熟心肌细胞对分离方法、试剂配制要求苛刻。在具体实验中，总结出以下几点注意事项^[28-30]：①所配制的PBS清洗液宜提前预冷，从而有利于心肌细胞活性的维持。②心肌细胞宜剪的尽量细小，从而有助于下一步的酶消化；在具体操作过程中作者还发现，空间狭小的青霉素玻璃瓶有助于将心肌组织剪的更加细碎。③心肌细胞酶消化亦采用多段式酶消化方法，每次消化时间不宜超过15 min。张燕等^[31]也指出分离心肌细胞时酶消化的终止时间十分重要，消化时间过长会破坏细胞膜、导致心肌细胞活力降低。实验分段式消化方法可人为的将易消化和难消化的细胞区分开，在保证细胞数量的同时又避免易消化细胞的进一步酶消化，提高分离细胞的存活率。

为构建组织工程化细胞，作者采用腺病毒和脂质体两种方式转染心肌细胞，试图找到转染效率高、毒性低的基因工程方法。研究结果表明，在MOI=50时，腺病毒的感染效率高达99%，而脂质体对成年心肌细胞的转染效率则非常低，几乎无细胞转染上。尤为重要的是，Western blot结果表明重组腺病毒转染组的细胞能高效表达外源性基因蛋白。郎明健等^[32]的研究也报道采用脂质体法转染乳鼠心肌，其转染率低于30%。在本实验中，脂质体法转染成年心肌细胞效率低下的原因可能与成年心肌细胞的细胞膜通透性低有关，携带靶基因的脂质体不易通过内吞方式进入细胞膜。而重组腺病毒的转染效率与宿主细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体^[33-34]，以Sumbilla C为代表的学者则证实无论是乳鼠心肌细胞还是成年鼠心肌细胞均表达一定数量的柯萨奇-腺病毒受体蛋白^[35]，这或许是重组腺病毒载体在成年心肌细胞中获得高效表达的重要原因。

当前，随着心脏疾病发生机制的深入研究以及组织工程技术的快速发展，越来越多的实验证据表明组织工程化的成年心肌细胞在未来心脏疾病靶向治疗中具有不可替代的作用。2013年发表在Nature上的一篇文章利用多同位素成像质谱证实发现^[36]，新的心肌细胞主要源自现有的心肌细胞，而不是干细胞。即使在心脏病发作情况下，大部分新的心肌细胞仍来源于现有细胞，这些数据表明，现有的心肌细胞，是正常成年哺乳动物心肌细胞更新及心肌损伤后心肌稳态的最主要来源。该研究对现有的理论——“心脏病发作时心脏内的干细胞被激活”，形成巨大的挑战。在另一方面，以成年大鼠心肌细胞为靶细胞构建组织工程化细胞也已成为心血管领域新的研究方向和新热点^[37-44]。

总之，本研究建立了一种组织工程化成熟心肌细胞的构建方法，确立了分段式酶消化成熟心肌细胞的快速分离方式，并明确重组腺病毒载体是转染心肌细胞的最佳基因载体。这些研究结果为今后的心肌组织工程研究提供实验数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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组织工程化成年心肌细胞的构建

Construction of tissue engineering adult cardiac myocytes

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