人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.014

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较

吴鸿涛¹，马艳²，毕晓娟²，江明²，杨凯¹，王宁¹

新疆医科大学第一附属医院，1干部病房内一科，2临床医学研究院干细胞室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

修回日期:2013-09-02 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 王宁，博士，主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院干部病房内一科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000 13999994126@163.com
作者简介:吴鸿涛★，女，1987年生，汉族，新疆维吾尔自治区人，新疆医科大学在读硕士，主要从事糖尿病基础与临床研究工作。 whtbmd_2008@126.com
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211A075)*

Biological characteristics of endothelial progenitor cells from the peripheral blood versus umbilical cord blood

Wu Hong-tao¹, Ma Yan², Bi Xiao-juan², Jiang Ming², Yang Kai¹, Wang Ning¹

1Department of No.1 Cadre Ward Medicine, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Stem Cell Laboratory, Medical Research Center, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-09-02 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Wang Ning, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of No.1 Cadre Ward Medicine, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 13999994126@163.com
About author:Wu Hong-tao★, Studying for master’s degree, Department of No.1 Cadre Ward Medicine, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China whtbmd_2008@126.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A075*

摘要/Abstract

摘要：

背景：内皮祖细胞可从外周血与脐血中获取，是修复各种疾病所致损伤的血管内皮细胞不可或缺的细胞来源。
目的：比较人外周血与脐血来源的内皮祖细胞经体外培养后生物学特性的差异。
方法：通过密度梯度离心法和6%羟乙基淀粉结合密度梯度离心法分别分离人外周血与脐血中的单个核细胞，分别设为脐血源组和外周血源组，计数各组单个核细胞数量，按1.0×106/cm2接种于大鼠尾胶包被的培养皿中，用内皮细胞培养基进行诱导，共培养7 d。
结果与结论：外周血与脐血体外培养分离出内皮祖细胞具有类似的形态学特征。光学显微镜下观察，随着培养天数的增加，大多数细胞由早期的贴壁圆形转变为梭形。外周血源组内皮祖细胞有细胞集落形成，脐血源组可见梭形细胞自行排列生长为典型的线样结构。锥虫蓝染色及绘制细胞生长曲线后发现，外周血源组单个核细胞及内皮祖细胞数量、内皮祖细胞活率及增殖能力均低于脐血源组(P < 0.05)。外周血源组和脐血源组内皮祖细胞在接种后第3天增殖速度达到峰值，在随后的培养中细胞增殖呈衰减态。流式细胞仪及免疫荧光染色检测结果显示，外周血源组和脐血源组内皮祖细胞均可表达具有内皮祖细胞表型的CD133、CD34和血管内皮细胞因子受体2表面标志物，两组既摄取Dil标记乙酰化低密度脂蛋白，也能标记体外内皮祖细胞的标志物荆豆凝集素Ⅰ。结果证实，脐血来源的内皮祖细胞与外周血来源的内皮祖细胞生物学特性相近，脐血来源的内皮祖细胞增殖能力更强。

关键词: 干细胞培养与分化, 骨髓干细胞, 外周血, 脐血, 内皮祖细胞, 分离培养, 单个核细胞, 分子标记物, 流式检测, 血管新生, 集落, 增殖, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells from the peripheral blood and umbilical cord blood are an essential source to repair vascular endothelial cells damaged by various diseases.
OBJECTIVE: To compare the biological characteristics of endothelial progenitor cells from peripheral blood and umbilical cord blood in vitro.
METHODS: Mononuclear cells were isolated from the umbilical cord blood and peripheral blood with density gradient centrifugation method and 6% hydroxyethyl starch precipitation combined with density gradient centrifugation method, respectively. Mononuclear cells were counted. Then the cells were implanted on the culture plate pre-paved with rat tail collagen at the concentration of 1×106/cm2, and cultured in an endothelial cell culture medium for 7 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Isolated and cultured endothelial progenitor cells from the peripheral blood and umbilical cord blood had similar morphological characteristics in vitro. Under the optical microscope, with the increase of culturing days, most adherent cells were changed from round to spindle-shaped. Peripheral blood endothelial progenitor cells had cell colony formation, and spindle cells from the umbilical cord blood arranged typically in a line structure. After trypan blue staining and drawing of cell growth curves, the number of mononuclear cells and endothelial progenitor cells, survival rate and proliferative ability of endothelial progenitor cells from the peripheral blood were all lower than those from the umbilical cord blood (P < 0.05). At day 3 after incubation, the proliferation of endothelial progenitor cells from the peripheral blood and umbilical cord blood reached the peak, and then showed a decreased tendency. Flow cytometry and Immunofluorescence staining showed that endothelial progenitor cells from the peripheral blood and umbilical cord blood could express CD34, CD133, and vascular endothelial cell factor receptor 2. The endothelial progenitor cells from the peripheral blood and umbilical cord blood could swallow acetylated low density lipoprotein and be combined with ulex europaeus agglutinin Ⅰ. The results confirmed that the endothelial progenitor cells from the peripheral blood and cord blood have similar biologicla characteristics, but the proliferation ability of endothelial progenitor cells from the cord blood is higher.

Key words: stem cells, endothelium, umbilical cord, centrifugation, tissue engineering

中图分类号:

R394.2

吴鸿涛，马艳，毕晓娟，江明，杨凯，王宁. 人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.014.

Wu Hong-tao, Ma Yan, Bi Xiao-juan, Jiang Ming, Yang Kai, Wang Ning. Biological characteristics of endothelial progenitor cells from the peripheral blood versus umbilical cord blood[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.014.

图/表（结果） 4

2.1 人外周血与脐血单个核细胞形态变化外周血与脐血分离的单个核细胞在形态上均呈圆形，体积较小，诱导培养2 d后可见大量的单个核细胞黏附于培养皿底，培养4天后均见细胞体积明显变大，形态不规则，可见少量梭形细胞，见图1A、B；诱导培养7 d长梭形内皮祖细胞明显增多，外周血源组的有细胞集落形成，集落中心聚集为圆形细胞，见图1C；而脐血源组可见梭形细胞自行排列为典型的线样阵列。见图1D。

2.2 人外周血与脐血内皮祖细胞的扩增能力锥虫蓝染色结果显示，实验获得单个核细胞数量在外周血源为(1.00±0.39)×106 L-1，脐血源为(2.00±0.66)×106 L-1；二者相比差异有显著性意义(P < 0.05)。以相同细胞浓度接种单个核细胞，培养诱导7 d收获外周血源内皮祖细胞为(107.63±8.22)×104个，脐血源内皮祖细胞为(423.5±34.91)×104个，二者差异有显著性意义(P < 0.05)。
内皮祖细胞的活率：收获时外周血和脐血内皮祖细胞活率分别为(97.6±0.9)%和(99.3±0.3)%，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
内皮祖细胞增殖特性测定：绘制诱导后内皮祖细胞的生长曲线显示，外周血源与脐血源内皮祖细胞的增殖在接种后3 d达到峰值，并且脐血内皮祖细胞的增殖力明显高于外周血，随后呈逐渐衰减态。见图2。

2.3 人外周血与脐血内皮祖细胞的增殖能力流式细胞检测结果显示，培养7 d，流式细胞仪检测分析表明，人外周血/脐血来源的内皮祖细胞分别表达CD34：59.8%/60.8%；CD133：54.2%/53.5%；血管内皮细胞因子受体2：56.0%/47.4%，见图3。

免疫荧光染色结果见图4，诱导培养7 d的人外周血和脐血内皮祖细胞经激光共聚焦显微镜观察，细胞既摄取DiI-acLDL呈现红色，见图4A，D；也结合FITC-UEA-1呈现绿色，见图4B，E；双染色具有黄绿色阳性细胞特征，见图4C，F，即为正在分化的内皮祖细胞。

参考文献

[1] AsallaraT, MuroharaT, Sullivan A, et al. Isolation of putative endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275(5302): 964-967.
[2] Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+)cells identifies a population of functional endothelial precrsors. Blood. 2000;95(3):952-958.
[3] Gill M, Dias S, Hattori K, et al. Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGF2(+)AC133(+)endothelial precursor cells. Circ Res. 2001;88(2):167-174.
[4] Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk. N EngI J Med. 2003;348(7):593-600.
[5] Walter DH, Rittig K, Bahlmann FH, et al. Statin therapy accelerates reendothelialization: a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;105(25): 3017-3024.
[6] Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduce remodeling and improves cardiac function. Nat Med. 2001;7(4):430-436.
[7] Takahashi T, Kalka C, Masnda H, et al. Ischemia-and cytokine- induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 1999;5(4): 434-438.
[8] Asahara T, Masuda H, Takahashi T, et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999;85(3):221-228.
[9] Murayama T, Tepper OM, Silver M, et al. Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo. Exp Hematol. 2002;30(8):967-972.
[10] Suzuki T, Nishida M, Futami S, et al. Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans:a case report of a Tokaimura nuclear accident victim. Cardiovasc Res. 2003;58(2):487-492.
[11] 彭艳,程培,徐勇,等.脐血内皮祖细胞尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(19): 3499-3502.
[12] Giannotti G, Doerries C, Mocharla PS, et al. Impaired endothelial repair capacity of early endothelial progenitor cells in prehypertension: relation to endothelial dysfunction. Hypertension. 2010;55(6):1389-1397.
[13] Chen LL, Liao YF, Zeng TS, et al. Number and function of circulating endothelial progenitor cell in diabetics with different vascular complications. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2009;89(18): 1234-1239.
[14] Maitra B, Szekely E, Gjini K, et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Transplant. 2004;33: 597-604.
[15] Rocha V, Wagner JE Jr, Sobocinski KA, et al. Graft-versus-host disease in children who have received a cord-blood or bone marrow transplant from an HLA-identical sibling. Eurocord and International Bone Marrow Transplant Registry Working Committee on Alternative Donor and Stem Cell Sources. N Engl J Med. 2000;342(25):1846-1854.
[16] Teleron AA, Carlson B, Young PP. Blood donor white blood cell reduction filter as a source of human peripheral blood-derived endohelial progenitor cell. Transfusion. 2005; 45(1):21-25.
[17] Eggermann J, Kliche S, Hoffmann K, et al. Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood.Cardiovasc Res. 2003;58(2):478-486.
[18] Fadini GP, Albiero M, Cignarella A, et al. Effects of androgens on endothelial progenitor cells in vitro and in vivo.Clin Sci (Lond). 2009;117(10):355-364.
[19] Hur J, Yoon CH, Kim HS, et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24(2):288-293.
[20] Chivu M, Diaconu CC, Bleotu C, et al. The comparison of different protocols forexpansion of umbilical-cord hematopoietic stem cells. J Cell Mol Med. 2004;8(2): 223-231.
[21] Reyftmann L, Dechaud H, Hamamah S, et al. Fetal and umbilical blood cord stem cells:a room for the obstetrician and gynaecologist. Part two, Gynecol Obstel Fertil. 2004;3(11): 969-975.
[22] 方立建,宋鄂,栾瑛,等.人脐血内皮祖细胞体外培养和鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,45(14):8450-8454.
[23] 徐燕,孟恒星,于珍,等.不同来源内皮祖细胞培养及其生物学特性比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,23(14): 4309-4316.
[24] He T, Peterson TE, Holmuhamedov EL, et al. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase. Arterioscler Thromb vasc Biol. 2004;24(11): 2021-2027.
[25] Maitra B, Szekely E, Gjini K, et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Transplant. 2004; 33(6): 597-604.
[26] 周建良,邹明晖,陈义初,等.人脐血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(6):1000-1004.
[27] Kovacic JC, Moore J, Herbert A, et al. Endothelial progenitor cells, angioblasts, and angiogenesis--old terms reconsidered from acurrent perspective. Trends Cardiovasc Med. 2008; 18(2): 45-51.
[28] Prater DN, Case J, Ingram DA, et al. Working hypothesis to redefine endothelial progenitor cells. Leukemia. 2007;21(6): 1141-1149.
[29] Hirschi KK, Ingram DA, Yoder MC. Assessing identity, phenotype,and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb VascBiol. 2008;28(9):1584-1595.
[30] 宋晓红,张罗,韩德民,等.鼠尾胶原为底物的人鼻腔纤毛上皮细胞培养模式的建立[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2007,2(14):107- 111.
[31] 章必成,王俊,赵勇,等.以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立[J].第四军医大学学报,2007,28(5):390-393.

引言

内皮祖细胞是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞^[1-3]。内皮祖细胞不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程^[4-8]。

有动物实验以及临床研究证实，新生血管中约25%的内皮细胞是由内皮祖细胞分化而来^[9-10]，还有大量研究证实，内皮祖细胞在缺血、组织损伤等刺激下，在细胞因子的诱导下，通过招募、归巢作用到达内皮损伤部位，对受损内皮进行修复，此作用对内皮系统的稳定性发挥着不可替代的作用。

鉴于内皮祖细胞的作用特性，近年来，内皮祖细胞移植用于治疗缺血性疾病的应用前景受到广泛的关注^[11-12]，并且已经有大量研究证实此类移植的有效性。

作为种子细胞，内皮祖细胞有多种来源，目前主要有骨髓、脐血和外周血3种。其中，骨髓血中单个核细胞数量最多，分离培养获得的内皮祖细胞数量最多，但取材不便，许多患者难以接受。外周血来源的单个核细胞的定向培养成为了人们关注的焦点，并且在自体移植中获得了确切效果。但外周血来源的内皮祖细胞存在数量少、增殖能力低等问题。

对于糖尿病患者，由于糖尿病存在高血糖、胰岛素抵抗、脂代谢异常等多重问题，其体内的内皮祖细胞表现出细胞数量减少，黏附能力、细胞形成集落能力降低及增殖能力低下等问题^[13]，而且程度较非糖尿病患者严重，这就明显地阻碍了糖尿病患者内皮祖细胞的自体移植。糖尿病患者又是血管病变最严重的一个患病群体，其血管病变不仅包括冠状动脉、脑动脉、下肢动脉等大血管，还包括肾小球、视网膜、肠壁微血管等小动脉，存在着病变重、范围广等特点。因此，寻找适合糖尿病患者的内皮祖细胞的获取来源是今后治疗的关键。

实验研究证明，与骨髓和外周血相比，脐血来源丰富、再生能力强、免疫原性相对较弱，其内淋巴细胞相对不成熟，可用于人类白细胞抗原配型不符者之间的输注^[14]，而且其伦理限制相对较少^[15]，随着全国各地脐血库的建立，将来用自身脐血提取内皮祖细胞治疗缺血性疾病就不存在免疫排斥反应问题了。

因此，实验认为，脐血是将来用于糖尿病患者内皮祖细胞移植治疗的最佳来源。以往脐血来源内皮祖细胞的培养主要采用免疫磁珠分选培养法，此方法获得的内皮祖细胞纯度高，但数量少^[16]。

实验拟在以往试验方法基础上，对细胞培养方法进行改进，采用密度梯度离心法联合羟乙基淀粉沉淀法，同时在培养中以自行制备的鼠尾胶代替昂贵的纤维连接蛋白，观察细胞培养的效果，期望以最低的花费获得能构建组织工程血管的足够种子细胞。实验对外周血及脐血来源的内皮祖细胞的活性、增殖、表面标志等方面的传统生物学特性进行比对研究，为临床上糖尿病患者的内皮祖细胞移植提供更多的理论依据。

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年7月在新疆医科大学临床医学研究院干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性8周龄SD大鼠1只，SPF级，体质量约200 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(新)2003-001。

人脐带及外周血标本：该研究课题脐带标本来自新疆医科大学第一附属医院产科剖宫产术或自然分娩后健康足月胎儿的脐带，均经产妇或其家属同意，签署知情同意书；外周血标本来自健康志愿者。

实验分为外周血源组和脐血源组，各选取标本6例。

人外周血与脐血来源的内皮祖细胞经体外培养相关试剂及仪器：

方法：

鼠尾胶制备：取大鼠尾巴用PBS洗净污渍，浸泡于体积分数75%乙醇中30 min，用PBS冲洗后整体剥去尾皮，将尾剪成2.0-3.0 cm长，抽出白色尾腱置入平皿中，用PBS洗涤2遍，剪碎尾腱浸入150 mL的体积分数0.1%醋酸溶液，置于4 ℃冰箱中48 h，期间多次振摇，然后移入离心管中2 862×g离心90 min，收集上清液于无菌容器中，继续在未溶解的尾腱沉淀中补加体积分数0.1%醋酸溶液50 mL，置于4 ℃冰箱中，24 h后集中收集于上述的上清液容器中，摇匀分装，4 ℃保存，备用。

人外周血单个核细胞的分离：采集健康人肝素抗凝外周血20 mL，用PBS等倍稀释，将稀释血液：人淋巴细胞分离液(Ficoll)液=2∶1比例沿试管壁缓慢加入到Ficoll的上层，在水平离心机715×g离心30 min，用巴斯德吸管吸弃血浆，小心收集淋巴细胞分离液与分离液交界处的混浊的灰白色即为单个核细胞，重悬于5倍体积PBS中，458×g离心10 min，弃上清液，重复加入PBS洗涤2遍，用EGM-2MV培养液稀释细胞，计数，备用。

脐血单个核细胞的分离：脐血中分离单个核细胞方法参照文献[17-19]的羟乙基淀粉(HES)沉降法结合密度梯度离心法分离。实验将新鲜脐血20 mL，按HES∶脐血= 1∶4比例混合均匀，室温静置45 min，收集上层富含白细胞的血浆层，458×g离心10 min，弃上清液，重悬细胞于PBS中，以细胞悬液∶Ficoll=2∶1的比例用巴斯德吸管沿试管壁缓慢加入于Ficoll的上层, 水平离心机715×g离心30 min，收集单个核细胞步骤同上。

内皮祖细胞的诱导与生物学特性检测：

诱导内皮祖细胞：加入鼠尾胶于培养皿中，使其完全覆盖皿底，吸出鼠尾胶置入37 ℃恒温箱过夜，加入PBS洗涤2遍，将分离的单个核细胞按1.0×10⁶/cm²分别接种于培养皿中，补加EGM-2MV培养液至2 mL，置入饱和湿度、37 ℃、体积分数5%CO₂的孵育箱中培养，第4天首次换液。

内皮祖细胞扩增能力和活率测定：①用血细胞计数板分别计数外周血源和脐血源收获单个核细胞数，按公式：细胞数=4个方格细胞数/4×稀释倍数×10⁴分别计算收获细胞的总数，然后，折算出单个核细胞数/mL血液。②将培养7 d的外周血或脐血内皮祖细胞吸弃上清液，PBS洗3遍，加入体积分数0.25%的胰蛋白酶进行消化细胞，显微镜下观察细胞回缩为圆形立即加入3 mL含血清的培养基终止消化，458×g离心10 min，弃上清，加入EGM-2MV液制备成细胞悬液，充分混匀，各取细胞悬液90 μL、加入体积分数0.4%锥虫蓝10 μL，计数拒染细胞，分别计算细胞的活率。

活细胞率(%)=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%

内皮祖细胞增殖特性的测定：按上述的方法用鼠尾胶包被96孔板，用体积分数0.25%的胰蛋白酶消化法收获诱导第7天的内皮祖细胞，计数后调节细胞浓度，以2×10⁴/孔浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，置入37 ℃，体积分数5%CO₂的孵育箱中培养，分别于孵育24 h，48 h，3-7 d。按CCK-8试剂盒说明操作检测细胞增殖情况，每组检测一式3孔，另设一个孔加单纯培养液为空白对照组，绘制细胞增殖曲线。

流式细胞仪检测：按上述的胰蛋白酶消化法收获诱导第7天的内皮祖细胞并计数用PBS调节细胞浓度为1×10⁶，一组加入PE标记CD133、Cy5.5标记CD309 (VEGFR2)、FITC标记的CD34，一组为空白对照，将两组标本置入4 ℃，避光孵育30 min，PBS洗涤2遍后进行流式细胞仪检测。

免疫荧光染色观察内皮祖细胞形态：收获诱导第7天的贴壁细胞，加入10 mg/L的Dil-ac-LDL，置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵育箱中孵育4 h后，加入PBS洗涤3遍，然后加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，吸弃固定液，加入PBS洗涤5 min/次×3，加入10 mg/L的FITC-UEA-Ⅰ，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3遍后，在激光共聚焦显微镜下观察FITC-荆豆凝集-Ⅰ和DiI-acLDL荧光染色双阳性的细胞。

主要观察指标：①人外周血与脐血内皮祖细胞形态变化。②人外周血与脐血单个核细胞数量测定。③人外周血与脐血内皮祖细胞数量、活率、增殖能力测定。④人外周血与脐血内皮祖细胞鉴定。

统计学分析：计量资料均以x(_)±s表示，数值均符合正态分布采用SPSS 17.0统计学软件对结果数据进行统计学分析，组间均数差异的比较采用独立样本t 检验，检验水准α=0.05。

讨论

实验采用密度梯度离心法联合羟乙基淀粉沉淀法，外周血与脐血单个核细胞获得数量为：(1.0±0.4)× 10⁶ L^-¹和(2.0±0.7)×10⁶ L^-¹，使用EGM-2专用培养基，经过7 d培养，经DiI-acLDL/FITC-荆豆凝集素Ⅰ荧光双染鉴定结果显示，外周血来源的单个核细胞及脐血来源的单个核细胞均可以培养出内皮祖细胞。许多实验已经从外周血、骨髓和脐血中分离培养出内皮祖细胞，有少量内皮祖细胞还可存在于心脏、血管和脂肪组织等其他组织中，就内皮祖细胞来源，本课题选用外周血和脐血作为内皮祖细胞的来源，其突出优势是取材方便、无创伤，特别是脐血的免疫原性低、致命性移植物抗宿主病发生率低、对供者无危害、无肿瘤细胞污染等优点^[20-21]，更有可能用于异体移植。而糖尿病患者存在自体内皮祖细胞，无论骨髓来源还是外周血来源，均存在着数量少、功能差的问题。因此，糖尿病患者的自体移植效果不佳。而脐血是最有可能用于糖尿病患者进行异体移植的种子来源细胞。

由于目前内皮祖细胞无明确的细胞表面标志。因此，利用其功能特征来对其进行鉴定显得尤为重要，双荧光染色正是利用内皮祖细胞即能吞噬酰化低密度脂蛋白又能结合荆豆凝集素Ⅰ的特征，此方法简单、可靠，不容易被污染。实验也采用了此方法，证明两种细胞均可培养获得荧光双染内皮祖细胞。

实验采用流式细胞仪分析单个核细胞经诱导分化 7 d后细胞表面标记物，两种来源的细胞经诱导获得的内皮祖细胞表面的CD34、血管内皮细胞因子受体2和CD133标记物均有阳性表达，但有不同的表型特征。其中，人外周血来源内皮祖细胞的血管内皮细胞因子受体2和CD133阳性表达率略高于脐血，而脐血来源内皮祖细胞的CD34阳性表达率略高于人外周血。

既往不同的研究结果显示，外周血来源内皮祖细胞与脐血来源内皮祖细胞的细胞表面标记物显示有较大差异。有研究显示，诱导分化7 d后，内皮祖细胞的这3种表面标志都有所表达，而在细胞培养至14 d时，CD133阳性率接近为零^[22]，CD34阳性率亦有下降，而血管内皮生长因子受体2的阳性率则略有升高，如上所述，CD133只在细胞培养早期表达，由此推断内皮祖细胞不是单一的一种细胞，而是介于祖细胞与成熟内皮细胞之间的一类细胞。而另有研究发现，外周血来源的内皮祖细胞不表达KDR，CD34，CD133；脐血来源的内皮祖细胞与外周血内皮祖细胞类似，但部分表达KDR^[23]。但多数研究显示，脐血与外周血分离获得的单个核细胞经过定向分化培养，可以获得内皮祖细胞，并表达CD34、血管内皮细胞因子受体2和CD133，在细胞不同时期，CD133表达有差异。实验与此前研究结果基本相同，显示两种来源的细胞诱导的内皮祖细胞均表达CD34、血管内皮细胞因子受体2和CD133，脐血培养获得的内皮祖细胞的CD34表达率更高，而且脐血来源细胞的细胞获得率更高。

纤维连接蛋白作为细胞外基质成分之一，含有能够被细胞整合素识别的RGD序列，其支架和黏附等作用，并调节细胞间及细胞与细胞外基质之间的作用，纤维连接蛋白在细胞的早期识别与黏附中有重要的作用^[24]。纤维连接蛋白可以促进血管内皮生长因子诱导的CD34⁺细胞分化为内皮细胞，而且纤维连接蛋白和血管内皮生长因子对提高内皮祖细胞迁移和分化的能力还具有协同刺激作用^[25]。实验采用自制的鼠尾胶代替购买的纤维连接蛋白，结果显示，细胞增殖率等与既往使用纤维连接蛋白的结果相似，实验中外周血及脐血单个核细胞通过在包被有鼠尾胶的培养皿上贴壁培养后均获得了纺锤形、梭形的贴壁细胞，培养7 d后形成由中心圆形细胞及周围出芽伸出的纺锤形细胞组成集落，脐血还可见典型的线样排列，这些特征皆与文献报道的典型内皮祖细胞形态相同^[26-29]。这些细胞继续培养增殖率很低，甚至逐渐衰退，消化传代后不能继续贴壁及增殖。由于其同时表达造血与内皮细胞抗原，增殖能力有限，因此可能就是造血细胞来源的内皮祖细胞。鼠尾胶具有取材方便、成本低廉和黏附能力强，其主要成分为Ⅰ型胶原，可以用于血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和星形胶质细胞等细胞的培养。宋晓红等^[30]以鼠尾胶为粘贴剂建立人鼻腔纤毛上皮细胞培养模式。章必成等^[31]以鼠尾胶为粘贴剂成功培养了小鼠淋巴管内皮细胞，并具有形成淋巴管样结构的能力。实验结果提示，自制鼠尾胶可以代替纤维连接蛋白用于内皮祖细胞的培养，并且有着价格便宜的优势。

脐血源内皮祖细胞收获时的成活率和增殖能力均高于外周血源的内皮祖细胞。糖尿病患者往往存在高血糖、胰岛素抵抗、脂代谢异常等多重问题，其体内的内皮祖细胞，无论是骨髓来源还是外周血来源，均存在细胞数量少，黏附能力差、细胞形成集落能力低以及增殖能力低下等问题，而且程度较非糖尿病患者严重，这就大大地阻碍了糖尿病患者使用自体来源的内皮祖细胞进行移植治疗。而脐血是一种免疫原性低、伦理问题少的细胞。

实验结果显示，脐血源内皮祖细胞收获时的活率和增殖能力均高于外周血源的内皮祖细胞，这就为糖尿病患者选择内皮祖细胞的细胞来源提高了支持。随着脐血库的建立，糖尿病患者甚至可以使用自身储存的、患糖尿病之前的脐血作为移植细胞来源，更减少了免疫排斥可能。

总之，脐血源内皮祖细胞收获时的活率和增殖能力均高于外周血源的内皮祖细胞，并保持了与外周血源内皮祖细胞基本相同的细胞学分子标志特征，其CD34⁺细胞率更高。这为本地区临床治疗缺血性疾病使用不同种子细胞提供了客观数据和技术平台。然而，专用培养液富集内皮祖细胞数量有限，难以满足临床治疗的有效细胞剂量。为此，未来实验将从建立扩增内皮祖细胞的方法学上予以摸索，以期为临床应用奠定基础。

人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较

Biological characteristics of endothelial progenitor cells from the peripheral blood versus umbilical cord blood

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[1]	陈强, 卓鸿武, 夏天, 叶哲伟. 不同质量浓度异烟肼对体外培养乳鼠成骨细胞的毒性作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1162-1167.
[2]	占龙, 孟农钦, 农桔安, 李小峰, 杨渊, 余雪. 原儿茶酸可减轻退变软骨细胞的损伤[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1149-1154.
[3]	方雯, 李泽, 柳昭明, 冯红. 中等强度训练干预大鼠骨骼肌抗增殖蛋白PHB1表达及线粒体呼吸功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1207-1212.
[4]	刘春栋, 申晓青, 张艳丽, 张小根, 吴补领. 钛表面锶改性后骨髓基质干细胞黏附、迁移、增殖及成骨相关基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1009-1015.
[5]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[6]	黄永明, 黄启明, 刘焱杰, 王竣, 曹振武, 田振江, 陈博鉴, 麦秀钧, 冯恩辉. TDP43慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养后的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1016-1022.
[7]	刘梦婷, 饶巍, 韩兵, 肖翠红, 武栋成. 人脐带间充质干细胞的体外免疫调节特性 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1063-1068.
[8]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[9]	张培根, 衡孝来, 解迪, 王进, 马靖琳, 康学文. 电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1076-1082.
[10]	靳少锋, 郑蕊, 杰永生, 陈磊, 綦惠, 孙磊, 舒雄. 真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 532-537.
[11]	汤井沣, 张骏, 尤奇, 刘毅. 在软骨修复中应用石墨烯及其衍生物相关复合材料的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 619-624.
[12]	王旸昊, 王伟舟, 段浩, 钟宗雨, 李晓壮, 唐志宏, 何飞. 不同材料因素影响骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4429-4436.
[13]	王乐, 惠敏, 董西玲, 周晗, 董洪亮, 张晓明, 刘童斌. 缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架对细胞黏附增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4492-4497.
[14]	杨振, 李浩, 高仓健, 付力伟, 田广招, 查康康, 孙志强, 李旭, 郭维民, 眭翔, 黄靖香, 刘舒云, 卢世璧, 郭全义. 转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4540-4546.
[15]	姚顺晗, 韦华成, 覃家港, 廖亮. 罗汉果苷V促进LncRNA TUG1表达刺激成骨细胞的增殖与分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4129-4134.