比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0138

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (8): 1205-1210.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0138

• 皮肤粘膜组织构建 skin and mucosal tissue construction • 上一篇下一篇

比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响

郭吉安，余丕军，王露萍，石莹莹，柳逸，陈炜

江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科，上海市 200235

收稿日期:2017-10-17 出版日期:2018-03-18 发布日期:2018-03-18
通讯作者: 陈炜，博士，教授，主任医师，硕士生导师，江苏大学附属上海市第八人民医院医学美容科，上海市 200235
作者简介:郭吉安，男，1989年生，上海市人，汉族，江苏大学医学院在读硕士，主要从事脂肪干细胞、组织工程方面的研究。
基金资助:
上海市卫生计划和生育委员会科研项目[20154Y0198]；上海市徐汇区医学科研项目[SHXH201606]；江苏大学医学临床科技发展基金项目[JLY20160077]

Human dermal fibroblast isolation using two enzyme digestion methods: a comparative study

Guo Ji-an, Yu Pi-jun, Wang Lu-ping, Shi Ying-ying, Liu Yi, Chen Wei

Department of Plastic Surgery, Shanghai Eighth People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University, Shanghai 200235, China

Received:2017-10-17 Online:2018-03-18 Published:2018-03-18
Contact: Chen Wei, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Plastic Surgery, Shanghai Eighth People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University, Shanghai 200235, China
About author:Guo Ji-an, Master candidate, Department of Plastic Surgery, Shanghai Eighth People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University, Shanghai 200235, China
Supported by:
the Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning, No. 20154Y0198; Xuhui District Medical Research Project of Shanghai, No. SHXH201606; the Clinical Medical Science and Technology Development Foundation of Jiangsu University, No. JLY20160077

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胶原酶：按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。　
酶消化法：酶消化法是指利用蛋白酶，通过消化分解组织块，从而得到单个细胞的方法，是目前科学研究中最常用的提取原代细胞和将融合细胞分离为单个细胞的方法。

摘要
背景：目前真皮成纤维细胞研究应用广泛、需求量大、分离方法多，但是用于细胞分离培养的酶消化法尚未有对比研究。
目的：比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞的细胞产量、形态、迁移、增殖4个方面的差异。
方法：分别使用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶分离消化真皮成纤维细胞，并进行细胞计数，原代培养并观察细胞形态学差异，采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力并使用CCK-8检测细胞增殖活力。
结果与结论：①采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合，通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合，两种酶消化法都可获得真皮成纤维细胞；②与胰蛋白酶消化组相比，中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加；③划痕实验结果显示，胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢；④两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系，在第3，4和5天，中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度；⑤结果表明，与胰蛋白酶消化相比，用中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞产量、迁移、增殖能力均更高；提示中性蛋白酶+胶原酶消化法优于胰蛋白酶消化法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0002-8730-6816(郭吉安)

关键词: 真皮成纤维细胞, 细胞培养, 组织工程, 中性蛋白酶, 胶原酶, 胰蛋白酶, 消化, 组织构建, 培养

Abstract:

BACKGROUND: Dermal fibroblasts are widely used and demanded, and there are various isolation methods, but no comparative studies on enzyme digestion methods are reported.
OBJECTIVE: To compare the cell count, morphology, migration and proliferation of human dermal fibroblasts isolated by two enzyme digestion methods.
METHODS: Human dermal fibroblasts were isolated using either dispase-collagenase or trypsin, and their cell yield and viability were assessed by morphology, cell count and proliferation curve by cell counting-kit 8 assay. The ability of migration was observed by cell scratch test.
RESULTS AND CONCLUSION: The fibroblasts digested with dispase-collagenase were fused at 6-7 days after inoculation, and the cells isolated by trypsin digestion were fused at 8-9 days after inoculation. Fibroblasts could be obtained by both two digestion methods. The production in the dispase-collagenase group was significantly higher than that in the trypsin group. The migration rate in the dispase-collagenase group was significantly faster than that in the trypsin group. The growth cures of the human dermal fibroblasts in the two groups revealed that the cell count was positively correlated with time, and the absorbance values of the dermal fibroblasts in the dispase-collagenase group were significantly higher than those in the trypsin group at 3, 4 and 5 days after incubation. To conclude, the cell yields, migration and proliferation of dermal fibroblasts digested with dispase-collagenase are significantly higher than those of the cells digested by trypsin, indicating that dispase-collagenase digestion results in better isolation and viability of dermal fibroblasts from the dermis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Fibroblasts, Dermis, Collagenases, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭吉安，余丕军，王露萍，石莹莹，柳逸，陈炜. 比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1205-1210.

Guo Ji-an, Yu Pi-jun, Wang Lu-ping, Shi Ying-ying, Liu Yi, Chen Wei. Human dermal fibroblast isolation using two enzyme digestion methods: a comparative study[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(8): 1205-1210.

图/表（结果） 3

2.1 不同消化方法真皮成纤维细胞的镜下表现真皮成纤维细胞接种24 h后可黏附于培养瓶表面，为短梭形。采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合(图1A，C)，而通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合(图1B，D)。随着细胞单层融合，真皮成纤维细胞逐渐变为长梭形、呈纺锤状(图1D)。随着成纤维细胞过融合，胞体变为细长形，细胞呈线性、束状或漩涡状排列(图1C)。

2.2 细胞产量细胞计数结果采用x(_)±s表示。各组皮肤标本经酶消化后，从中性蛋白酶+胶原酶消化组中可获得(10.946±11.121)×10⁵个细胞，而从胰蛋白酶消化组中可得到(8.913±0.204)×10⁵个细胞。与胰蛋白酶消化组相比，中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加(P=0.037) (n=3)。

2.3 胰蛋白酶消化延迟真皮成纤维细胞体外创伤的愈合采用划痕实验模拟创伤修复过程，分别定性检测0，24，48 h后各组真皮成纤维细胞在体外的迁移能力。结果显示：胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢(图2)。

2.4 各组成纤维细胞增殖的比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系(图3)。中性蛋白酶+胶原酶消化组的生长曲线可见，细胞接种后第1，2天为潜伏期，第3-6天为对数生长期，平台期为第7天。相比之下，用胰蛋白酶组的生长曲线显示第1-3天是细胞生长潜伏期，第4-7天是对数生长期，第8，9天是平台期。此外，在第3，4和5天，中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度(P < 0.05)。

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引言

成纤维细胞是结缔组织中主要的细胞成分，和其他的结缔组织一样来源于中胚层，又称为纤维母细胞。成纤维细胞的主要功能是合成分泌各种基质和多种纤维蛋白，以维持结缔组织结构的完整性。成纤维细胞的体积较大，形状较不规则，呈多突起的纺锤形、条索状或星形，其形态可根据附着处的物理性状不同和细胞功能变化而发生改变。

研究表明，成纤维细胞是人真皮结缔组织中最常见的细胞，它可以合成胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质，构成皮肤组织的结构框架，并在伤口愈合中起到关键作用^[1-3]。成纤维细胞是目前皮肤组织工程应用最为广泛的种子细胞，其在各类研究中已被用作了解成纤维细胞功能、细胞信号传导、纤维发生、皮肤老化、伤口修复等基本细胞机制的重要载体，并且在临床试验中已被应用于构建组织工程皮肤^[4-8]。这些研究需要大量的真皮成纤维细胞，因此如何从皮肤组织中分离获得足够数量且具有很好活力的真皮成纤维细胞是一个重要的问题。

目前，从皮肤组织中分离培养成纤维细胞的技术已经建立并广泛用于皮肤研究，方法主要为皮肤组织块培养法和酶消化法。组织块法通过孵育真皮组织块，使真皮成纤维细胞从微小的组织块中爬出形成单层细胞，通常需要1周左右才可见细胞爬出，获得足够数量的原代细胞通常要花费数星期时间；相比之下，使用酶消化法获取真皮成纤维细胞更为快速高效^[9-11]。

常见的酶消化法有中性蛋白酶+胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法两种，国内教科书中多收录采用胰蛋白酶消化法^[12-14]：①将皮肤组织放入0.25%胰酶中于37 ℃消化 30 min或4 ℃过夜消化，以去除表皮；②剩余皮肤组织在0.25%胰酶中于37 ℃振荡消化以获得成纤维细胞悬液。但是，在实践中发现采用胰蛋白酶消化的效果差强人意，消化后获得的细胞活性不高。通过查阅文献，众多实验的实际应用中多采用中性蛋白酶联合胶原酶的消化方法分离获取成纤维细胞。这种理论与实践的差异，引起了作者的注意。但是，目前尚未有比较这两种酶消化法对真皮成纤维细胞活性影响的相关研究。因此在研究中作者比较了用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶消化获得的成纤维细胞在细胞产量、形态和细胞迁移、增殖能力方面的差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学研究。

1.2 时间及地点实验于2016年10至12月在江苏大学附属上海市第八人民医院中心实验室进行。

1.3 材料

实验标本：皮肤组织来自于包皮环切手术时切除的健康皮肤，3名供者年龄13-25岁，由江苏大学附属上海市第八人民医院泌尿外科提供；根据《医疗机构管理条例》的规定患者对治疗及实验均已签署知情同意书^[15]；实验经医院医学伦理委员会批准。

实验用主要试剂与仪器：DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青链双抗溶液(Gibco公司)；PBS(HyClone公司)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；中性蛋白酶(Roche公司)；红细胞裂解液(碧云天生物技术)；CCK-8试剂盒(Dojindo化学研究所)；100 μm细胞筛(BD公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；倒置显微镜(Olympus公司)；CO₂恒温培养箱(Thermo Fisher公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)；恒温振荡器(上海精宏实验仪器厂)；离心机(上海安亭实验仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 消化分离真皮成纤维细胞

(1)去除上皮组织：皮肤标本采集后置入冰盒中带入实验室，用含双抗的PBS洗涤3-5次以除去血污；然后置于100 mm培养皿盖上，使用眼科剪去除真皮下附着的结缔组织、毛细血管等；将皮肤剪成约5 mm宽的条形，并随机分成质量相同的2组，去除表皮组织：①对于中性蛋白酶+胶原酶消化组，皮肤组织中加入0.5%的中性蛋白酶溶液， 4 ℃过夜消化；次日使用眼科镊轻轻剥去上皮组织，PBS冲洗3次；②对于胰蛋白酶消化组，在皮肤条中加入0.25%的胰蛋白酶，4 ℃过夜消化；次日使用眼科镊去除上皮组织，PBS冲洗3遍。

(2)消化真皮成纤维细胞：将皮肤条剪碎至1 mm× 1 mm×1 mm左右的小块，分别用不同的酶消化处理：①对于中性蛋白酶+胶原酶消化组，将配置好的0.1%的Ⅰ型胶原酶加入剪碎的皮肤组织，置于恒温振荡器37 ℃振荡消化 3 h，加入含有体积分数10%胎牛血清的预冷DMEM培养基终止消化；100 μm细胞筛过滤除去皮肤碎片，离心(150×g，10 min)后收集细胞；②对于胰蛋白酶消化组，将0.25%的胰蛋白酶加入剪碎的皮肤组织，37 ℃振荡消化30 min，加入含有体积分数10%胎牛血清的预冷DMEM培养基终止消化；100 μm细胞筛过滤，150×g离心10 min后收集细胞。

1.4.2 红细胞裂解使用红细胞裂解液重悬细胞，室温下孵育2 min，然后以500×g离心5 min；如果红细胞裂解不完全，重复此步骤。随后用无菌PBS洗涤3次，500×g离心 3 min。弃上清，完全培养基重悬细胞。

1.4.3 细胞计数血细胞计数板计数每组消化的成纤维细胞，细胞计数重复3次。计算每组的平均计数结果，并比较两种酶消化方法的细胞产量。

1.4.4 细胞迁移实验采用体外细胞划痕法检测两种酶消化方法是否会影响真皮成纤维细胞的迁移活力。接种各组真皮成纤维细胞于6个25 cm²培养瓶，中性蛋白酶+胶原酶组和胰蛋白酶组各重复3瓶。当细胞单层融合时用无菌200 μL枪头划痕建立体外细胞损伤模型，然后用PBS轻柔冲洗划痕区残留细胞及死细胞。加入完全培养基，放入 37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱培养。按0，24，48 h取样，拍照，比较细胞迁移距离。

1.4.5 细胞增殖测定使用CCK-8比色测定法测量细胞增殖能力。将真皮成纤维细胞接种于12孔板，每组各设3个复孔。向每孔加入CCK-8溶液，将孔板在培养箱中孵育1-4 h后，用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度(A值)；绘制各组真皮成纤维细胞生长曲线。

1.5 主要观察指标 ①成纤维细胞的生长情况及形态；②细胞产量；③细胞迁移能力；④细胞增殖能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。组间数据比较使用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

成纤维细胞因具有较强的修复功能而成为组织工程学研究的热点，其修复功能大致分为两类：
⑴对一般创伤的修复：不同程度的创伤都会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，组织修复显得尤为重要，而这些修复功能主要通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行。在这样的修复过程中，成纤维细胞的作用不可忽视。当皮肤损伤时，为了修复创伤面，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，从4-6 d开始合成并分泌足够数量的胶原纤维和细胞基质，与新生毛细血管等共同组成肉芽组织，补充在组织缺损位置，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合过程中，所需成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞、未分化的间充质细胞和血管周围的成纤维细胞及周细胞等。当内脏发生损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多由粘膜下或浆膜下层的结缔组织以及间质和包膜提供。有学者认为，创伤愈合时创面聚集的大量成纤维细胞来自于成纤维细胞的分裂增殖以及邻近纤维细胞、毛细血管周细胞和间充质细胞的演变和迁移。而在修复即将完成时，成纤维细胞则分泌胶原酶参与修复后组织的改建^[2]。
(2)骨创伤修复：骨折是最常见的骨创伤，其愈合过程可分为3个阶段，即血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑性期。在不同阶段中，参与的主体细胞不同。研究发现，从骨折第3天起，成纤维细胞就出现于骨折部位形成的血肿中，骨折第5天，成纤维细胞就大量存在在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围，形成纤维骨痂阶段的主要细胞成分。在该阶段，成纤维细胞通过大量分裂增殖以及合成和分泌大量Ⅰ型胶原，促使肉芽组织转变为疏松的结缔组织，包围骨折断端，形成纤维骨痂接合两骨折断端。有趣的是，这种主要由大量成纤维细胞和肉芽组织构成的纤维结缔组织并不会转变为瘢痕组织，而是通过在其内部不断沉积钙盐结晶，逐渐转换成骨性骨痂，使骨折部位的修复达到骨性愈合，恢复原本的骨性结构^[1]。此时，骨折愈合部位不再存在成纤维细胞，而由骨组织完全替代。成纤维细胞这些强大的修复功能，使如何快速有效的获得大量成纤维细胞显得尤为重要。

当前，获取原代真皮成纤维细胞的方法有组织块培养法和酶消化法^[1^6]。皮肤组织块培养法成本低、简便易行^[17]；但由于不能完全去除上皮组织，成纤维细胞生长时可能混有上皮细胞，从而影响实验结果。虽然后期可以通过机械刮除、消化法、贴壁法等方法后期去除上皮细胞，但这些都增加了实验操作的复杂性及细胞污染的可能性；而且组织块法的效率较低，爬出足够数量的原代细胞通常要花费数星期时间^[18]。这些问题使组织块培养法不太适应于当前组织工程研究中对真皮成纤维细胞大量需求的情况。相比之下，酶消化法分离培养成纤维细胞更为高效，其可增加细胞产量并降低细胞污染的风险。酶消化法是利用中性蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶等消化酶分离上皮组织与真皮组织，获得的真皮组织进一步消化得到成纤维细胞悬液，通过传代培养可以快速大量传代细胞，具有获得细胞多、培养时间短的优点。一般应用中主要有两种酶消化法：中性蛋白酶+胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法^[19-21]。

1876年，Wilhelm Kühne 等首次发现了胰蛋白酶的存在。胰蛋白酶是来自PA家族的丝氨酸蛋白酶，存在于许多脊椎动物的消化系统中，具有水解消化蛋白质的作用。胰腺生成胰蛋酶原，在小肠中被肠激酶激活形成成熟的胰蛋白酶。胰蛋白酶主要在氨基酸——赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽链。由于这种消化作用，它被用于许多生物技术过程，该过程通常被称为胰蛋白酶蛋白酶解或胰蛋白酶消化。

中性蛋白酶是从枯草芽孢杆菌中提取而得到的一种内切酶，在适当的温度、酸碱度下，中性蛋白酶能够将大分子蛋白质水解为氨基酸。所以中性蛋白酶可以广泛应用于动植物蛋白的水解。胶原酶是破坏胶原蛋白中肽键的酶，用于消化组织中连接部分从而使其成为单个细胞，科学实验中常用于哺乳动细胞的分离。在溶组织梭状细胞芽孢杆菌中可以提取制备胶原酶。由于胶原酶的水解消化作用主要针对细胞间质而对上皮细胞影响较小，所以胶原酶比较适用于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织。胶原酶有6种分型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶。而胶原酶Ⅰ适用于上皮、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的分离。中性蛋白酶联合胶原酶消化法，被用于实验中消化分离单个细胞。

在本研究中，作者进行了6组原代培养，其中3组采用中性蛋白酶+胶原酶消化法，另外3组采用胰蛋白酶消化法，所有实验组均能分离获得真皮成纤维细胞。在实验中发现：
   (1)两组重量相同的皮肤组织，中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量高于胰蛋白酶消化组，差异具有统计学意义(P=0.037)。细胞产量的差异可能与酶的特性密切相关：皮肤由表皮和真皮组成，中性蛋白酶可以特异性水解IV型胶原、纤连蛋白，直接作用于表皮和真皮相连的半桥粒结构，分解基底膜成分，而不会破坏上皮细胞之间的黏附作用；因此，其可完整彻底地分离表皮与真皮结构，消化得到较为纯净的真皮组织^[22-24]。以中性蛋白酶分离表皮和真皮，可基本排除上皮细胞的污染。相比之下，胰蛋白酶不仅消化半桥粒，也破坏桥粒结构，使表皮组织分解为单个细胞从而导致上皮细胞污染的可能性^[25-27]。与此同时，真皮组织在去除表皮的过程中也被胰蛋白酶消化，损失部分成纤维细胞，从而导致了较低的细胞产量。
    (2)采用中性蛋白酶+胶原酶消化获得的真皮成纤维细胞的增殖能力更强，倍增时间比使用胰蛋白酶消化获得的真皮成纤维细胞更短。两组细胞分别在消化和接种后的第6，7天和第8，9天融合。如真皮成纤维细胞生长曲线所示(图3)，中性蛋白酶＋胶原酶组的真皮成纤维细胞从潜伏期到对数生长期所需的时间较胰蛋白酶组更短。
    (3)体外划痕实验揭示，与中性蛋白酶+胶原酶消化相比，胰蛋白酶消化获得的真皮成纤维细胞迁移能力显著减弱。有研究发现，胰蛋白酶具有较强细胞毒性，胰蛋白酶的消化时间难以控制；使用胰蛋白酶消化时间太长，细胞将被破坏；但是消化时间太短，则很难破坏细胞之间的连接，导致很多细胞没有被消化分散^[9^，^28-29]。相反，中性蛋白酶和胶原酶的消化作用更温和，对细胞的损伤也更小^[30-31]。

研究表明，两种酶消化法均可产出真皮成纤维细胞，但是与胰蛋白酶消化法相比，中性蛋白酶+胶原酶消化法可以更快获得更有活力和功能的细胞，减少细胞增殖所需的时间。原因可能是胰蛋白酶的消化特异性相对中性蛋白酶和胶原酶较差，同时其细胞毒性也高于中性蛋白酶和胶原酶。因此，虽然中性蛋白酶和胶原酶与胰蛋白酶相比并不具有价格优势，但是其消化分离细胞的效率优势足以弥补这一点。这一研究结果将为分离、培养真皮成纤维细胞提供更有效的方法和参考依据，为促进真皮成纤维细胞在组织工程中的进一步广泛的研究与应用奠定了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响

Human dermal fibroblast isolation using two enzyme digestion methods: a comparative study

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