乳酸干预破骨细胞条件培养基促进内皮细胞血管的生成

doi:10.12307/2025.352

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2210-2217.doi: 10.12307/2025.352

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乳酸干预破骨细胞条件培养基促进内皮细胞血管的生成

黄宏莉1，2，聂闻1，2，麦昱颖1，2，覃媛1，2，廖红兵1，2

1广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院口腔修复科，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2024-03-11 接受日期:2024-05-09 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-10
通讯作者: 廖红兵，博士，教授，广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院口腔修复科，广西壮族自治区南宁市 530021；广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:黄宏莉，女，1998年生，广西壮族自治区北海市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事骨替代材料与组织工程学研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82160192)，项目负责人：廖红兵

Conditioned medium of osteoclasts promotes angiogenesis in endothelial cells after lactic acid intervention

Huang Hongli1, 2, Nie Wen1, 2, Mai Yuying1, 2, Qin Yuan1, 2, Liao Hongbing1, 2

1Department of Prosthodontics, College and Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Restoration and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-03-11 Accepted:2024-05-09 Online:2025-04-18 Published:2024-08-10
Contact: Liao Hongbing, MD, Professor, Department of Prosthodontics, College and Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Restoration and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Huang Hongli, Master candidate, Department of Prosthodontics, College and Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Restoration and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82160192 (to LHB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血管生成：从已有血管结构基础上延伸形成新血管的过程。在骨再生等组织修复过程中，血管生成是损伤部位产生新生血管以支持细胞所需营养物质和氧气的最有效、最快捷方式，促进骨组织血管生成可加速骨缺损修复和改建。
条件培养基：将培养过细胞的培养基除细胞取其上清液，直接用于培养其他细胞或作为其他细胞培养基的添加成分的方法。条件培养基中含有细胞生长所需的活性物质，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和胞外囊泡等，其组成受细胞培养微环境中各种因素的影响，包括细胞接触抑制、细胞生长和分化能力以及理化参数等。

背景：聚乳酸作为可降解的骨组织工程支架材料被广泛用于组织再生与修复研究，在促进组织愈合与新骨形成、血管生成中具有重要作用。
目的：观察聚乳酸降解终产物乳酸对破骨细胞的作用，以及乳酸干预后破骨细胞条件培养基对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能的影响。
方法：①取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，贴壁后分别加入含0，5，10，20 mmol/L乳酸的破骨诱导培养基(含核因子κB受体活化因子配体、体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)，培养5 d后分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶与细胞骨架纤维状肌动蛋白染色，培养24 h后采用RT-PCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶5 mRNA表达。②取对数生长期的RAW264.7细胞，贴壁后分2组培养：对照组加入破骨诱导培养基，实验组加入含10 mmol/L乳酸的破骨诱导培养基，培养5 d后更换为无血清DMEM培养基继续培养24 h，离心取上清液，分别与等体积含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基混合后作用条件培养基备用。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，分别与对照组、实验组条件培养基共培养，通过CCK-8、Transwell、划痕、成管实验观察细胞的增殖、迁移和成管能力，通过RT-PCR和Western Blot检测血管生成相关基因和蛋白的表达。
结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶与肌动蛋白染色结果显示，5，10 mmol/L乳酸可促进RAW264.7细胞破骨向分化，其中以10 mmol/L乳酸的促进作用更显著；RT-PCR检测结果显示，5，10，20 mmol/L乳酸均可提高酒石酸酸性磷酸酶5 mRNA的表达，其中以10 mmol/L乳酸的提高作用最显著；②与对照组条件培养基相比，实验组条件培养基可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移与成管能力(P < 0.05)，提高血管内皮生长因子、血管生成素1的mRNA和蛋白表达(P < 0.05)；③结果表明，乳酸诱导分化的破骨细胞条件培养基可促进内皮细胞的血管生成，机制可能与提高血管内皮生长因子、血管生成素1表达相关。
https://orcid.org/0009-0006-3765-1618(黄宏莉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 破骨细胞, 条件培养基, 乳酸, 人脐静脉内皮细胞, 血管生成, 内皮细胞

Abstract: BACKGROUND: As a degradable scaffold material for bone tissue engineering, lactic acid is widely used in tissue regeneration and repair research, and plays an important role in promoting tissue healing, new bone formation and angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the effect of lactic acid degradation products on osteoclasts and to investigate the effects of lactic-interfered osteoclast conditioned medium on the proliferation, migration and tube-forming capacity of human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: (1) The mouse monocyte macrophage cell line RAW264.7 at logarithmic growth period was selected, and adherent cells were cultured in the osteoclast induction medium (DMEM medium with nuclear factor-κB receptor-activating factor ligand and 10% fetal bovine serum) containing different concentrations of lactic acid (0, 5, 10, 20 mmol/L). After 5 days of culture, tartrate-resistant acid phosphatase staining and cytoskeletal fibrillar actin staining were conducted. After 24 hours of culture, RT-PCR was used to detect the mRNA expression of tartrate-resistant acid phosphatase 5. (2) RAW264.7 cells at logarithmic growth period were selected and adherent cells were divided into two groups. Control group was cultured in the osteoclast induction medium, while experimental group was cultured in the osteoclast induction medium containing 10 mmol/L lactic acid. After 5 days of culture, the medium in each group was removed and the cells in the two groups were cultured in the serum-free DMEM medium for another 24 hours. Cell supernatant was then collected and used as the conditioned medium after mixed with an equal volume of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Human umbilical vein endothelial cells at the logarithmic growth phase were taken and separately co-cultured with the conditioned medium of the control and experimental groups. The proliferation, migration and tube-forming ability of human umbilical vein endothelial cells were observed by cell counting kit-8 assay, migration assay, scratch assay and tube-forming assay. The mRNA and protein expression of angiogenesis-related genes and proteins were observed by RT-PCR and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase staining and cytoskeletal fibrillar actin staining showed that 5 and 10 mmol/L lactic acid promoted osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells and the promoting effect of 10 mmol/L lactate was more significant. RT-PCR results showed that the expression of tartrate-resistant acid phosphatase-5 mRNA of osteoclast-related genes was the highest when the lactic acid concentration was 5, 10, and 20 mmol/L (P < 0.05), especially 10 mmol/L. Compared with the control group, the proliferation, migration and tube-forming abilities of human umbilical vein endothelial cells were significantly increased in the experimental group (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of vascular endothelial growth factor and angiogenin 1 mRNA and protein were increased in the experimental group (P < 0.05). To conclude, lactate-induced osteoclast conditioned medium could promote the angiogenesis of endothelial cells, and the mechanism may be related to the promotion of the expression of vascular endothelial growth factor and angiogenin 1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: osteoclast, conditioned medium, lactic acid, human umbilical vein endothelial cell, angiogenesis, endothelial cell

中图分类号:

黄宏莉, 聂闻, 麦昱颖, 覃媛, 廖红兵. 乳酸干预破骨细胞条件培养基促进内皮细胞血管的生成[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2210-2217.

Huang Hongli, Nie Wen, Mai Yuying, Qin Yuan, Liao Hongbing. Conditioned medium of osteoclasts promotes angiogenesis in endothelial cells after lactic acid intervention[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2210-2217.

图/表（结果） 6

2.1 乳酸对RAW264.7细胞的毒性作用 CCK-8实验检测不同浓度乳酸对RAW264.7细胞增殖的影响，结果见图1。培养第3，5天，与0 mmol/L乳酸组比较，5，10，
20 mmol/L乳酸组细胞吸光度值无明显变化(P > 0.05)，说明5-20 mmol/L乳酸不影响RAW264.7细胞的增殖活性。
活死染色观察不同浓度乳酸对RAW264.7细胞活性的影响，结果见图2。各组绿色荧光标记的活细胞状态良好，红色荧光标记的死细胞数目无明显差异。于是选取乳酸浓度为5，10，20 mmol/L用于后续实验。
2.2 乳酸对破骨细胞分化的形态学影响各组细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果见图3A。0 mmol/L乳酸组有散在分布的破骨样细胞，5，10 mmol/L乳酸组可见大量破骨样细胞形成，并且以10 mmol/L乳酸组破骨样细胞形成更多；20 mmol/L乳酸组破骨样细胞形成明显减少。定量分析结果显示，5，10 mmol/L乳酸组破骨样细胞数量多于0 mmol/L乳酸组 (P < 0.05)，20 mmol/L乳酸组破骨样细胞数量少于0 mmol/L乳酸组 (P < 0.05)，见图3B。结果表明，10 mmol/L乳酸对核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化促进效果最明显。
采用F-actin标记后可观察到细胞肌动蛋白环呈绿色，其中含有3个或3个以上的DAPI蓝染细胞核为即为破骨样细胞。各组细胞纤维状肌动蛋白染色结果见图3C。各组均可见清晰的绿色环形肌动蛋白环结构，并且细胞内可见大量DAPI蓝染的细胞核堆积，其中10 mmol/L乳酸组可观察到较大的肌动蛋白环且结构相对完整，与抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果相符。
2.3 乳酸对破骨细胞相关基因表达的影响 RT-PCR检测结果显示，5，10，20 mmol/L乳酸组抗酒石酸酸性磷酸酶

5的mRNA相对表达均高于0 mmol/L乳酸组(P < 0.05)，10 mmol/L乳酸组抗酒石酸酸性磷酸酶5的mRNA相对表达高于5，20 mmol/L乳酸组(P < 0.05)，见图3D。
2.4 条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响 CCK-8检测结果显示，对照组条件培养基培养人脐静脉内皮细胞48，72 h的增殖吸光度值均低于实验组条件培养基(P < 0.05)，见图4。
2.5 条件培养基对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响 Transwell小室实验结果显示，实验组条件培养基培养12 h后迁移的人脐静脉内皮细胞数量多于对照组条件培养基(P < 0.05)，见图5A，B。划痕实验结果显示，实验组条件培养基培养12 h后的人脐静脉内皮细胞迁移率高于对照组条件培养基(P < 0.05)，见图5C，D。
2.6 条件培养基对人脐静脉内皮细胞成管能力的影响细胞接种6 h后在显微镜下可观察到对照组与实验组条件培养基干预的人脐静脉内皮细胞均有管样结构形成，见图6A。使用Image J软件对两组形成的交叉点、分支点和总血管长度进行比较，结果显示实验组条件培养基干预后人脐静脉内皮细胞形成的交叉点、分支点和总血管长度均大于对照组条件培养基(P < 0.05)，见图6B，提示实验组条件培养基促进了人脐静脉内皮细胞的成管能力。

2.7 条件培养基对人脐静脉内皮细胞血管生成相关因子表达的影响 RT-PCR和Western Blot检测结果显示，与对照组条件培养基比较，实验组条件培养基干预后人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子、血管生成素1的mRNA和蛋白表达均升高(P < 0.05)，见图7。

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引言

由于肿瘤、创伤、感染等原因导致的骨缺损再生和修复一直是临床上面临的挑战，虽然自体骨仍然是骨移植的金标准，但自体骨量有限且易带来二次创伤，异体骨和异种骨移植可能引起免疫排斥现象等，因此，骨替代材料修复骨缺损受到越来越多的关注[1-3]。聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，与其他材料复合时可加速材料的降解和促进新骨形成，可作为骨组织工程支架材料应用于骨缺损修复[4-6]。
聚乳酸在体内通过酶解和水解最终生成乳酸。一直以来乳酸被认为是糖酵解的代谢废物，但近年来越来越多的研究表明，乳酸在调节机体生理和病理的过程中起着重要作用[7-8]。乳酸可以通过其特异性的单羧酸转运蛋白进出细胞[9]，在细胞膜上结合其内源性受体羟基羧酸受体1[8]，在能量代谢[10-11]、免疫反应[12]、炎症反应等生理或病理过程中发挥着重要的信号转导作用[13-16]。同时，乳酸在骨改建过程中的作用也逐渐被关注。
破骨细胞是一类由单核巨噬细胞分化而来的多核巨细胞，在骨内主要行使骨吸收功能，参与骨稳态的维持[17]。研究发现，许多由破骨细胞分泌的因子在新血管形成过程中起着重要作用，包括血管内皮生长因子[18]、骨形态发生蛋白7[19]、表皮生长因子受体等[20]，提示破骨细胞在骨重建过程中可以通过旁分泌作用参与新血管形成。因此，可以通过调控破骨细胞的分化促进材料的血管化和骨再生。此外，破骨细胞表面分布有大量的单羧酸转运蛋白，可调节破骨细胞对乳酸的摄取和转运。有研究表明，乳酸作为乳腺癌细胞糖酵解反应产生的代谢产物可通过单羧酸转运蛋白1被破骨细胞摄取，进而促进破骨细胞活性[21]。但乳酸是否能够调节破骨细胞分化实现其促血管生成功能仍然未知。
基于以上研究与假设，此次实验通过模拟聚乳酸降解终产物微环境，观察乳酸刺激对破骨细胞的作用及其条件培养基对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能的影响，以期为聚乳酸骨组织工程支架材料的设计及应用提供科学依据和理论指导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间比较采用t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年11月至2023年5月在广西医科大学口腔颌面修复与重建研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与试剂小鼠巨噬细胞系RAW264.7(海星生物科技有限公司，中国)；人脐静脉内皮细胞(广西医科大学口腔医学院王代友课题组赠送)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；DMEM培养基(Gibco，美国)；Matrigel基质胶(BD Biosciences，美国)；乳酸(Sigma-Aldrich，美国)；核因子κB受体活化因子配体(R&D system，美国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)；BCA蛋白定量试剂盒(Boster，中国)；Trizol、反转录试剂盒(TaKaRa，日本)；SDS-PAGE彩色凝胶试剂盒(BBI，中国)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、RIPA裂解液(碧云天，中国)；血管内皮生长因子抗体(Santa Cruz，美国)；血管生成素1抗体、β-actin抗体(Proteintech，中国)。
1.3.2 仪器超净工作台(上海智城，中国)；酶标仪(TECAN，美国)；倒置像差显微镜(Olympus，日本)；CO2细胞培养箱、荧光定量PCR仪(Thermo Scientific，美国)；电泳仪、蛋白电泳槽、蛋白转膜槽(Bio-Rad，美国)；NanoDrop分光度计(Thermo Fisher Scientific，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验准备
液体配制：①DMEM完全培养基：90% DMEM基础培养基+体积分数10%胎牛血清；②破骨诱导培养基：DMEM完全培养基+50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体。
细胞培养：采用DMEM完全培养基培养RAW264.7细胞及人脐静脉内皮细胞，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中。两三天换液1次，当细胞融合至培养瓶底面积80%-90%时进行传代处理。后续实验选取对数生长期细胞。
1.4.2 乳酸对RAW264.7细胞的毒性作用
CCK-8实验：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞密度为1×103/孔。待细胞贴壁后更换为含不同浓度(0，5，10，20 mmol/L)乳酸的DMEM完全培养基，每组5个复孔，隔天换液。培养第3，5天，每孔加入10 μL CCK-8试剂避光孵育1 h，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。
细胞活死染色：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞密度为1×103/孔。待细胞贴壁后更换为含不同浓度(0，5，10，20 mmol/L)乳酸的DMEM完全培养基，每组3个复孔，隔天换液。培养第3，5天弃原培养液，用PBS漂洗3次，加入配制好的染色液(Calcein AM、PI、检测缓冲液按照1 μL∶1 μL∶1 mL比例配制)37 ℃避光孵育30 min，置于显微镜下观察拍照。每孔随机选取5个视野。
1.4.3 乳酸对RAW264.7细胞破骨分化的作用
抗酒石酸酸性磷酸酶染色：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞密度为1×103/孔。待细胞贴壁后更换为含不同浓度乳酸(0，5，10，20 mmol/L)的破骨诱导培养基，每组3个复孔，隔天换液。诱导培养5 d后，用PBS漂洗3次，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min；加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色液37 ℃避光孵育30 min，置于显微镜下拍照计数，每孔随机选取5个视野。胞质内含大量酒红色颗粒且大量胞核(≥3)堆积即认定为破骨样细胞。
细胞骨架纤维状肌动蛋白染色：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞密度为1×103/孔。待细胞贴壁后更换为含不同浓度乳酸(0，5，10，20 mmol/L)的破骨诱导培养基，每组3个复孔，隔天换液。诱导培养5 d后，用PBS漂洗3次，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min，用含0.1% Triton X-100的PBS穿膜5 min。加入纤维状肌动蛋白染色液室温避光孵育1 h，加入DAPI染色液避光孵育5 min，置于显微镜下拍照观察细胞骨架形态。每孔随机选取3个视野。

RT-PCR实验检测抗酒石酸酸性磷酸酶5 mRNA表达：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板内，每孔2 mL，细胞密度为2×105/孔。待细胞贴壁后更换为含有不同浓度乳酸(0，5，10，20 mmol/L)的破骨诱导培养基，每组3个复孔，隔天换液。诱导培养24 h后，按照TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计检测每个样品浓度，反转录生成cDNA后进行荧光定量PCR扩增，以GAPDH为内参，检测破骨相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶5的mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

1.4.4 条件培养基的收集将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板内，每孔2 mL，细胞密度为1×105/孔。待细胞贴壁后分2组干预：对照组更换为破骨诱导培养基，实验组更换为含10 mmol/L乳酸的破骨诱导培养基，每组3个复孔，隔天换液。诱导培养5 d后更换为无血清DMEM培养基继续培养24 h，3 000 r/min离心10 min以去除细胞碎片，取上清液，0.22 μm滤器过滤，分装后放置于-80 ℃冰箱保存备用。两组上清液分别与新鲜DMEM完全培养基等体积混合后用于后续实验。
1.4.5 条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖的影响将对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于96孔板内，每孔100 μL，细胞密度为2×103/孔。待细胞贴壁后分别更换为对照组与实验组条件培养基。培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂避光孵育1 h，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。
1.4.6 条件培养基对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响
Transwell小室实验：将Transwell小室(孔径为8 μm)嵌入24孔板，将对数生长期的人脐静脉内皮细胞(无血清)接种于小室中，每孔400 μL，细胞密度为8×103/孔；下室分别加入700 μL对照组与实验组条件培养基，每组设置3个复孔，置于培养箱中培养。培养12 h后取出小室，擦去上室未迁移的细胞，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，用PBS漂洗后加入结晶紫染液染色15 min，置于显微镜下拍照计数。每孔随机选取5个视野，使用Image J软件统计迁移至小室下方的细胞数量。
划痕实验：将对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板内，每孔2 mL，细胞密度为5×103/孔。待细胞铺满孔板后换用无血清DMEM培养基饥饿处理12 h，然后用200 μL枪头垂直划一直线，用PBS漂洗3次后分别更换为对照组与实验组条件培养基继续培养12 h。分别在划痕后0，12 h使用显微镜在同一视野观察拍照，使用Image J软件计算细胞迁移率。
1.4.7 条件培养基对人脐静脉内皮细胞成管能力的影响在血管生成载玻片每孔加入10 μL Matrigel基质胶，置于4 ℃冰箱中平衡10 min，确保胶铺平且无气泡，后将其置于培养箱中静置30 min使胶凝固。将对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于血管生成载玻片上，细胞密度为1×104/孔，每孔分别加入对照组与实验组条件培养基50 μL，培养4-6 h后置于显微镜下拍照观察血管形成情况，使用Image J统计分析总血管长度、血管交叉点和分支点数。
1.4.8 条件培养基对人脐静脉内皮细胞血管生成因子表达的影响
RT-PCR检测：将对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板内，每孔2 mL，细胞密度为3×105/孔，待细胞贴壁后分别更换为对照组与实验组条件培养基，每组设置3个复孔。培养24 h后去除旧培养基，用PBS漂洗3次，按照TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计检测每个样品浓度，反转录生成cDNA后进行荧光定量PCR扩增，以β-actin为内参，检测成血管相关基因血管内皮生长因子、血管生成素1的mRNA相对表达。引物序列见表1。
Western Blot检测：将对数生长期的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板内，每孔2 mL，细胞密度为5×105/孔，待细胞贴壁后分别更换为对照组与实验组条件培养基，每组设置3个复孔。培养24 h后去除旧培养基，用PBS漂洗3次，加入RIPA裂解液，12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA法测细胞蛋白浓度，95 ℃下变性5 min。使用一步法制胶，每孔蛋白上样量为30 μg，80 V恒压电泳30 min后调整至120 V电泳60 min。采用湿法转至PVDF膜上，200 mA转膜90 min，封闭，4 ℃过夜孵育一抗血管内皮生长因子(1∶1 200)、血管生成素1(1∶2 500)、β-actin(1∶5 000)，室温孵育二抗(1∶20 000)1 h，加入显影液，上机曝光。使用Image J软件分析血管内皮生长因子、血管生成素1蛋白表达。
1.5 主要观察指标 ①不同乳酸浓度作用下RAW264.7细胞破骨向分化情况；②乳酸诱导分化的破骨细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和成管能力的影响，以及对内皮细胞血管生成相关基因和蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析实验数据采用Graphpad Prism 9.5软件进行方差分析和t检验。每组实验至少重复3次，结果表示为x±s，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

促进缺损骨组织的修复和再生在临床治疗中具有重要意义，近年来随着骨组织工程技术的发展，骨替代材料植入成为骨缺损修复最具潜力的治疗手段。聚乳酸因具有良好生物相容性、生物降解性和易加工性，于1995年被美国食品与药物管理局批准作为生物降解医用材料。乳酸为聚乳酸等高分子聚合物的合成基质材料，同时也是其降解后的主要产物。一直以来，乳酸都被认为是糖酵解的代谢废物，不具备生物学功能，但是研究发现乳酸在基因转录调控、信号转导[22]、免疫细胞的功能表型转化[23]、促进干细胞的活性和增殖等调节机体生理和病理过程中发挥着重要的调控作用[24]。近年来，乳酸在骨改建过程中的作用被广泛关注。有研究表明，乳酸处理MC3T3-E1细胞可引起活性氧依赖的内质网应激，进而调节成骨细胞分化[25]；乳酸也可以依赖缺氧诱导因子1α信号促进甲状旁腺激素因子释放，从而调节成骨细胞分化[26]；间充质干细胞还通过分泌乳酸进行代谢重编程，使单核细胞来源的树突状细胞向M2型巨噬细胞分化，进而抑制免疫反应和促进组织修复[27]，提示骨骼微环境中的乳酸是骨稳态调节的重要分子，但目前乳酸对破骨细胞的作用研究尚不清楚。
破骨细胞由单核/巨噬细胞分化而来，是目前证实唯一参与骨吸收的细胞，在骨再生修复中发挥着重要的作用。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7可在核因子κB受体活化因子配体的刺激下分化为破骨细胞，是目前公认的运用较广的一种破骨细胞前体细胞。此次实验首先使用浓度梯度乳酸干预RAW264.7细胞，CCK-8实验和细胞活死染色结果显示，乳酸浓度≤20 mmol/L对RAW264.7细胞的增殖活性无明显影响。以往研究表明，不同类型的细胞对乳酸的耐受能力并不相同：MC3T3-E1细胞在乳酸浓度为20 mmol/L时可发生凋亡；PATEL等[28]研究发现，当乳酸浓度超过20 mmol/L时造血细胞将停止生长；不同种属来源的间充质干细胞对乳酸的敏感性也不一样，如抑制人、羊、鼠骨髓间充质干细胞增殖的乳酸浓度分别为35.4，28.4和16 mmol/L[29]，人体细胞对乳酸表现出更强的耐受性。由于破骨细胞在降解骨矿物质及基质时其功能的活化依赖于酸性环境，结合此次实验可得出，破骨细胞对乳酸引起的酸性环境具有一定的耐受能力。
抗酒石酸酸性磷酸酶是分布在破骨细胞中的标志酶，常作为鉴别破骨细胞的重要标志物[30]。成熟的破骨细胞体积大、多核，并形成有褶皱边缘的肌动蛋白环结构，破骨细胞的肌动蛋白环是一种典型的肌动蛋白，这种环形结构对破骨细胞的活性非常重要。此次实验结果显示，当乳酸浓度为10 mmol/L时，抗酒石酸酸性磷酸酶和肌动蛋白染色结果可见形成的破骨样细胞数目较其他3组多，提示乳酸对破骨细胞分化具有促进作用。抗酒石酸酸性磷酸酶5被认为是破骨细胞的组织化学标记物，参与破骨细胞的分化和激活[31]。RT-PCR检测结果显示，10 mmol/L乳酸显著上调了破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶5 mRNA的表达，表明乳酸可促进RAW2647细胞破骨向分化，促进作用的强弱与乳酸浓度相关。
目前影响破骨前体细胞破骨向分化的因素众多，其中最主要的是核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子-骨保护素轴，是指破骨前体细胞在巨噬细胞集落刺激因子作用下，成骨谱系细胞分泌核因子κB受体活化因子配体并与破骨前体细胞表面的核因子κB受体活化因子结合，激活破骨前体细胞使其进一步分化为成熟的多核破骨细胞。其他因素如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等细胞因子也参与了破骨细胞分化的调控。此外，破骨细胞表面分布有大量的单羧酸转运蛋白，可以介导破骨细胞对乳酸的摄取和转运。据报道，10 mmol/L乳酸可通过单羧酸转运蛋白1被破骨细胞摄取，并作为破骨细胞氧化代谢的燃料，在不影响破骨细胞生成的情况下促进破骨细胞骨吸收活性[21]。但QIAN等[32]研究认为，乳酸通过激活破骨前体细胞中PI3K-AKT-CREB通路并上调CXCL10的表达，刺激CD4+ T细胞的募集并诱导产生核因子κB受体活化因子配体，最终促进CD115+前体细胞分化为破骨细胞。此次实验结果表明，乳酸不仅能促进破骨细胞分化，还能促进破骨细胞的功能，与之前的研究结果不一致的原因可能是实验选取的细胞谱系及细胞培养环境不同，但具体的机制还有待进一步研究。
骨是一种高度血管化的组织，依靠血管提供必须的氧气和营养，因此组织工程支架材料的血管化在骨缺损修复过程中起着关键作用。对于骨中血管生成的调节机制已有大量文献报道，包括内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞和其他骨细胞之间的相互作用。研究发现，破骨细胞分泌的许多因子如血管内皮生长因子[18]、骨形态发生蛋白7[19]、表皮生长因子受体7等[20]，都在血管生成中起重要作用，提示破骨细胞可以通过旁分泌途径直接参与新血管的形成。此外，破骨细胞还可以间接促进血管生成，如CACKOWSKI等[33]体内研究证实破骨细胞刺激血管生成的作用依赖于其释放的基质金属蛋白酶9，其通过诱导破骨细胞的迁移来调节破骨细胞刺激的血管生成。以上研究提示破骨细胞在促进骨血管化中的重要性，结合此次实验结果证实乳酸可促进细胞破骨向分化，但乳酸是否能够调节破骨细胞分化实现其促血管生成功能仍然未知，其中潜在的调节机制也尚不清楚。
血管生成是指一个新血管从预先存在的血管系统中长出的过程，包括内皮细胞的激活、增殖与迁移，是多种生长因子、细胞因子、趋化因子等之间的相互协调作用的复杂过程[34]。条件培养基中含有细胞外基质、血管生成因子、生长因子、细胞因子和胞外囊泡等[35]，在组织修复与再生中表现出巨大的潜力，具有促进骨组织再生[36]、血管生成的功能[37]，并具有趋化活性，可以发挥免疫调节的作用。作为细胞共培养的产物，条件培养基获取方便，可以广泛用于研究体外细胞间的相互作用。为了更好地模拟骨替代材料植入体内后细胞之间相互作用的微环境，通过提取乳酸干预后的破骨细胞上清液作为条件培养基来培养人脐静脉内皮细胞，发现该条件培养基能够促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，初步阐明在乳酸作用下破骨细胞条件培养基可以促进内皮细胞血管生成。新血管生成是由血管内皮生长因子诱导的。血管内皮生长因子来源于肥大软骨细胞和前成骨细胞，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，通过直接与细胞表面的相应受体(如血管内皮生长因子受体2)结合促进内皮细胞的增殖、迁移和新血管的形成，进而增强骨再生所需氧气和营养物质的供应，同时还能提高成骨细胞的活性，从而促进骨再生[38]。血管生成素家族生长因子主要通过与酪氨酸激酶受体结合发挥作用，其中血管生成素1是在新血管形成的后续阶段中起作用，主要参与内皮细胞的成熟、稳定新形成的血管，还能通过激活PI3K/Akt信号通路发挥抗内皮细胞凋亡的作用，并能促进内皮细胞迁移和小管形成。另外，血管生成素1和血管内皮生长因子能够协同作用于血管生成和创面愈合[39]。此次实验RT-PCR和Western Blot检测结果显示，乳酸干预后的破骨细胞条件培养基较对照组条件培养基显著上调了内皮细胞血管内皮生长因子和血管生成素1基因和蛋白的表达水平，提示乳酸诱导分化的破骨细胞可能通过旁分泌途径促进人脐静脉内皮细胞的血管生成，机制可能与促进血管内皮生长因子和血管生成素1表达相关，但是细胞培养基中内容物复杂，分泌在其中的细胞因子或者外泌体等对血管生成的作用及其相关机制还有待进一步探讨。
综上所述，此次实验选用聚乳酸降解终产物乳酸作为研究对象，通过体外实验探究了乳酸对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响，并且通过共培养发现乳酸诱导分化的破骨细胞可促进内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，接下来将进一步深入研究破骨细胞影响血管生成的具体机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

乳酸干预破骨细胞条件培养基促进内皮细胞血管的生成

Conditioned medium of osteoclasts promotes angiogenesis in endothelial cells after lactic acid intervention

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