氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层对RAW264.7巨噬细胞免疫活性的影响

doi:10.12307/2025.212

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (10): 2023-2029.doi: 10.12307/2025.212

• 抗菌抗病毒材料 antibacterial and antiviral materials • 上一篇下一篇

氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层对RAW264.7巨噬细胞免疫活性的影响

马丽莎1，2，何惠宇1，2，吾凡别克·巴合提1，3，吕尚毅1，4，韩祥祯1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；3新疆维吾尔自治区医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；4中国人民解放军新疆军区总医院颌面外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830099

收稿日期:2023-09-19 接受日期:2024-01-05 出版日期:2025-04-08 发布日期:2024-08-21
通讯作者: 韩祥祯，硕士，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:马丽莎，女，1997年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔修复学及组织工程基础研究。
基金资助:
2021年新疆维吾尔自治区科技援疆计划项目(2020E02133)，项目负责人：韩祥祯

effect of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating on immune activity of RAW264.7 macrophages

Ma Lisha1, 2, He Huiyu1, 2, Wufanbieke·Baheti1, 3, Lyu Shangyi1, 4, Han Xiangzhen1, 2

1Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Stomatology, Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Department of Maxillofacial Surgery, Xinjiang Military Region General Hospital, Urumqi 830099, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-09-19 Accepted:2024-01-05 Online:2025-04-08 Published:2024-08-21
Contact: Han Xiangzhen, Master, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Ma Lisha, Master candidate, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
2021 Xinjiang Uygur Autonomous Region Science and Technology Assistance Plan Project, No. 2020E02133 (to HXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化石墨烯：是由6个碳原子所组成的六圆环二维原子晶体，拥有较大的比表面积、较强的力学性能、较多的含氧基团，在与其他材料进行结合后可提升复合材料的机械性能、亲水性和与聚合物基体的亲和性。
异物反应：当钛种植体等修复材料植入机体后，免疫系统应对外来异物所做出的应答反应，主要由材料表面的巨噬细胞及异物巨细胞主导，炎症反应的长期存在可能会引发部分植入物过早的裂解，导致修复治疗失败，因而异物反应与机体组织再生的平衡成为研究的关键。

背景：纯钛种植体植入机体后存在骨融合失败或者种植体周围感染等问题，因此对钛种植体表面进行改良已成研究的热门话题。巨噬细胞是机体应对外界刺激的一道免疫防线，任何生物材料植入体内后的相关免疫反应均与巨噬细胞相关。
目的：采用电化学沉积法在纯钛片表面制备氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层，分析涂层的表面特征及对RAW264.7巨噬细胞生长、极化的影响。
方法：采用电化学沉积法在纯钛片表面分别制备单纯氧化石墨烯涂层、氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层，表征涂层的物理性能。将纯钛片(空白组)、沉积单纯氧化石墨烯涂层的钛片(对照组)、沉积氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层的钛片(实验组)分别与RAW264.7巨噬细胞共培养，采用CCK-8法、DAPI染色检测细胞增殖，扫描电镜观察细胞在钛片表面的黏附，流式细胞仪检测细胞极化表型。
结果与结论：①扫描电镜下可见纯钛片有定向划痕与少量点状凹陷；沉积单纯氧化石墨烯涂层后，钛片表面可见较多裂纹沟壑和大小不均匀的颗粒状物，以及氧化石墨烯特征的褶皱样结构；沉积复合涂层后，钛片表面较光滑，可见团状颗粒，颗粒大小较为均匀。沉积复合涂层钛片的水接触接角小于纯钛片、沉积单纯氧化石墨烯涂层的钛片(P < 0.05)。②CCK-8检测与DAPI染色显示，相较于空白组、对照组，实验组细胞增殖更快。扫描电镜下可见RAW264.7细胞均黏附于3组钛片表面，随着培养时间的延长细胞形态发生改变，由圆形向梭形转变，至培养7 d时，空白组细胞伸出的伪足短而少，对照组细胞伸出长而多的伪足，实验组细胞伸出短而多的伪足，并且实验组细胞整体饱满度最优。流式细胞仪检测显示，实验组细胞更高比例向抗炎方向M2型极化。③结果表明，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层具有良好的理化性能及生物学性能。
https://orcid.org/0009-0001-6329-8436(马丽莎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 氧化石墨烯, 羟基磷灰石, 复合涂层, 巨噬细胞, 钛合金, 电沉积化

Abstract: BACKGROUND: There are some problems such as bone fusion failure or peri-implant infection after implantation of pure titanium implants. Therefore, surface improvement of titanium implants has become a hot topic in research. Macrophages are an immune defense line of the body in response to external stimuli, and the relevant immune response of any biomaterials implanted in the body is related to macrophages.
OBJECTIVE: The graphene oxide/hydroxyapatite composite coating on titanium alloy surface was prepared by electrochemical deposition method. The surface characteristics of the coating and the growth and polarization of macrophage RAW264.7 on the surface were analyzed.
METHODS: The graphene oxide coating and graphene oxide/hydroxyapatite composite coating on titanium alloy surface was prepared by electrochemical deposition method. The physical properties of the coating were characterized. Pure titanium sheets (blank group), titanium sheets deposited with pure GO coating (control group) and titanium sheets deposited with graphene oxide/hydroxyapatite composite coating (experimental group) were co-cultured with macrophages RAW264.7, respectively. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay and DAPI staining. Cell adhesion on the surface of titanium was observed by scanning electron microscopy, and cell polarization phenotype was detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under scanning electron microscope, the pure titanium sheet showed directional scratches and a few punctate pits. After the pure graphene oxide coating was deposited, the surface of titanium sheet showed more cracks, gullies and particles of uneven size, and the wrinkle-like structure characterized by graphene oxide. After the composite coating was deposited, the surface of the titanium sheet was smooth, and the pellet size was more uniform. The water contact angle of composite coated titanium sheet was lower than that of pure titanium sheet and pure graphene oxide coated titanium sheet (P < 0.05). (2) CCK-8 assay and DAPI staining showed that compared with the blank group and the control group, the cell proliferation in the experimental group was faster. Scanning electron microscopy showed that RAW264.7 cells all adhered to the surface of the three groups of titanium sheets. With the extension of culture time, cell morphology changed from round to spindle shape. After 7 days of culture, cells in the blank group extended short and few pseudopods; cells in the control group extended long and more pseudopods, and cells in the experimental group extended short and more pseudopods, and the overall cell fullness in the experimental group was the best. Flow cytometry results showed that the cells in the experimental group showed a higher proportion of M2 polarization in the anti-inflammatory direction. (3) These findings conclude that graphene oxide/hydroxyapatite composite coating has good physical, chemical, and biological properties.

Key words: graphene oxide, hydroxyapatite, composite coating, macrophage, titanium alloy, electrodeposition

中图分类号:

马丽莎, 何惠宇, 吾凡别克·巴合提, 吕尚毅, 韩祥祯. 氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层对RAW264.7巨噬细胞免疫活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 2023-2029.

Ma Lisha, He Huiyu, Wufanbieke·Baheti, Lyu Shangyi, Han Xiangzhen. effect of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating on immune activity of RAW264.7 macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(10): 2023-2029.

图/表（结果） 11

2.1 各组样品表面大体观与微观形貌大体观察可见空白组样品呈“镜面样”外观，可见定向划痕；对照组样品呈黄褐色，表面可见黑色的氧化石墨烯细小颗粒；实验组样品呈白黄色，表面较为细腻，未见氧化石墨烯颗粒及钛片表面处理的划痕，见图1。

3组样品的微观形貌见图2所示。低倍镜下，空白组钛片表面可见定向划痕、金刚石颗粒造成的少量点状凹陷；对照组样品表面可见较多裂纹沟壑和大小不均匀的颗粒状物，可见氧化石墨烯特征的褶皱样结构；实验组样品表面钛基底划痕不可见，表面可见团状颗粒，颗粒大小较为均匀。高倍镜下，空白组样品表面丝网状划痕更加明显；对照组样品表面的氧化石墨烯薄膜大面积均匀铺展，氧化石墨烯特征的褶皱样结构明显；实验组样品表面可见氧化石墨烯结构的折叠及羟基磷灰石的片状结晶互相附着。

2.2 各组样品的亲水性接触角是材料表面不受力场影响的圆球状水滴与材料表面所形成的夹角。空白组、对照组、实验组样品表面的静态接触角分别为(55.3±1.7)°，(37.0±1.6)°，(2.0±1.6)°，见图3。3组样品表面接触角比较差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组样品的亲水性最优，为超亲水表面，具有更好促进细胞增殖的潜力。

2.3 各组样品的化学结构如图4所示，对照组、实验组具有明显的G峰(1 598 cm-1处)和D峰(1 357 cm-1处)，G峰表示氧化石墨烯特征性的Sp2结构，D峰是氧化石墨烯无序震动引起的特征峰。空白组没有上述2种波峰的出现。此外，实验组还可以观察到在594，962，588 cm-1处有3个PO43-的特征峰，为羟基磷灰石的特征峰，结合氧化石墨烯特有的G峰和D峰，从化学结构方面进一步验证所得复合涂层中不仅含有氧化石墨烯也含有羟基磷灰石晶体，说明对钛合金表面沉积石墨烯及羟基磷灰石复合涂层成功。

2.4 实验组样品表面的化学元素 X射线能量色散谱检测显示，实验组涂层中含有Ca、P、O、Cl元素，并且均匀分布，见图5，表1。

2.5 各组样品表面RAW264.7细胞的黏附培养至第3代的RAW264.7细胞生长状态良好，细胞形态呈圆形，无明显极化触角，见图6。

3组样品表面RAW264.7细胞的形态见图7所示。培养1 d后，细胞附着于3组样品表面，空白组细胞为圆形，无伪足；对照组组细胞为卵圆形，无伪足伸出；实验组细胞为梭形，伸出的伪足多而短，附着面积大。培养4 d后，各组细胞可见极化趋势，空白组细胞呈圆形，伸出的伪足少而短；对照组细胞呈“梭形”，体积变大，伸出的伪足多而短；实验组细胞呈梭形，体积变小，伸出的伪足短而多。培养7 d后，各组细胞呈极化形态，空白组细胞变为“梭形”，伸出的伪足短而少；对照组细胞为梭形，两极化伸长更明显，伸出的伪足多而长，表面略凹陷；实验组细胞为梭形，体积变大，伸出的伪足多而短，整体饱满度最优。

2.6 各组样品表面RAW264.7细胞的增殖各组样品表面RAW264.7细胞增殖的CCK-8检测结果，见图8。

随着培养时间的延长，各组细胞吸光度值升高。培养1 d后，各组细胞吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养4 d后，实验组细胞吸光度值高于空白组、对照组(P < 0.001，P < 0.000 1)；培养7 d后，实验组细胞吸光度值高于空白组、对照组(P < 0.000 1)。
3组样品表面RAW264.7细胞DAPI染色，见图9，与CCK-8检测结果大致相同。随着培养时间的延长，3组样品表面的RAW264.7细胞数量明显增加并呈簇聚集生长，其中实验组细胞数量多于空白组、对照组。

2.7 各组样品表面RAW264.7细胞M1/M2极化标志物表达使用流式细胞仪对各组样品表面黏附细胞标记物的表达水平进行检测，见图10，其中CD206是M2型巨噬细胞表面标记物之一，CCR-7是M1型巨噬细胞的表面标记物之一。空白组、对照组、实验组细胞的CCR-7阳性表达分别为15.32%，6.32%，2.94%，空白组细胞CCR-7阳性表达高于对照组、实验组(P < 0.05)，对照组与实验组细胞CCR-7阳性表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)。空白组、对照组、实验组细胞的CD206阳性表达分别为21.87%，25.99%，63.42%，实验组细胞的CD206阳性表达高于空白组、对照组(P < 0.05)，空白组、对照组细胞的CD206阳性表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1] 王鸿,吴清霖,赖颖真,等.氧化石墨烯修饰的类骨单位钛表面对巨噬细胞破骨分化影响的研究[J].华西口腔医学杂志,2023,41(2):165-174.
[2] JIANG P, ZHANG Y, HU R, et al. Advanced surface engineering of titanium materials for biomedical applications: From static modification to dynamic responsive regulation. Bioact Mater. 2023;27:15-57.
[3] TRINDADE R, ALBREKTSSON T, GALLI S, et al. Osseointegration and foreign body reaction: Titanium implants activate the immune system and suppress bone resorption during the first 4 weeks after implantation. Clin Implant Dent Relat Res. 2018;20(1):82-91.
[4] SU J, DU Z, XIAO L, et al. Graphene oxide coated Titanium Surfaces with Osteoimmunomodulatory Role to Enhance Osteogenesis. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;113:110983.
[5] SUN J, LI L, XING F, et al. Graphene oxide-modified silk fibroin/nanohydroxyapatite scaffold loaded with urine-derived stem cells for immunomodulation and bone regeneration. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):591.
[6] FEITO MJ, DIEZ-OREJAS R, CICUENDEZ M, et al. Characterization of M1 and M2 polarization phenotypes in peritoneal macrophages after treatment with graphene oxide nanosheets. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019;176:96-105.
[7] HUNG HS, KUNG ML, CHEN FC, et al. Nanogold-Carried Graphene Oxide: Anti-Inflammation and Increased Differentiation Capacity of Mesenchymal Stem Cells. Nanomaterials (Basel). 2021;11(8):2046.
[8] HAN J, KIM YS, LIM MY, et al. Dual Roles of Graphene Oxide To Attenuate Inflammation and Elicit Timely Polarization of Macrophage Phenotypes for Cardiac Repair. ACS Nano. 2018;12(2):1959-1977.
[9] LI K, SHEN Q, XIE Y, et al. Incorporation of Cerium Oxide into Hydroxyapatite Coating Protects Bone Marrow Stromal Cells Against H(2)O(2)-Induced Inhibition of Osteogenic Differentiation. Biol Trace Elem Res. 2018;182(1): 91-104.
[10] BARADARAN S, MOGHADDAM E, BASIRUN WJ, et al. Mechanical properties and biomedical applications of a nanotube hydroxyapatite-reduced graphene oxide composite. Carbon. 2014;69:32-45.
[11] 于婉琦,周延民,赵静辉.口腔种植体新材料的研究现状[J].国际口腔医学杂志,2019,46(4):488-496.
[12] LIANG H, BU Y, ZHANG J, et al. Graphene oxide film as solid lubricant. ACS Appl Mater Interfaces. 2013;5(13):6369-6375.
[13] CHAE SY, PARK R, HONG SW. Surface-mediated high antioxidant and anti-inflammatory effects of astaxanthin-loaded ultrathin graphene oxide film that inhibits the overproduction of intracellular reactive oxygen species. Biomater Res. 2022;26(1):30.
[14] SATTARI S, ADELI M, BEYRANVAND S, et al. Functionalized Graphene Platforms for Anticancer Drug Delivery. Int J Nanomedicine. 2021;16:5955-5980.
[15] TOPUZ M, DIKICI B, GAVGALI M. Titanium-based composite scaffolds reinforced with hydroxyapatite-zirconia: Production, mechanical and in-vitro characterization. J Mech Behav Biomed Mater. 2021;118:104480.
[16] 龙智生,熊龙,龚飞鹏,等.多尺度羟基磷灰石/壳聚糖微管结构人工骨对兔骨缺损修复及成血管的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(34): 5436-5441.
[17] 杨帮成,周学东,于海洋,等.钛种植体表面改性方法[J].华西口腔医学杂志,2019,37(2):124-129.
[18] LI J, ZHAO C, XU Y, et al. Remodeling of the osteoimmune microenvironment after biomaterials implantation in murine tibia: Single-cell transcriptome analysis. Bioact Mater. 2023;22:404-422.
[19] MUKHERJEE SP, GUPTA G, KLODITZ K, et al. Next-Generation Sequencing Reveals Differential Responses to Acute versus Long-Term Exposures to Graphene Oxide in Human Lung Cells. Small. 2020;16(21):e1907686.
[20] LI Q, SHEN A, WANG Z. Enhanced osteogenic differentiation of BMSCs and M2-phenotype polarization of macrophages on a titanium surface modified with graphene oxide for potential implant applications. RSC Adv. 2020;10(28):16537-16550.
[21] KANG MS, JEONG SJ, LEE SH, et al. Reduced graphene oxide coating enhances osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on Ti surfaces. Biomater Res. 2021;25(1):4.
[22] STEVANOVIC M, DJOSIC M, JANKOVIC A, et al. Antibacterial graphene-based hydroxyapatite/chitosan coating with gentamicin for potential applications in bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2020;108(11):2175-2189.
[23] LU M, CHEN H, YUAN B, et al. Electrochemical Deposition of Nanostructured Hydroxyapatite Coating on Titanium with Enhanced Early Stage Osteogenic Activity and Osseointegration. Int J Nanomedicine. 2020;15:6605-6618.
[24] LIAO Y, WANG W, LI Z, et al. Comparative proteomic analysis reveals cytotoxicity induced by graphene oxide exposure in A549 cells. J Appl Toxicol. 2021;41(7):1103-1114.
[25] KARIMI N, KHARAZIHA M, RAEISSI K. Electrophoretic deposition of chitosan reinforced graphene oxide-hydroxyapatite on the anodized titanium to improve biological and electrochemical characteristics. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2019;98:140-152.
[26] 孙文昕,樊丽君,郑钟印,等.医用金属表面含锶涂层耐蚀性和生物相容性研究进展[J].材料工程,2021,49(12):72-82.
[27] 吕尚毅,何惠宇,吾凡别克·巴合提,等.氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性[J].中国组织工程研究,2024,28(10): 1477-1483.
[28] 吾凡别克·巴合提.羟基磷灰石-氧化石墨烯纳米涂层促进成骨分化及调节巨噬细胞极化的研究[D]. 乌鲁木齐:新疆医科大学,2023.
[29] 何懋典.还原氧化石墨烯修饰壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架的性能研究[D].广州:南方医科大学,2023.
[30] ERIKSSON C, NYGREN H, OHLSON K. Implantation of hydrophilic and hydrophobic titanium discs in rat tibia: cellular reactions on the surfaces during the first 3 weeks in bone. Biomaterials. 2004;25(19):4759-4766.
[31] WANG X, MEI L, JIANG X, et al. Hydroxyapatite-Coated Titanium by Micro-Arc Oxidation and Steam-Hydrothermal Treatment Promotes Osseointegration. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:625877.
[32] SUNARSO, TOITA R, TSURU K, et al. A superhydrophilic titanium implant functionalized by ozone gas modulates bone marrow cell and macrophage responses. J Mater Sci Mater Med. 2016;27(8):127.
[33] HOTCHKISS KM, REDDY GB, HYZY SL, et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 2016;31:425-434.
[34] NOGUEIRA RP, DEUZIMAR UJ, HILARIO F, et al. Characterization of Optimized TiO2 Nanotubes Morphology for Medical Implants: Biological Activity and Corrosion Resistance. Int J Nanomedicine. 2021;16:667-682.
[35] LORENZETTI M, GONGADZE E, KULKARNI M, et al. Electrokinetic Properties of TiO2 Nanotubular Surfaces. Nanoscale Res Lett. 2016;11(1):378.
[36] KYRIAKIDES TR, KIM HJ, ZHENG C, et al. Foreign body response to synthetic polymer biomaterials and the role of adaptive immunity. Biomed Mater. 2022;17(2):10.1088/1748-605X/ac5574.
[37] CICUENDEZ M, CASARRUBIOS L, BARROCA N, et al. Benefits in the Macrophage Response Due to Graphene Oxide Reduction by Thermal Treatment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6701.
[38] HUANG M, XIAO M, DONG J, et al. Synergistic anti-inflammatory effects of graphene oxide quantum dots and trans-10-hydroxy-2-decenoic acid on LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage cells. Biomater Adv. 2022; 136:212774.
[39] NEGRESCU AM, MITRAN V, DRAGHICESCU W, et al. TiO2 Nanotubes Functionalized with Icariin for an Attenuated In Vitro Immune Response and Improved In Vivo Osseointegration. J Funct Biomater. 2022;13(2):43.
[40] 何妲.人羊膜上皮细胞干预脂多糖诱导RAW264.7细胞向M1极化及其机制初步研究[D].长沙:中南大学,2014.
[41] 刘梦园,巴亚玛,张程程,等.载银二氧化钛纳米管涂层种植体体内生物相容性研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2013,23(5):303-309.
[42] 陈江,陈旭晞,周麟.骨免疫调节机制对种植体骨结合及骨生物材料引导骨再生的影响[J].口腔疾病防治,2018,26(10):613-620.

引言

目前以钛为主要材料进行的口腔种植修复是主要的牙齿缺损与牙齿缺失补偿方式[1]，然而存在骨融合失败或者种植体周围感染等不足。因此，为提升植入物性能，研究钛种植体表面的改良已成研究的热门话题[2-3]。
纯钛种植体在早期结合过程中明显激活了免疫系统[4]。在全体免疫细胞中，巨噬细胞可根据微环境呈现出各种极化现象，主要的极化模式被划分为传统激活的M1型巨噬细胞和替换激活的M2型巨噬细胞，这两类分别代表了极化状态的2个极限[5]，对骨骼整合过程有直接影响[6]。因此，有必要继续研究植入物表面改性对巨噬细胞极化的影响。
羟基磷灰石与人体硬结构类似，植入人体后能与人体软组织速度紧凑融合[7-8]。羟基磷灰石涂层能够和骨组织形成骨性结合，可以显著提高骨组织与种植体间的界面结合强度[9]。但羟基磷灰石的断裂韧度明显不如人体致密骨，表现为脆性大、断裂韧性低(0.8-1.2 MPa)、弯曲强度低(< 140 MPa)、耐磨性不好[10]，使得其在承受人体压力部分的应用受限，目前的研究重点是通过与其他材料复合来改善羟基磷灰石的生物力学性能[11]。
氧化石墨烯具有良好的机械功能、骨传导功能、骨诱导功能、生物相容性、抗菌能力等[7]，可在植入物表面形成稳定的覆盖层，有效改善固体材料的摩擦磨损性能[12]，这与羟基磷灰石耐磨性差的特点相互弥补，将二者联合可能有助于提升植入物及其周边骨质组织的骨结合、骨感应以及增进覆盖层的抗菌能力[13-14]。氧化石墨烯对骨免疫有一定的调节作用[15]，研究显示修饰有氧化石墨烯的复合材料可以促进巨噬细胞向抗炎M2型方向极化[16-17]。
基于上述背景，作者预测氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层可以影响巨噬细胞的极化过程，并由此影响炎症的发展，起到免疫调节作用。此次实验通过电沉积法制备了氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层，分析涂层的理化特性，利用体外细胞实验分析复合涂层对RAW264.7巨噬细胞黏附、增殖和极化的影响，以探索促进植入物-骨界面炎症愈合的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料表征及体外细胞学实验，组间比较行one-way ANOVE分析，多组间的两两比较使用Bonferroni法。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年6月在新疆医科大学第一附属医院科技楼干细胞研究实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂小鼠巨噬细胞系RAW264.7(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；商用纯钛片(TA1级，纯度> 99.6%，宝鸡泰宇鑫金属有限公司，陕西)；氧化石墨烯水溶液(苏州先丰纳米有限公司，江苏)；纳米羟基磷灰石(埃普瑞纳米材料公司，南京)；D-MEM基础培养液、PBS(Hyclone，美国)；胰酶、胎牛血清(Gibco，美国)；FITC标记的CD206、PE标记的CCR-7抗体(BioLegend，美国)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)。
1.3.2 主要仪器电子天平(BS124S，赛多利斯科学仪器公司，北京)；超声波清洗器(KQ250B，昆山市超声波仪器有限公司)；阳极氧化电源(MATSUSADA，日本)；磁力加热搅拌器(上海帅登仪器有限公司)；超净工作台(苏州净化)；细胞培养箱(Thermo，美国)；扫描电子显微镜(S-4800，Hitachi，日本)；荧光显微镜(IX71，Leica，德国)；流式细胞仪(BuckmanCoulte，美国)；拉曼光谱仪(Dilor，法国)；接触角测量仪(POWEREACH，中国)；X射线能量色散谱仪(auriga-bu，德国蔡司)。
1.4 方法
1.4.1 钛试样的制备将钛片制成1 cm×1 cm×0.1 cm大小，经600#-1 200#砂纸逐号打磨水洗，无水乙醇及丙酮分别超声清洗15 min，去离子水处理钛片20 min后空气干燥。电解液的制备：将0.8 mL氧化石墨烯水溶液(5 mg/mL)加入50 mL无水乙醇中，置于磁力搅拌器中37 ℃搅拌3 h，形成氧化石墨烯悬浮液。向氧化石墨烯悬浮液中加入150 mg纳米羟基磷灰石，置于磁力搅拌器中37 ℃搅拌3 h，形成氧化石墨烯/羟基磷灰石电解液。以上过程均用盐酸调节pH值(pH=5.0-6.0)。涂层的制备：于37 ℃电解槽中行电沉积，加入电解液200 mL(氧化石墨烯电解液、氧化石墨烯-羟基磷灰石电解液)，阳极为石墨棒，阴极为钛片，两电极间距为2.0 cm，磁力搅拌器搅拌，搅拌速度为180 r/min，30 V直流电源，电化学工作站的电流密度为i=0.8 mA/cm2，沉积5 min。取出样品，室温干燥24 h，得到氧化石墨烯涂层(对照组)、氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层(实验组)、无涂层纯钛片(空白组)。
1.4.2 各组样品物理性能的表征 3组样品室温干燥后，用单反相机拍摄观察，随后喷金处理，使用扫描电镜拍照，观察3组样本表面形貌。使用拉曼光谱仪测定3组样本特征峰。使用接触角测量仪检测3组样本的亲水性。使用X射线能量色散谱仪检测样品涂层中各元素的含量和种类。
1.4.3 细胞培养用含体积分数10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM培养基培养RAW264.7细胞，每24 h换液1次。将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱内培养，待细胞融合度为80%左右时传代。取3-5代对数生长期细胞用于后续实验。
1.4.4 各组样品对RAW264.7细胞增殖的影响将3组样品于超净工作台下紫外线消毒1 h，消毒后分别置于24孔板中，将巨噬细胞按2×104/孔的密度接种于各组样品表面，接种后隔天换液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，4，7 d后，采用CCK-8法检测450 nm处的吸光度值，评价细胞活力。每组重复检测3次。为直接观察RAW264.7细胞在样品表面的附着，培养1，4，7 d后，应用DAPI对细胞核进行染色，使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄图像。
1.4.5 各组样品对RAW264.7细胞黏附的影响按1.4.4分组培养，每个样本设4个孔。培养1，4，7 d后，用PBS彻底冲洗样品2次，去除未附着的细胞，用2.5%戊二醛固定过夜，然后分别在体积分数30%，50%，70%，80%，90%和100%系列梯度乙醇溶液中脱水10 min，然后对各组样品进行临界点干燥，常规喷金，于扫描电镜下观察涂层表面细胞的形态、铺展程度及生长情况。
1.4.6 各组样品对RAW264.7细胞极化的影响按1.4.4分组培养，每个样本设4个孔。培养4 d后，弃净培养液，以PBS反复吹打后收集细胞悬液至10 mL离心管，1 200 r/min离心5 min，去尽上清。以PBS重悬细胞至流式管中，避光，分别加入5 μL FITC标记的CCR-7、PE标记的CD206抗体孵育细胞，并设立空白对照组，孵育0.5 h，以PBS洗涤，经滤网过滤至标记好的流式管后上机，检测细胞表面标志CD206、CCR-7的表达。
1.5 主要观察指标 3组样本的物理性能，以及对RAW264.7细胞增殖、黏附、极化的影响。
1.6 统计学分析使用GraphpadPrism 8.0软件进行统计分析，各实验样本量至少为3个，用x±s来表示定量数据。接触角组间比较行one-way ANOVE分析；CCK-8检测组间比较采用方差分析，多组间的两两比较使用Bonferroni法。P < 0.05表示差异有显著性意义。以上所有实验均重复3次。该文统计学方法已经新疆医科大学基础医学院统计学专家审核。

讨论

随着种植义齿的广泛应用，无菌性松动和感染成为骨科植入物的主要风险。种植术后良好的骨整合和抗菌性能依赖于稳定的微环境，而植入体作为异物不可避免地会引起机体的免疫反应，这些免疫反应主要来自于巨噬细胞的激活，从而降低了植入物的使用寿命。近期科研发现除了药物治疗，植入体材料的表面特性在抑制宿主炎症反应上表现出很大的潜力，尤其是调控巨噬细胞功能方面的效果明显[18]。另一方面，巨噬细胞的活动状况对于植入体早期稳定性有至关重要的影响，这也是此次实验的研究重点。现阶段，为了提升植入体的综合性能，各种针对植入体表面改良的方法层出不穷，其中氧化石墨烯因其优越性能受到了广泛关注。随着近几年骨免疫概念的兴起，科学家们逐步开始重视钛植入体表面改造后对免疫反应中的关键细胞尤其是巨噬细胞的影响[19]。大量的实验表明，氧化石墨烯进一步促进了骨髓间充质干细胞的增殖[4，20]。KANG等[21]采用半月板拖曳沉积技术在钛表面涂覆氧化石墨烯，体外实验结果表明该涂层能促进细胞增殖，显著促进基质矿化。
ZENG及其团队在钛表面制备了氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层，证实添加氧化石墨烯可以提高磷酸钙粒子的结晶度及钛与涂层的粘接力[22-23]。与羟基磷酸钙涂层相比，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层在体外细胞培养评测中显示出更高的生物兼容性[22]。有研究表明，氧化石墨烯可能通过调控基因转录、免疫应答、细胞生长和细胞凋亡等途径对细胞产生毒性作用[24]，并且细胞对氧化石墨烯不同剂量与不同暴露时间的反应不同[19]，因此有关氧化石墨烯对细胞的毒性作用存在争论。此次实验对早期暴露于氧化石墨烯和氧化石墨烯/羟基磷灰石的巨噬细胞急性反应做相关检测，研究其对RAW264.7细胞的增殖、黏附、极化表型的影响。
此次实验为了在钛表面形成均匀、致密的涂层，将氧化石墨烯/羟基磷灰石混合溶液用稀盐酸进行处理[25]，之后采用电化学沉积方法在基底钛上制备了均匀、致密的氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层[25-28]。通过扫描电镜观察到氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层较氧化石墨烯涂层更加均匀，这种现象的原因在于氧化石墨烯具有较高的比表面积，并且氧化石墨烯在电化学反应过程中还能提供更多的晶核，促进使羟基磷灰石结晶更为致密和均匀[29]。X射线能量色散谱分析图谱中，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层各元素均匀分布，Cl元素与制备复合涂层时加入盐酸调节pH值有关，钙元素为羟基磷灰石的元素组成，钙元素的均匀分布证明实验组中羟基磷灰石的分布均匀，没有Ti元素的占比说明氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层均匀致密地覆盖于钛表面。在拉曼光谱图中看到了氧化石墨烯的特征峰G峰和D峰，有力证明了复合涂层中氧化石墨烯的存在[22]。另外，涂层的亲水性在细胞反应中起着重要作用，多数研究报道良好的亲水表面可以促进骨相关细胞前期的黏附及增殖[30]，并且可以抑制巨噬细胞分泌相关炎性因子[31-33]。此次实验的亲水角结果证明，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层的表面润湿性最好，为超亲水面，并且可以抑制巨噬细胞分泌相关炎性因子[31-33]。有研究认为钛基底经修饰后表面亲水性和负电性升高[34-35]，而带负电的亲水性生物材料表面能够抑制单核-巨噬细胞的黏附，这与材料表面缺乏巨噬细胞黏附和伸展所需的整合素结合位点有关[36]。
此次实验选用P3代RAW264.7作为巨噬细胞的研究模型[37]，通过RAW264.7巨噬细胞与氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层共培养，研究其对RAW264.7细胞增殖、黏附、极化表型的影响。从CCK-8检测结果可见，钛基体修饰氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层后RAW264.7的细胞活性明显上升，这与材料亲水性的提高有很大关系[38]，培养4，7 d后，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层组细胞吸光度值明显高于羟基磷灰石涂层组与纯钛组，这可能由于氧化石墨烯涂层亲水性提高，协同促进了巨噬细胞的迁移和增殖。经流式细胞术检测结果显示，培养4 d后，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层组具有更高比例的M2型阳性表达，相较于纯钛组与氧化石墨烯涂层组，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层组细胞具有更多向抗炎方向转归的优势[39]。3组材料与RAW264.7巨噬细胞培养1，4，7 d后的细胞核染色显示，细胞数量与时间呈正相关，且每个时间点氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层组的细胞数目明显多于氧化石墨烯涂层组与纯钛组。这些结果表明氧化石墨烯的加入优化了材料的表面活性，进一步促进了RAW264.7细胞的增殖。扫描电镜观察发现，培养1，4，7 d后，巨噬细胞均可黏附于涂层表面，随时间的延长，可见氧化石墨烯影响巨噬细胞向M1形态的“梭形”方向变化[40]，氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层表面的RAW264.7细胞能够充分伸展，细胞生长状态佳、形态不规则，伪足的延伸较短粗，形态更偏向M2巨噬细胞极化形态[41]，但无涂层钛基体表面的细胞伸展不足，甚至没有伪足。3组材料表面都符合RAW264.7细胞的生长条件，CCK-8检测和DAPI染色显示氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层对RAW264.7细胞的增殖和黏附更有利。
钛植入物具备优秀的物理、化学及生物特性，但不能忽视其缺陷[34]。M1型巨噬细胞的高度渗透与植入体植入失败有密切关系，常常伴随着末端的假体松动和骨质的破坏。在骨损伤的愈合早期阶段，M1型巨噬细胞还能决定M2型巨噬细胞的细胞因子释放模式[42]，因此，种植体周围骨结合过程需要不同表型巨噬细胞的共同协同[4]。
宿主的炎症反应不仅是可以接受与不可避免的，也是细胞再生所必要的，生物材料研究的目标不应试图避免炎症反应，而应该尝试调节具有时序性的炎症反应以促进组织的修复。在不久的将来，科学家们将不断研究氧化石墨烯与钛对骨形成和对免疫系统的影响，以最稳定的结合方式打造出更优良的植入体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

氧化石墨烯/羟基磷灰石复合涂层对RAW264.7巨噬细胞免疫活性的影响

effect of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating on immune activity of RAW264.7 macrophages

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[1]	余双奇, 丁凡, 万松, 陈伟, 张学俊, 陈东, 李强, 林作丽. PLGA/赖氨酸接枝氧化石墨烯纳米粒子复合支架对MC3T3细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 707-712.
[2]	蔺孝慧, 杨梦源, 李春年. 仿生再矿化治疗在牙釉质早期脱矿的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 856-865.
[3]	程新奇, 邵龙辉, 沈华侨, 刘宏伟. 铜锶二元掺杂硅酸钙涂层改性钛合金的促成骨和抗菌效应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4639-4646.
[4]	叶超, 刘晓红. 生物材料异物反应的调控策略[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3513-3520.
[5]	都曼别克·阿曼台, 何惠宇, 韩祥祯. 羟基磷灰石-氧化石墨烯复合涂层促进大鼠骨缺损的修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 2030-2037.