内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响：生物信息学分析和实验验证

doi:10.12307/2024.737

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (1): 103-110.doi: 10.12307/2024.737

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内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响：生物信息学分析和实验验证

燕茹1，2，3，王凯茹2，3，张飞燕1，2，3，贾绍斌1，2，3，丛广志1，2，3

宁夏医科大学总医院，1心内科，2医学研究院，3心血管病研究所，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-09-16 接受日期:2023-11-17 出版日期:2025-01-08 发布日期:2024-05-18
通讯作者: 丛广志，博士，副主任医师，宁夏医科大学总医院心内科、医学研究院、心血管病研究所，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:燕茹，女，1980年生，硕士，2015年毕业于宁夏医科大学，内蒙古自治区五原县人，汉族，主治医师。
基金资助:
宁夏自然科学基金(2022AAC03479)，项目负责人：燕茹；宁夏自然科学基金(2023AAC02071)，丛广志；国家自然科学基金(82060057，82260086)，项目负责人：贾绍斌

Endothelial cell-specific bone morphogenetic protein 2 affects angiogenesis: bioinformatics analysis and experimental validation

Yan Ru1, 2, 3, Wang Kairu2, 3, Zhang Feiyan1, 2, 3, Jia Shaobin1, 2, 3, Cong Guangzhi1, 2, 3

1Department of Cardiology, 2Institute of Medicine, 3Institute of Cardiology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-09-16 Accepted:2023-11-17 Online:2025-01-08 Published:2024-05-18
Contact: Cong Guangzhi, MD, Associate chief physician, Department of Cardiology, and Institute of Medicine, and Institute of Cardiology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Yan Ru, Master, Attending physician, Department of Cardiology, and Institute of Medicine, and Institute of Cardiology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2022AAC03479 (to YR); Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2023AAC02071 (to CGZ); National Natural Science Foundation of China, No. 82060057, 82260086 (to JSB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物信息学：利用应用数学、信息学、显著性和计算机科学的方法对生物学实验数据进行分析。研究的基础工具是计算机，研究方法包括对生物学数据的收集和筛选、处理编辑、统计整理、可视化展示及计算模拟等。
血管新生：又称为血管生成或血管发生，是指在原先存在的血管的基础上生出新的血管的生理学过程。血管新生主要是通过既有血管的出芽与分裂完成的。

背景：血管新生是心血管疾病的主要干预靶点，骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用，但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。
目的：探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。
方法：①生物信息学分析：通过PanglaoDB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。②体内实验验证：建立小鼠后肢缺血模型，对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7 ，14 和21 d血流灌注情况，免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。③体外实验验证：体外培养人脐静脉内皮细胞，分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组，培养24 h，观察各组内皮细胞血管新生情况。
结果与结论：①内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群，在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高，血管新生通路明显激活。②缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P < 0.05)，缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P < 0.001)。③体外培养人脐静脉内皮细胞，缺氧干预后，内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加，血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高，Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P < 0.001)，并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P < 0.01)。④结果证实，内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用，靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

https://orcid.org/0009-0009-6519-4604 (燕茹)；https://orcid.org/0000-0002-0174-5026 (丛广志)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 内皮细胞, 骨形态发生蛋白2, 血管新生, 单细胞RNA测序, 批量RNA测序, 信号通路, 后肢缺血模型, 成管实验

Abstract:

BACKGROUND: Angiogenesis is the main treatment target of cardiovascular diseases. Bone morphogenetic protein 2 can modulate angiogenesis, but the regulatory effect of endothelial cell-specific bone morphogenetic protein 2 on angiogenesis is unclear.

OBJECTIVE: To investigate the effect of endothelial-specific bone morphogenetic protein 2 on angiogenesis.
METHODS: (1) Bioinformatics analysis: Cellular expression specificity and abundance of bone morphogenetic protein 2 were meta-analyzed by the PanglaoDB single-cell transcriptome database. The endothelial cell transcriptome sequencing dataset of the mouse hindlimb model and endocardial transcriptome dataset of mice overexpressing bone morphogenetic protein 2 were reanalyzed to evaluate the effect of endothelial cell bone morphogenetic protein 2 on the angiogenesis pathway. (2) Validation in vivo: After establishing the mouse hindlimb model, we compared the blood perfusion between the affected and sham limb at 7, 14, and 21 days. The expression of the colocation of bone morphogenetic protein 2 and CD31 was explored by immunofluorescence and immunohistochemical staining. (3) Validation in vitro: The cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were divided into a control group, a hypoxia group, and a bone morphogenetic protein 2 inhibitor Noggin intervention group. After being cultured for 24 hours, the angiogenesis of endothelial cells in each group was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Endothelial cells are an important cell subgroup expressing bone morphogenetic protein 2. Both in the mouse hindlimb ischemia model and endocardial cells overexpressing bone morphogenetic protein 2, bone morphogenetic protein 2 was significantly up-regulated, and the angiogenesis pathway was significantly activated. (2) In the mouse hindlimb model, bone morphogenetic protein 2-positive blood vessels around neoangiogenesis increased significantly at 7 days of ischemia (P < 0.05), and decreased significantly after 2 weeks of ischemia (P < 0.001). (3) In umbilical vein endothelial cells cultured in vitro, after hypoxic intervention, the migration and sprouting of endothelial cells increased significantly, and the expression of angiogenesis factors vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor was significantly increased. Noggin significantly reduced hypoxia-induced endothelial cell angiogenesis (P < 0.001) and down-regulated the expression of vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor (P < 0.01). (4) These findings verify that endothelial cell-specific bone morphogenetic protein 2 can regulate angiogenesis, and targeting endothelial cell bone morphogenetic protein 2 is a promising way to improve angiogenesis.

Key words: endothelial cell, bone morphogenetic protein 2, angiogenesis, single-cell RNA sequencing, bulk RNA sequencing, signaling pathway, hindlimb ischemia model, tube formation experiment

中图分类号:

燕茹, 王凯茹, 张飞燕, 贾绍斌, 丛广志. 内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响：生物信息学分析和实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(1): 103-110.

Yan Ru, Wang Kairu, Zhang Feiyan, Jia Shaobin, Cong Guangzhi. Endothelial cell-specific bone morphogenetic protein 2 affects angiogenesis: bioinformatics analysis and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(1): 103-110.

图/表（结果） 3

2.1 生物信息学分析结果
2.1.1 单细胞测序分析显示内皮细胞是骨形态发生蛋白 2 表达的主要细胞亚群 通过PanglaoDB数据库单细胞测序数据集进行荟萃分析显示，共纳入42个表达骨形态发生蛋白 2 的小鼠单细胞测序样本，分析标记出18个细胞簇，显示内皮细胞是骨形态发生蛋白 2 表达的主要细胞亚群。其中10个内皮细胞簇表达骨形态发生蛋白 2 。以样本SRS3348009为例，共测序出2 450个细胞，t-SNE降维分析标记出14个细胞簇，其中702个为内皮细胞，内皮细胞簇高表达骨形态发生蛋白 2 ，见图1。
2.1.2 后肢缺血模型内皮细胞骨形态发生蛋白 2 表达明显升高，激活血管新生通路 通过对后肢缺血小鼠模型分离出的内皮细胞Bulk RNA测序数据集GSE155012再分析，PCA显示模型组与对照组内皮细胞表现出完全不同的转录组特征，见图2A。火山图分析显示，与对照组比较，上调基因为441个，下调基因为280个，见图2B。模型组内皮细胞骨形态发生蛋白 2 表达明显升高，见图2C，调控血管新生的基因血管内皮生长因子A，血小板衍生生长因子A和血小板衍生生长因子B转录表达差异不明显(FDR-P > 0.05)，见图2D-F。将差异基因进行28个经典血管新生信号通路GO富集分析可见，共10个血管新生通路明显富集，见图2G-H，依次为血管新生(GO：0001525)，调控血管新生(GO：0045765)，负性调控血管新生(GO：0045765)，正性调控血管新生(GO：0045766)，血管新生出芽(GO：0002040)，血管新生出芽细胞迁移(GO：0090049)，负性血管新生出芽细胞迁移(GO：0090051)，负性调控血管新生出芽(GO：1903671)，创伤愈合血管新生(GO：0060055)和调控血管出芽(GO：1930670)。以上结果显示：在后肢缺血小鼠模型内皮细胞高表达骨形态发生蛋白 2 ，同时血管新生通路明显激活，骨形态发生蛋白 2 高表达可能与血管新生通路激活有关。

2.1.3 过表达骨形态发生蛋白2内皮细胞明显激活血管新生通路 通过对骨形态发生蛋白 2 过表达内皮细胞(小鼠心内膜组织)Bulk RNA测序数据集GSE104670进行再分析，PCA显示骨形态发生蛋白 2 过表达组与对照组细胞表现出完全不同的转录组特征，见图3A。火山图分析显示，与对照组比较，上调基因为766个，下调基因为289个，见图3B。模型组内皮细胞骨形态发生蛋白 2 表达明显升高(Log FC=1.75 FDR P=3.68×10-17)，见图3C；血管新生关键基因血管内皮生长因子A，PDGDA和PDBFB表达明显升高(FDR P < 0.05)，见图3D-F；将差异基因进行28个经典血管新生信号GO通路富集分析可见，其中9个血管新生通路明显富集(FDR P < 0.05)，血管新生通路富集指数为(Enrichment score)41.57，富集因子为0.88(FDRP 3.68×10-17)，见图3G-H。以上结果显示：在过表达骨形态发生蛋白 2 小鼠心内膜组织，且血管新生关键基因表达明显升高，血管新生通路明显激活。
2.2 动物体内实验验证结果——后肢缺血后骨形态发生蛋白 2 主要表达于新生血管内皮细胞周围 在小鼠后肢缺血模型，术后激光多普勒血流灌注成像显示，术后1 d缺血最重，未见血流信号，术后7 d和14 d缺血逐渐恢复，至术后21 d恢复到90%以上。通过免疫组织化学标记内皮细胞特异性因子CD31，发现术后腓肠动脉明显扩张，缺血坏死的肌肉组织周围可见明显的血管新生，7 d达高峰，7-14 d后逐步下降，同时骨形态发生蛋白 2 也在坏死肌肉组织周围高表达，与新生血管的位置一致，且在7 d表达量最高，14 d降低到正常水平，提示内皮细胞骨形态发生蛋白 2 可能在后肢缺血术后血管新生中发挥重要作用，见图4。

2.3 细胞学体外实验结果——骨形态发生蛋白 2 抑制剂降低人脐静脉内皮细胞低氧条件下血管新生能力 分别使用常氧、低氧和低氧+骨形态发生蛋白 2 抑制剂Noggin处理人脐静脉内皮细胞，干预24 h，低氧干预后细胞血管新生明显增强，表现为血管出芽的面积、小结、连接和网格明显增加(P < 0.05)；通过骨形态发生蛋白 2 抑制剂Noggin干预后细胞新生能力明显减弱，表现为血管出芽的面积、小结、连接和网格明显减少(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 生物信息学分析、随机对照动物实验、细胞学体外实验；Student’s t检验，单因素方差分析和Mann-Whitney U 检验。
1.2 时间及地点 实验于2021年1月至2023年4月在宁夏医科大学总医院心血管病研究所实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 单细胞数据集分析骨形态发生蛋白 2 表达细胞群 实验使用PanglaoDB公共基因表达数据库(https://panglaodb.se)分析骨形态发生蛋白 2 基因的细胞表达定位[13]，PanglaoDB公共基因表达数据库是用于存储和分享单细胞RNA测序(scRNA-seq)和单细胞ATAC-seq(scATAC-seq)数据。这些数据可以帮助研究人员了解不同细胞类型的基因表达和染色质状态，以及细胞在组织或器官中的分布。实验中共纳入1 368个在线单细胞测序数据集分析骨形态发生蛋白 2 的细胞类型表达定位和分布，并对骨形态发生蛋白 2 表达典型的数据集(肠系膜淋巴结组织，样本号：SRA628029_SRS3348009)进行t-SNE降维分析。
1.3.2 实验动物 健康7周龄雄性C57BL/J6小鼠18只购自宁夏医科大学实验动物中心，体质量22-23 g，动物使用许可证号：SYXK(宁)2015-0001。实验方案均经宁夏医科大学伦理委员会批准，批准时间：2022-02-27，批准号：KYLL-2022-0177。实验中的动物实验方法操作严格按照《动物研究：体内实验报告指南》执行。
1.3.3 细胞 人脐静脉内皮细胞购自美国Science Cell公司。
1.4 实验方法
1.4.1 生物信息学分析GEO数据集分析骨形态发生蛋白 2 与血管新生的调控关系 新生血管模型数据集GSE155012和过表达骨形态发生蛋白 2 小鼠内皮细胞(心内膜)数据集GSE104670转录组再分析[14-15]。GEO(Gene Expression Omnibus)数据库下载数据集GSE155012 数据集GSE104670。
GSE155012数据集：在新生血管模型(小鼠后肢缺血)，使用荧光激活细胞分选术 (FACS) 在后肢缺血手术后第 0天(n=2)和第 14天(n=3)从缺血肌肉中特异性分离出CD45-CD31+ 内皮细胞。共收集了约 10 万个内皮细胞用于 RNA 提取和深度测序。
GSE104670数据集：构建骨形态发生蛋白 2 过表达小鼠，提取对照组(n=4)和骨形态发生蛋白 2 过表达小鼠(n=4)胚胎9.5 d心内膜，每个样本获得200 ng RNA进行Bulk RNA测序。
采用 GEO2R在线分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析基因数据，进行主成分分析(Pricinpal Componant Analysis，PCA)，以调整后FDR P < 0.05和差异倍数(Fold of Change，FC) > 1.5为标准进行筛选得到差异基因，并生成火山图。使用基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析血管新生路富集。通过基因富集在线工具(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)计算血管新生相关信号的富集因子(Rich Fator)= 和富集分数(Enrichment Score)，以调整后FDR P < 0.05和差异倍数(Fold of Change，FC) > 1.5为标准判定激活的信号通路。
1.4.2 动物体内实验
实验动物造模：将18只雄性小鼠构建后肢缺血模型[16]。体积分数2%异氟烷维持麻醉下将小鼠置于体视显微镜下进行手术操作，呼吸麻醉机购自VAPOMATICTM公司，型号：CWE13-13000。术前使用脱毛膏为小鼠右后肢脱毛，体积分数75%乙醇消毒手术视野，沿股动脉走向做一个1 cm长的切口，分离皮下组织和脂肪，充分暴露肌肉和股动脉。在显微镜下仔细分离股动脉、伴行静脉与神经，分别在股动脉的近端和远端穿一根6-0的缝线，打双结阻断阻断股动脉血流，并将结扎线之间的一小段股动脉剪断去除，无菌棉球止血后，缝合皮肤，使用激光多普勒血流灌注成像仪，术后后肢完全缺血，无血流信号判断为模型成功。对侧后肢假手术只分离股动脉，挂线，不结扎作为假手术组。
激光多普勒血流灌注成像：在小鼠后肢缺血术前，术后即刻(0 d)，术后1，7，14和21 d，分别使用激光多普勒血流灌注成像仪( PeriCam PSI，帕瑞医学，瑞典)测量双侧后肢血流，根据血流的颜色强弱代表血流的强弱。测量并计算术侧后肢和健侧后肢的血流百分比(limb perfusion ratio)作为灌注恢复依据。
免疫组织化学染色检测各组骨形态发生蛋白 2 和CD31表达：将后肢缺血术后7，14，21 d的小鼠麻醉后处死，迅速分离腓肠肌，置于40 g/L多聚甲醛固定24 h后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后完成石蜡包及切片。染色步骤如下：切片脱蜡至水后经pH=6.0的枸橼酸钠缓冲液高压修复15 min后，降温至室温，PBS洗3次，每次5 min。再用体积分数3%H2O2浸泡切片15 min去除内源性过氧化物酶，PBS 洗3次，每次5 min。使用山羊血清工作液室温封闭30 min后，不用清洗，分别滴加预先混合配制好的一抗(兔抗骨形态发生蛋白2 多克隆抗体，PA5-88752，Invitrogen公司，1∶100；鼠抗CD31单克隆抗体，GB12063-100，Servicebio公司；1∶200)覆盖组织，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5 min洗去剩余一抗，滴加混合配制的荧光二抗(山羊抗兔TRITC抗体，中杉金桥公司，1∶100；山羊抗鼠FITC抗体，中杉金桥公司，1∶100)，室温孵育，1 h。PBS洗3次，每次5 min，滴加DAPI封固剂孵育封固。荧光显微镜下观察切片并采集图像，通过CD31阳性区域统计血管密度，骨形态发生蛋白 2 阳性表达分析其表达量及表达共定位部位，观察7 和14 d新生血管密度，并用Image软件分析统计数据。并用Image软件分析统计数据。
1.4.3 体外细胞学实验
细胞培养与干预：将人脐静脉内皮细胞培养于含生长因子、体积分数10%胎牛血清、1% penicillin-streptomycin 的内皮细胞培养基中。培养条件为37 ℃、体积分数5% CO2。人脐静脉内皮细胞低氧培养采用三气培养箱完成，培养条件为体积分数2%的 O2、5%CO2和93%的N2。骨形态发生蛋白 2 抑制剂重组人Noggin蛋白(100 ng/mL)干预24 h。
内皮细胞划痕实验：人脐静脉内皮细胞接种于12孔板，待细胞长至90%融合，无血清DMEM饥饿12 h，用200 μL枪头对细胞作划痕后，PBS清洗3次。分别予以常氧、缺氧和100 ng/mL的Noggin蛋白(100 ng/mL；加拿大STEMCELL公司)干预24 h，并于划痕后0和24 h于倒置显微镜下拍照，测量划痕面积，计算和对比常氧、缺氧和骨形态发生蛋白 2 抑制剂干预后创面恢复的百分比。
内皮细胞成管实验：将Matrigel基质胶(美国Corning公司)置于4 ℃冰箱过夜解冻，预冷96孔板和枪头，每孔50 μL Matrigel 基质胶涂覆孔板进行铺胶，并室温下在完全平整的水平面聚合1 h，确保Matrigel基质胶完全凝固。将处理后的细胞(1×105/孔)接种到每个孔中，并在 37 ℃下孵育，分别于6，12，24 h在倒置相差显微镜下观察细胞，并拍摄照片(×100)然后应用 Image-Pro Plus 图像分析软件计算成管情况，观察指标包括内皮细胞每个高倍镜视野下形成的节点数、交叉点数、网格个数和网格面积进行定量分析，每组设 6 个重复孔。
免疫印迹检测：人脐静脉内皮细胞接种于直径3.5 cm平皿中，长至90%融合后，无血清DMEM培养基饥饿12 h，分别予以常氧、缺氧和100 ng/mL的Noggin蛋白干预24 h后，提取细胞总蛋白。采用5%积层胶和10%的分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜，体积分数5%的脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入兔抗骨形态发生蛋白 2(PA5-88752，Invitrogen，1∶1 000)，血管内皮生长因子(ab53465，Abcam，1∶1 000)，血小板衍生生长因子(ab178409，Abcam，1∶1 000)和GADPH(GB15004-100，Servicebio，1∶2 000)4 ℃孵育过夜，TBST清洗10 min 3次，加入山羊抗兔二抗IgG-HRP(M21003，Abmart，1∶5 000)室温下孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min，ECL化学发光法显色后，凝胶成像仪曝光采集数据，以GAPDH为内参，用Image Lab软件对骨形态发生蛋白 2 、血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子灰度值进行定量分析。
1.5 主要观察指标 ①骨形态发生蛋白 2 的特异性表达细胞群；②血管新生小鼠模型骨形态发生蛋白 2 表达与血管新生的关系；③内皮细胞过表达骨形态发生蛋白 2 后血管新生通路激活状态；④体内实验验证血管新生模型骨形态发生蛋白 2 表达与新生血管的定位和关系；⑤体外实验验证内皮细胞骨形态发生蛋白 2 与血管新生的因果关系。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析和作图。各项数据来源于不少于3次的独立实验，并表示为x±s。首先分别使用Kolmogorov-Smirnov检验和F检验分别验证数据的正态性和方差齐性。下肢血流灌注率，骨形态发生蛋白 2 和CD31阳性血管数目，目标蛋白条带表达量呈正态分布，各组差异比较使用Student’s t检验，3组及以上的数据差异比较使用单因素方差分析，并进行Bonferroni事后检验。各组内皮细胞成管实验的节点数、交叉点数、网格个数和网格面积未能通过Kolmogorov-Smirnov检验和F检验，使用Mann-Whitney U 检验进行差异分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

动脉粥样硬化继发的血管闭塞是多种心血管系统疾病的主要原因[4]。在缺血过程中，器官组织会响应缺氧信号而自发形成侧支循环[17-18]。缺血后侧支循环的形成即血管新生是决定多种心血管疾病预后的关键。既往研究多通过肿瘤细胞或外源性骨形态发生蛋白 2 观察其对内皮细胞血管新生功能的影响[19-20]，但是内皮细胞特异性骨形态发生蛋白 2 在血管新生中的作用和潜在机制尚不清楚。骨形态发生蛋白家族已被证明可通过调控瓣膜形成和维持血管稳态发挥心血管生理功能[21]。骨形态发生蛋白 2 通过内皮细胞迁移和增殖参与血管生成[22-23]，

小鼠缺乏骨形态发生蛋白 2 会导致心脏发育受损、早期胚胎死亡。为探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白 2 调控血管新生作用，实验通过多个转录组学数据分析显示，内皮细胞是表达骨形态发生蛋白 2 的重要细胞亚群，在小鼠后肢缺血模型中，骨形态发生蛋白 2 表达明显升高，血管新生通路明显激活；在过表达骨形态发生蛋白 2 小鼠，血管新生通路明显激活；实验验证发现在小鼠后肢缺血模型中，新生血管周围骨形态发生蛋白 2 表达明显升高，血管新生过程完成后，骨形态发生蛋白 2 表达明显减少。体外培养人脐静脉内皮细胞，缺氧干预后内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加，血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子表达增加，使用骨形态发生蛋白 2 抑制剂Noggin明显抑制了缺氧诱导的内皮细胞迁移和血管新生，血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子表达下降。这些结果表明，内皮细胞骨形态发生蛋白 2 是调控血管新生的关键因子，为靶向内皮细胞骨形态发生蛋白 2 治疗血管新生提供了新的依据。
与既往研究不同，实验首先通过生物信息分析和体内实验验证明确了内皮细胞特异性骨形态发生蛋白 2 对血管新生的调控作用。AL-SHABRAWEY等[24]通过外源性骨形态发生蛋白 2 干预高糖条件下视网膜内皮细胞，发现骨形态发生蛋白 2 能够激活非经典的炎症信号通路，上调血管内皮生长因子。ZUO等[25]通过肝癌细胞过表达骨形态发生蛋白 2 共培养人脐静脉内皮细胞，发现骨形态发生蛋白 2 能够促进内皮细胞发生迁移、增殖和血管新生。KWON等[26]最新研究显示，糖尿病小鼠注射外源性骨形态发生蛋白 2 能够促进血管新生，改善糖尿病继发的勃起功能障碍。但是这些研究中，重点观察了外源性骨形态发生蛋白 2 对血管新生的影响，未观察内皮细胞特异性骨形态发生蛋白 2 对血管新生的影响。结合此次实验结果，可以推测不仅外源性骨形态发生蛋白 2 能够激活血管新生通路，启动血管新生，而且内皮细胞源骨形态发生蛋白 2 在调控血管新生中发挥关键作用。
血管新生是一种复杂的生物学过程，它涉及多个细胞类型和分子信号，对于组织修复、发育和肿瘤生长等生理和病理情况至关重要，主要过程包括血管内皮细胞的激活和迁移、内皮细胞的增殖和分化、管腔形成和分支、基质和支持细胞的招募和血管成熟和稳定等过程[2，27-28]。实验的生物信息学分析结果显示，内皮细胞来源的骨形态发生蛋白 2 与血管新生存在明显的调控关系，内皮细胞过表达骨形态发生蛋白 2 除了激活血管新生信号通路，也能够激活内皮细胞出芽、细胞迁移和创伤修复等信号通路。后肢缺血模型是在体研究血管新生的主要模型[29]，为了进一步验证实验的生物信息学分析结果，实验观察到在后肢缺血模型术后1周血管新生最为明显，骨形态发生蛋白 2 阳性广泛表达于新生血管周围，而当血管新生过程接近完成时，骨形态发生蛋白 2 阳性表达血管明显减少，这提示内皮细胞源骨形态发生蛋白 2 是血管新生的关键调控因子。通过给予骨形态发生蛋白 2 特异性抑制剂，实验观察到骨形态发生蛋白 2 对血管新生成管和内皮细胞迁移分化的调控作用，这说明内皮细胞骨形态发生蛋白 2 可能通过调控内皮细胞迁移、分化及血管化参与血管新生，而且主要表现在血管新生的早期阶段。BAI等[30]研究发现外源性骨形态发生蛋白 2 能够促进人脐静脉内皮细胞小管形成，MI等[31]的研究也发现内皮细胞骨形态发生蛋白 2能够调控人脐静脉内皮细胞的细胞迁移和成管能力。这些研究与此次实验发现一致，但是这些研究没有在体内观察骨形态发生蛋白 2 表达与血管新生的动态变化，实验在体血管新生过程中骨形态发生蛋白 2 的表达位置和变化规律，骨形态发生蛋白 2 可能在血管新生的早期阶段发挥重要作用，而在血管新生的成熟阶段的作用尚不明确。
血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子是目前公认的调控血管新生的生长因子。血管内皮生长因子主要促进内皮细胞的增殖和迁移，从而形成新的血管结构，而血小板衍生生长因子则有助于血管壁的稳定和成熟，通过招募和刺激平滑肌细胞，加强血管壁的支撑。这两种生长因子协同作用，相互配合，是血管新生过程中不可或缺的重要调节因子[32-33]。实验的生物信息学分析显示，在过表达骨形态发生蛋白 2 的心内膜，血管内皮生长因子A和血小板衍生生长因子A的转录水平明显升高，体内实验和细胞实验也进一步验证了骨形态发生蛋白 2 对血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子表达的调控作用。研究显示，血管内皮生长因子能够协同骨形态发生蛋白 2 促进骨髓干细胞归巢和分化，促进骨再生[34-35]，血小板衍生生长因子能够抑制骨形态发生蛋白 2 介导的成骨过程[36]，但是在血管新生过程中，骨形态发生蛋白 2 是否能够调控血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子促进血管新生还鲜见报道。该实验结果显示，内皮细胞骨形态发生蛋白 2 可能通过上调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子表达促进血管新生。骨形态发生蛋白 2已用于许多临床前和临床研究，探索其在多种动物模型缺陷和人类疾病中的软骨形成或骨诱导潜力[37]。同时也发现骨形态发生蛋白 2 可能通过血管新生作用促进肿瘤的发展，也是抗肿瘤的重要靶点[5]。实验通过生物信息学分析和血管新生模型验证，发现内皮细胞特异性骨形态发生蛋白 2 在血管新生中发挥重要作用，强调了内皮细胞中骨形态发生蛋白 2 的关键作用，以及其在血管新生过程中的潜在机制。通过调控内皮细胞骨形态发生蛋白 2 的血管新生作用，可能为治疗心血管疾病带来新的获益。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响：生物信息学分析和实验验证

Endothelial cell-specific bone morphogenetic protein 2 affects angiogenesis: bioinformatics analysis and experimental validation

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