近红外荧光成像技术实现术中神经成像：应用现状与未来发展

doi:10.12307/2024.492

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

近红外光：近红外光是介于可见光和中红外光之间的电磁波，波长范围为650-2 500 nm，是研究者们最早发现的非可见光。
荧光成像技术：利用具有特异性的荧光分子探针标记特定的分子、细胞或组织，从分子、细胞或组织水平上对正常或异常的生物过程进行空间和时间上的视觉描述。

背景：目前主要的神经成像方式，如磁共振成像、计算机断层扫描和高分辨率超声，均无法为医生提供术中实时定位图像。随着近红外荧光成像技术应用于临床，手术目标区域的直接可视化成为现实，这为神经的术中实时识别提供了新的方案。

目的：归纳并总结近红外荧光成像技术实现术中神经成像的研究进展。
方法：以“近红外荧光成像，光学成像，神经成像”为中文检索词，以“near-infrared fluorescence imaging，optical imaging，nerve imaging”为英文检索词，分别检索万方数据、中国知网及PubMed数据库。检索时间范围重点为2010年1月至2023年7月，同时纳入少数经典远期文献，通过阅读文题和摘要进行初步筛选，排除中英文文献重复性研究、低质量期刊及内容不相关的文献，最后纳入69篇文献进行综述。

结果与结论：①吲哚菁绿引导下的近红外荧光成像在临床上已被用于术中血管、输尿管和胆管等管状器官以及各种肿瘤的识别与定位，是目前在精准外科手术中应用比较成熟的术中成像方法。②在近红外荧光成像技术实现术中神经荧光成像的研究中，吲哚菁绿是目前唯一的一种应用于临床研究的近红外荧光染料。③理想神经显影剂应该具有以下特点：在围术期容易给药，logD在pH=7.4时数值为0.5-3.0，分子质量< 500 Da，有近红外窗口中的激发和发射波长，能够在神经组织中长时间保留，具有较高的SBR值以及较高的安全性。④未来近红外神经荧光显影剂的开发中，研究者们应该将重心放在合成吲哚菁绿与神经特异性靶点的复合物中。⑤在应用前景方面，该技术不仅能使术中神经荧光成像将成为现实，而且在原位监测神经再生以及诊断神经系统疾病方面也将取得巨大突破。

https://orcid.org/0009-0003-3582-2899(高文平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 近红外荧光成像技术, 光学成像, 神经成像, 荧光引导外科手术, 显影剂, 精准外科, 吲哚菁绿, 靶向外科

Abstract: BACKGROUND: Existing neuroimaging techniques, including magnetic resonance imaging, computed tomography, and high-resolution ultrasound, lack the capability to provide real-time intraoperative positioning images to surgeons. However, the clinical implementation of near-infrared fluorescence imaging technology has made it possible to directly visualize surgical target areas, offering a novel solution for real-time nerve identification during surgery.
OBJECTIVE: To provide a summary and overview of the research progress in near-infrared fluorescence imaging technology for intraoperative neuroimaging.
METHODS: The first author used the computer to search for the documents published from January 2010 to July 2023 in WanFang, CNKI, and PubMed with the key words of “near-infrared fluorescence imaging, optical imaging, nerve imaging” in Chinese and English. A few classic old documents were also included. Initial screening was performed by reading the titles and abstracts; duplicate, low-quality, and irrelevant content documents were excluded. A total of 69 articles were finally included for review.
RESULTS AND CONCLUSION: Near-infrared fluorescence imaging guided by indocyanine green has been clinically used to identify and locate tubular organs such as blood vessels, ureters, and bile ducts, as well as various tumors during surgery. This technique is currently considered a well-established imaging method in precision surgery. In the field of intraoperative neurofluorescence imaging, indocyanine green is currently the only near-infrared fluorescent dye used in clinical research. The ideal neuroimaging agent should possess certain characteristics, including easy administration in the perioperative period, logD between 0.5 and 3 at pH=7.4, molecular mass below 500 Da, excitation and emission wavelengths within the near-infrared window, long-term retention in nerve tissue, high signal-to-background ratio, and high safety. In the future, the development of near-infrared neurofluorescence imaging agents should focus on synthesizing complexes of indocyanine green and neural-specific targets. This technology not only enables intraoperative neurofluorescence imaging, but also holds promising prospects for in-situ monitoring of nerve regeneration and diagnosis of neurological diseases.

Key words: near-infrared fluorescence imaging technology, optical imaging, neuroimaging, fluorescence-guided surgery, contrast agent, precision surgery, indocyanine green, targeted surgery

中图分类号:

高文平, 张志华, 韩飞, 郝卫国. 近红外荧光成像技术实现术中神经成像：应用现状与未来发展[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5225-5230.

Gao Wenping, Zhang Zhihua, Han Fei, Hao Weiguo. Near-infrared fluorescence imaging for intraoperative neuroimaging: current applications and future development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(32): 5225-5230.

图/表（结果） 4

2.1 近红外荧光成像技术近年来，荧光引导外科手术作为一种非侵入性技术不断发展，已经成为外科手术和精准医学研究的热门领域。这种技术的基本原理是通过静脉或局部注射将可区分目标组织和其他组织的显影剂注入患者体内，然后利用外部设备激发显影剂产生荧光信号。外部传感器用于接收和处理不同组织的荧光信号，并形成实时图像传输到在屏幕上。这种图像能够准确显示细胞内某一基因或生物大分子特性的表达情况，并记录展示这些动态过程。研究者们通过信背比(signal to background ratio，SBR)进行记录和分析，技术成功的标准是SBR值大于1，且SBR值越大，显示效果越明显。
近红外光是波段位于650-2 500 nm内的电磁波，目前在生物分析研究和生物医学诊断方面得到广泛的应用[16]。人的肉眼不能直接看到近红外光，需要使用特殊的光学成像系统，也就是近红外荧光成像系统才能观察到。一般研究者们会把近红外荧光染料当做显影剂来使用。当手术视野中照射到某种波长的近红外光时，手术室视野中就会发出另一种波长的近红外光。荧光染料的位置可以通过捕捉这种发射出来的光来精确判定。利用手术视野中的近红外光，当研究者们在活体细胞、组织或器官上标记出近红外荧光染料时，就可以对目标组织或结构进行精确定位。
目前的光学成像技术主要在可见光区域(400-650 nm)和近红外一区(Near-infraredⅠ， NIR-Ⅰ，650-900 nm)光谱区域进行[17]。然而，当在可见光区域成像时，它们会受严重的组织散射、吸收和自发荧光，导致其空间分辨率、成像灵敏度和对比度下降[18]。NIR-Ⅰ的波长不易被生物组织吸收和散射，因此在光学成像的应用中能够更深入有效地穿透皮肤、血液等生物组织[19-20]。同时，生物组织在此波段的自体荧光较小，SBR相对较高，是目前最适合用于动物的光穿透和深部组织成像的波段[21-22]。在2002年，美国Beth Israel Deaconess医学中心首次引进了一款具有独特特点的近红外荧光成像系统，该系统能够实时呈现彩色和近红外荧光图像，并且同时满足了获取近红外荧光信号和在手术视野中观察解剖结构这两个关键要求[23]，这一具有突破性意义的技术提供了前所未有的便捷和精确性。基于上述优点，近红外荧光成像可以实现术中实时导航，显示未能直接暴露于表面的解剖结构，并在血管和输尿管等管腔器官以及肿瘤精准定位及识别得到了广泛的临床应用[24-25]。随着成像设备的更新升级，近红外荧光成像已经从独立波段成像发展到了双峰成像、多模态成像、3D荧光成像以及伪彩融合成像等多种成像模式[26-30]，大幅度提高了医师在术中的视觉效果。
2.2 近红外荧光显影剂在近红外波段内，生物体大多数组织很少产生近红外荧光，因此在近红外荧光成像的实际临床应用中，选择合适的显影剂至关重要。在过去的几十年里，研究人员在荧光引导外科手术中使用了荧光素、亚甲蓝以及5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)等多种荧光染料进行探究。由于荧光素的发射波长与亚甲蓝类似于人体组织的自发性荧光，导致其作为近红外荧光显影剂的使用效果受到显影剂信号难以与人体自发性荧光区分的限制[31-32]。目前，5-ALA主要用于神经胶质瘤的手术中可视化治疗[33]。然而，这种药物在中国尚未获得临床批准。目前三碳花青系近红外荧光染料被证明是近红区理想的显影剂[34]。其中，吲哚菁绿是目前临床上应用最广泛的近红外荧光显影剂，也是唯一经美国食品药品管理局(food and drug administration，FDA)和欧洲药品管理局(european medicines agency，EMA)批准的近红外造影剂[35]。吲哚菁绿的吸收峰和发射峰分别为805 nm和835 nm[36]。经静脉注射后，吲哚菁绿可以和血清蛋白迅速结合，经肝脏排出体外而在其他组织中不会被代谢掉，在血浆中半衰期为三四分钟[37]。在其引导下的近红外荧光成像已被用于多种疾病的检测和治疗，是目前在精准外科手术中应用比较成熟的术中成像方法，在术中肿瘤标记、血管造影、输尿管造影及前哨淋巴结识别以及胆管造影等方面得到了广泛的临床应用[38]。
2.3 近红外荧光成像在神经成像中的应用术中神经荧光显影剂的应用可以实现神经荧光成像，特别是在由于外在暴力因素导致正常解剖位置发生位移或者破坏的情境下，能够明显降低神经识别的难度，提升手术的精准度。在近红外荧光的临床应用中，血管、输尿管和胆管等管状结构可以通过灌注荧光染料实现实时动态显像。相比之下，神经纤维的条束状结构使得普通染料很难着色，因此实现活体荧光成像难度很大。这也催生了科学家们的研究兴趣，一些神经荧光染料也在被探究。研究人员术前将荧光染料通过静脉注射或局部注射的方式注射到患者体内，使之与神经组织结合。术中，对目标神经区域照射近红外光，而后收集荧光染料所发出的荧光信号并传输到显示屏上。最后通过计算机软件根据需求，对收集到的荧光信号进行实时处理实现术中神经荧光成像，见图3。

2.3.1 吲哚菁绿引导的神经成像神经血管束是人体内的神经末梢与毛细血管缠绕在一起形成的微小解剖结构。将吲哚菁绿通过静脉注射到血液中，随着血液流动以及吲哚菁绿的渗透性和滞留增强，吲哚菁绿可以准确识别神经血管束来实现对神经的定位[39-40]。在2008年，GRAGNANIELLO等[41]使用新鲜的人体头部标本通过动脉注射吲哚菁绿在近红外荧光成像引导下实现了对面神经和半规管识别和保存。基于皮质骨和面神经的差异，在2014年，CHEN等[42]在乳突切除术中，骨化面神经管后，将标准剂量的吲哚菁绿在5 mL无菌水中稀释静脉注射到面神经管伴行血管实现了对面神经的可视化。这项技术的应用，帮助医师准确地找到面神经神经或者解剖标志，能够显著降低面神经损伤并发症的发生。然而，由于患者数量相对较少且部分为尸体验证，该技术并未形成一个明确的使用标准；此外，镜下荧光对面神经的可见性以及神经外科医师术中确定面神经位置具有主观性和不确定性；同时，该研究缺少对荧光图像的定量分析。在2016年，WENG等[43] 在应用胸腔镜吲哚菁绿显像检测肺转移性病变和纵隔占位病变时，发现胸交感神经节(包括星状神经节)可以在近红外模式下清晰显示。这是术中胸交感神经节荧光显像的首例报道，且患者治疗过程中未发现发生不良反应。随后，2018年该团队通过动物实验和临床实验对吲哚菁绿应用的最佳注射时间以及最佳剂量进行了探究[44]。在2019年，JIN等[45]在结肠癌根治术中，通过使用吲哚菁绿成功观察到内脏神经丛、肠系膜下动脉丛和骶神经丛。
在2020年，KANNO等[46]在治疗1例深度子宫内膜异位症的手术中，为了更好地显现病灶与盆腔自主神经的解剖关系，静脉注射吲哚菁绿进行近红外荧光成像，结果腹下神经和腹下神经丛在吲哚菁绿引导下明显突出，且术后并未发生盆腔自主神经损伤的相关不良反应，这是世界首例使用吲哚菁绿做神经保留的妇科手术。HE等[15]在2020年2月至2021年6月，开展了宫颈癌根治性子宫切除术中应用近红外荧光成像和吲哚菁绿识别盆腔神经的临床研究，评价了该项技术的可行性和安全性。这为术中识别盆腔神经、减少神经损伤及改善患者预后的提供了新思路，但由于该研究为单臂研究，没有设计随机对照试验来比较近红外荧光引导手术和传统手术的神经识别率和损伤率，因此该研究也存在一定的局限性。吲哚菁绿与不同组织的亲和力不同，与神经的亲和力较差，因此，实现神经的可视化需要增大吲哚菁绿的剂量。在实际临床应用吲哚菁绿存在量子产率低、光学稳定性差、不具有靶向性的缺点，但相比其他染料具有更好的组织穿透性，因此有人提出最理想的显影剂将是神经靶向物质与吲哚菁绿的混合物[47]。同时，在目前研究中，科研人员的兴趣更侧重于实际的临床应用，对于其吲哚菁绿与神经组织结合的具体机制还缺少研究佐证，见表1。

2.3.2 近红外靶向荧光团引导的神经成像目前，具有神经特异性衍生物的恶嗪支架在发射光谱尾段恰好在近红外波段内，呈现出一种潜在的有前途和灵活的结构。恶嗪定向合成工程有望成为鉴定小分子神经造影剂候选物，实现在复杂的外科环境中有效地定位和识别神经[48-50]。PARK等[48]通过对具有近红外光谱的恶嗪类荧光团进行合成修饰，以恶嗪1和恶嗪4为支架，成功地建立了具有高度神经特异性荧光基团文库。WANG等[49]并通过体内神经荧光测试筛选了4种恶嗪衍生物(LGW01-08，LGW05-75，LGW04-31和LGW03-76)。与文库中其他基团相比，其中恶嗪4在神经特异性以及显影时间方面显示出较好的实验效果，成功地识别并实时突出了猪的喉返神经；而恶嗪1虽然与恶嗪4具有高度的结构相似性，但没有表现出神经特异性。部分研究成果见表2。

在2017年，有研究利用恶嗪4和尼罗红(脂质特异性恶嗪荧光团)不同的光谱特性，以局部给药的方式通过双色成像策略实现了神经和脂肪组织分离荧光[51]。在2019年，有研究继续通过对比恶嗪4与罗丹红在神经组织的荧光强度，探究了分配系数和总体电荷对于神经组织靶向和快速脱靶组织清除的影响[52]。尽管恶嗪在动物实验中显示出良好的效果，但是其荧光光谱并完全处于的近红外窗口内，因此其临床应用前景可能会受到限制。
2.3.3 近红外荧光团复合物引导的神经成像大量神经标记结合位点的发现，使得手术时目标区域神经的体内荧光成像动态识别得到了极大的发展，这明显降低了手术中损伤神经的风险。
近年来，人们开始尝试将针对神经信号转到过程开发一些小分子物质和多肽物质人工复合物。例如，将作用于Na+门控通道的Hsla与Cy7.5染料合成的Hs1a-FL以及将作用于胆碱类物质的丁酰胆碱酯酶(BChE)使用近红外荧光染料标记后合成的BChE-IRDye均开始在动物实验中使用[53-54]。这些特殊分子能够作用于神经系统产生电活动的过程，从而与神经系统特异性结合。这给研究者们在未来神经特异性显影剂的开发提供了新的思路，研究者们可以将目标转向神经的电生理活动中。此外，研究人员将生物素化葡聚糖胺(BDA)与神经组织上的红色荧光碳化聚合物点(CPDS)相耦合，开发出BDA-CPDS，作为新一代的纳米神经荧光显影剂，其在体内体外均表现出良好的生物相容性和低毒性[55]。
蛋白聚糖是一类具有一个或多个附着聚糖链的蛋白质，是神经纤维结缔组织膜的主要蛋白[56]。研究证实，凝集素能够与周围神经组织上的蛋白聚糖亲和[56]。在2014年，KLEINJAN等[57]使用Cy5 结合小麦胚芽凝集素、花生凝集素、红芸豆凝集素及番茄凝集素4种凝集素通过局部注射的方法实现了小鼠坐骨神经神经荧光成像。由于凝集素只在神经外膜显示染色，其诱发全身毒性可能性较小，具有较大的临床应用潜力。由于凝集素只在神经外膜显示染色，其诱发全身毒性可能性较小，具有较大的临床应用潜力。当然，这些药物也有一些局限性。凝集素制剂只能采取局部注射的方式使用，因此很难实现深部神经组织的可视化。此外，由于这些凝集素剂能够与周围结缔组织产生相互作用，因此对成像效果会产生干扰，相关研究汇总见表3。

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引言

由于外科手术导致中枢或周围神经的损伤可能严重影响患者的感觉、运动等躯体功能，从而对患者的生活造成诸多影响[1-3]。所以，以往有可能会损伤到神经系统的手术，术前都会完善MRI和CT、高分辨率超声等的检查，以便制定完备的手术方案[4]。术中MRI和CT为手术医生提供图像引导，然而，系统的操作符合正常的手术流程，延长了手术或麻醉时间；同时，其昂贵的价格和巨大的占地空间的弊端也影响术中的使用[5-6]。由于周围神经和周围组织之间具有相似的信号强度，使得在实际应用中，MRI只能识别大脑和脊髓而无法识别周围神经组织[7]。高分辨率超声是周围神经检查的方法之一，但由于其建立在一个由低回声带和高回声线组成的网络上，所以仅对浅表神经有效[8-9]。目前，神经功能检测主要通过体格检查以及肌电图等方式来完成。其中，肌电图通过刺激目标神经使得肌肉出现紧张性活动从而产生动作电位，是周围神经功能监测最常用的技术[10]，但是，它只能识别运动神经，不能识别无运动功能的感觉神经纤维[11]。在外科手术中，外科医生主要通过观察组织的颜色、质地和形态来区分目标组织，这些特征可以提供关键的信息，帮助医生确定正确的治疗方法和操作技巧。不同患者的神经解剖结构差异较大，而神经又常隐藏在组织保护层之下，以上技术均不能实现对神经组织的精确定位并制定治疗计划所需的解剖细节，且部分技术存在潜在的放射学风险，因此，目前术中相关神经辨别高度依赖于手术医生的对于解剖位置的掌握、娴熟的手术技术和丰富的临床经验。
随着荧光引导外科手术的发展，使用荧光物质对目标区域进行标记可以实现在术中进行实时色彩对比[12]，这种技术主要通过用不同波长的光源照射已经被荧光染料标记的目标组织来提高手术的精准度[13]。该技术可以达到皮级的灵敏度和微米级的空间分辨率，每秒可以获得数百张图像，荧光图像更加直观[14]。荧光素、亚甲蓝及5-氨基乙酰丙酸等几种荧光显影剂的临床批准以及应用使得该技术取得巨大的突破[15]。其中，近红外荧光成像由于波长不易被生物组织吸收和散射，因此在光学成像的应用中能够更深入有效地穿透皮肤及血液等生物组织，这使得其在荧光引导外科手术中脱颖而出，并逐步形成了近红外荧光成像引导外科手术的新技术、新设备和新的临床学科。近年来，这一领域的研究数量呈现爆炸式增长，但是大多数都集中在术中血管、输尿管和胆管等管状器官以及各种肿瘤的识别与定位中。由于神经特殊的条束状解剖结构与上述器官存在显著差异，因此普通荧光显影剂很难对神经实现荧光显影。这也促使大量学者对其开展了相关研究，一些荧光显影剂的初步结果很有前景，但对于其药物代谢、药物用量、预注射时间及药物毒性等方面的研究不够充分，真正应用于临床的显影剂数量非常有限，相关临床报道数量也十分罕见。
文章系统总结了近20年来不同神经荧光染料在近红外荧光成像技术引导下实现神经荧光成像的临床和临床前研究，并对其发展前景进行了讨论和展望，希望可以帮助相关领域的研究人员。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

讨论

3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题在过去的几个世纪里，各种技术和辅助诊疗手段走进了外科医生的视野。CT、MRI、超声和核医学成像已成为术前诊断的常用工具。这些无创的影像学技术可以在很大程度上帮助外科医生制定手术计划和改善治疗。然而，关于手术指导和决策的一些问题仍然没有解决。目前广泛应用的超声、CT和MRI对细微病变的发现灵敏度和准确性有限，它们不适合进行术中实时反馈，难以提供术中实时指导。在核医学成像中，成像效果与放射性同位素的核特性(衰变类型、光子能量及半衰期)密切相关，且外来放射性元素可能会引起人体不良反应。
近红外荧光成像技术不仅可以用于临床诊断，而且可以用于分析生物现象，在监测分子含量、变化趋势，观察目标组织的分布、形态变化，实现不同生物组织的可视化方面，近红外荧光成像技术发挥了不可替代的作用，这对揭示疾病的发生、发展及治疗开辟了新的思路。区别于核医学分子成像，它可以仅在目标组织中释放光学信号。然而，由于生物组织有很强的光学散射和吸收的特性，荧光系统的空间分辨率发生了严重退化，这导致生物组织成像深度实现最大化产生了巨大的障碍。神经特异性显影剂有相对较小的分子质量以保证能够通过血神经屏障。
3.2 作者综述区别于他人他篇的特点该综述重点着眼于近红外荧光成像技术在神经荧光成像方面的应用，阐述了该方法在临床与基础研究的现状。就每个研究而言，其广度和深度各有所异，且相互独立。目前仅有吲哚菁绿一种近红外荧光染料用于神经荧光成像的临床研究，其他荧光染料的相关研究还停留在动物实验阶段。研究者们将相关文献逐一列举，对其研究结果展开讨论，希望能有助于研究人员在该领域的继续探索。
3.3 综述的局限性根据已有的临床报道，由于应用不同的显影剂、相对较少的患者数量、不同的临床诊断以及术前不同的干预治疗，研究者们还没有形成标准共识来对已有的神经显影剂的效果做出准确、全面的评价。由于不同神经特异性显影剂的理化性质有所区别，针对注射用量、注射时间、细胞毒性、敏感度、时间和空间分辨率、穿透深度以及药物代谢动力学等方面的研究还亟待完善。此外，在术中实时确定目标神经的位置依赖于手术医生地判断，具有主观性。
3.4 综述的重要意义文章使用近红外荧光成像实现术中神经的可视化有几个优点。首先，术中实时成像和高SBR图像有助于术中准确地识别神经；其次，近红外光的穿透能力远强于可见光；此外，该方法是非侵入性的，不会对患者造成出手术之外的其他损伤，也不影响正常的外科手术程序。基于神经特异性显影剂的不断开发，未来持续的研究和转化工作将使这一新兴技术逐步应用于临床，届时，不仅术中神经荧光成像将成为现实，原位监测神经再生以及诊断神经系统疾病也将取得巨大突破。
3.5 课题专家组对未来的建议与NIR-Ⅰ区光学成像相比，应用近红外二区(Near-infraredⅡ，NIR-Ⅱ，1 000-1 700 nm)光学成像可以实现更低的组织自身荧光、光子散射和吸收，具有更高的SBR和更深的生物组织穿透力[58-60]，因此它也被视为下一代用于辅助生物医学的诊断的光学成像技术。因此，研究人员一直致力于寻找理想的神经显影剂至少具备以下两个特点:首先是荧光材料需要尽可能克服不透明和厚组织散射带来的自发荧光，最大程度获得清晰地图像[61-62]；其次，荧光材料必须在体内具有良好的生物稳定性，优先聚集在、神经组织，并能够产生针对神经组织的特异性荧光图像[62]。目前，NIR-Ⅰ成像正迅速走向广泛临床应用的道路，NIR-Ⅱ成像已经达到了一个变革阶段，随着荧光染料的开发和成像系统的更新换代，未来NIR-Ⅱ成像的应用将比NIR-Ⅰ更为广泛。
虽然荧光图像引导手术的正在迅速发展，但是在神经组织的识别方面还应用甚少。由于神经组织的特殊性，实现其可视化，选择合适的显影剂显得尤其重要。因此，在近红外荧光成像技术中，理想神经显影剂应该具有以下特点：①围术期很容易给药，②logD在pH=7.4时介于0.5-3.0，且分子质量< 500 Da以确保最大限度地穿透血神经屏障；③近红外窗口中的激发和发射波长；④能够在神经组织中长时间保留；⑤具有较高的SBR值；⑥具有较高的安全性[63-67]。从近红外显影剂的分子构成来看，其必须有足够多的双键才能在近红区达到激发态，这势必会增加其分子质量[68]。由于显影剂可能随周围环境的变化而影响成像效果，基于荧光基团的分子构型，神经特异性荧光的结构-活性关系这一概念也被提出用于指导其他荧光基团文库的合成[69]。
不同的注射方式对最终的效果也会造成影响。全身给药会使神经的SBR值降低，而同等剂量下局部给药的方式使得目标神经荧光信号更加明显。此外，与全身给药相比，达到相同的荧光强度，局部给药的方式在显影剂剂量和预注射时间方面都显著降低。然而，局部给药不能通过全身血液循环实现对显影剂的吸收和清除，可能会出现显著的非特异性组织蓄积或由于显影剂的细胞毒性而对局部组织造成损伤。因此，为了实现神经特异性荧光强度的最大化，同时将非特异性荧光背景信号以及组织损伤降至最低，研究者们需要对注射方式、显影剂剂量和预注射时间做到综合考虑。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程