Different concentrations of icariin for bone defect repair: disputes and exploration

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.023

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: As one of the main active ingredients in epimedium, icariin plays an important role in bone defect repair. Sustained and effective concentration of icariin in vivo is essential for bone damage repair.
OBJECTIVE: To recommend the research progress of epimedium glycoside for bone repair and to explore the pharmaco-active concentration of icariin.
METHODS: A computer-based online search of CNKI database (http://www.cnki.net/) and PubMed database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed) from January 2000 to October 2013 was performed for related articles of the effect of icariin for bone defect repair and bone damage repair. The key words were “icariin, concentration, bone” in Chinese and English. After repeated articles were excluded, 76 related articles were screened out and 44 of them met the inclusive criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: The icariin-released scaffold materials can induce the osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, promote the viability of osteoblasts and inhibit the resorption of
osteoclasts, thus repairing bone tissue. It is certain that icariin promotes cellular differentiation, however whether it can promote cellular proliferation remains unclear. The pharmaco-active concentration of icariin ranges from10-8 to 10-5 mol/L, but clinical trial has not yet been carried out, and specific drug concentration is uncertain, which needs further exploration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: traditional Chinese medicine, flavonoids, stents, mesenchymal stem cells, osteoblasts

CLC Number:

R318

Zhu Hong-fei, Zheng Jun, Xu Xiao-yan, Tang Wei-zhong, Nian Hua, Zhou En-yuan. Different concentrations of icariin for bone defect repair: disputes and exploration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 301-306.

Figures/Tables 1

2.1 不同浓度淫羊藿苷对于骨髓间充质干细胞、成骨细胞及破骨细胞的作用研究骨髓来源的间充质干细胞作为最早被认识的一类间充质干细胞，对于骨髓造血干细胞具有良好的支持作用，良好的增殖和分化能力使其在细胞替代治疗、组织工程创伤修复以及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。成骨细胞(osteoblast)位于骨组织表面，是骨形成以及损伤后修复重建过程中的重要功能细胞，淫羊藿苷能通过多种途径促进成骨细胞的增值与分化，并且促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这是骨修复的关键。破骨细胞作为骨细胞的一种，在功能上与成骨细胞相对应，行使骨吸收的功能。细胞的成骨分化是一个十分复杂的过程，需要成骨特异基因和蛋白的不断调控，在其发生、发展的各个阶段均需借助于基因、转录因子、细胞因子、激素以及局部微环境的精细调控。(bone resorption) 2.1.1 淫羊藿苷对于骨髓间充质干细胞的促分化作用淫羊藿苷具有雌激素样结构,通过抑制骨吸收,诱导骨髓间充质干细胞成骨分化起到促进骨修复的作用。蒋绍艳等[5]发现淫羊藿苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可将其视为一种良好的骨诱导活性因子。贾东升等[6]发现淫羊藿苷能通过促进骨髓间充质细胞成骨分化，并抑制骨髓间充质细胞向脂肪细胞分化，起到增强成骨细胞活性的作用，从而很好地对抗骨质疏松。杨丽等[7]以20 mg/L淫羊藿苷作为间充质干细胞药物干预浓度，发现转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的表达量明显上调，分析淫羊藿苷可能通过上调其表达量促进间充质干细胞向成骨细胞分化。吴昊等[8]采用10-11-10-4 mol/L浓度淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞诱导增殖，发现最佳促骨髓间充质干细胞骨向分化浓度为10-9 mol/L。研究发现，不同浓度的淫羊藿苷对于细胞因子的表达所起的作用也不尽相同。谢玲玲等[9]采用不同浓度淫羊藿苷对大鼠间充质干细胞进行干预，发现10-7和10-5 mol/L 2个淫羊藿苷组对于大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分泌血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的促进作用更显著。碱性磷酸酶作为骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及细胞外基质成熟的早期标志物，是参与骨代谢的重要蛋白质，对于体外的钙化起着非常重要的作用，并且在骨髓间充质干细胞成骨分化的过程中可能起到中间桥梁的作用。周建等[10]分别用浓度为1×10-5 mol/L的淫羊藿苷和蛇床子素对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞进行干预，于不同的时间点测定碱性磷酸酶活性和钙含量，RT-PCR检测转录因子Runx-2、OSX，骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果发现该浓度淫羊藿苷和蛇床子素干预均能提高碱性磷酸酶活性并增加Ca含量，提高转录因子Runx-2、OSX、骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA的表达水平，且淫羊藿苷提高骨髓间充质干细胞成骨性分化活性明显强于蛇床子素。Yin等[11]将骨髓间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞，采用5，10，20和40 mg/L淫羊藿苷进行培养，发现浓度为10 mg/L和20 mg/L淫羊藿苷能够使碱性磷酸酶活性增加并且增加矿化结节数量，而浓度在20 mg/L淫羊藿苷能够更好地促进碱性磷酸酶的表达和钙化结节生成，显著提高骨形态发生蛋白2 mRNA的合成。宋鹏等[12]采用1×10-5 mol/L的淫羊藿苷干预大鼠骨髓间充质干细胞的成骨性分化，发现淫羊藿苷显著提高了细胞中碱性磷酸酶的活性, 增加了钙化结节数,并且升高了成骨性相关因子骨形态发生蛋白2和Runx-2的基因表达量。Mao等[13]通过体外培养间充质干细胞株C3H10T1/2，给予淫羊藿苷(0, 10-7, 10-6, 10-5和 10-4 mol/L)联合成骨诱导液进行干预，碱性磷酸酶染色观察成骨分化情况，结果显示10-5 mol/L淫羊藿苷联合成骨诱导液促进C3H10T1/2细胞成骨分化能力最强，推断淫羊藿苷促进间充质干细胞株C3H10T1/2向成骨细胞分化，其作用可能与激活p38和抑制ERK蛋白的表达有关(表1)。 2.1.2 淫羊藿苷促进成骨细胞增殖与分化的研究大量体外实验证实，淫羊藿苷对于成骨细胞的增殖、分化及钙化有积极的促进作用。淫羊藿苷可以通过抑制成骨细胞凋亡，使骨形成增加，骨吸收减少，从而发挥促进骨骼生长的作用[14]。Hsieh等[15]研究发现淫羊藿苷是体外骨合成代谢剂，其成骨效应表现在可以诱导骨形态发生蛋白2和一氧化氮的合成，并调节核心结合因子α1/Runx2，骨保护素和核因子κB受体活化因子配体基因的表达，通过这种途径可能起到促进成骨细胞增殖和分化的作用，进而促进骨骼形成。柯勇等[16]分别用10，20，40 μg/L的淫羊藿苷作用于MC3T3-E1细胞，观察细胞生长情况，发现各组淫羊藿苷均可以促进成骨细胞增殖，增加成骨细胞骨形态发生蛋白2的表达，其中 20 μg/L组作用更为显著。但也有学者研究发现淫羊藿苷对于成骨细胞的作用并非直接促进其增殖，而是通过改变成骨相关基因的表达起到促进成骨细胞分化的作用。Zhao等[17]采用10-10-10-5 mol/L淫羊藿苷培养前成骨细胞株MC3T3-E1细胞，发现10-5 mol/L浓度淫羊藿苷对于提高成骨相关基因的表达作用显著。何伟等[18]通过实验发现10-8-10-4 mol/L的淫羊藿苷对成骨细胞并没有增殖促进作用，而是促进了成骨细胞的碱性磷酸酶活性；同时研究表明在10-6 mol/L浓度下，成骨细胞核心结合因子α1(转录因子)、骨形态发生蛋白2，4 mRNA的表达明显上调，表明淫羊藿苷可能通过上调核心结合因子α1、骨形态发生蛋白2，4 mRNA的表达来促进成骨细胞分化。淫羊藿苷可以通过多种途径增强成骨细胞活性，促进成骨细胞分化。研究发现，淫羊藿苷对成骨细胞Ⅰ型胶原的表达和骨钙素的合成具有明显的促进作用，可以刺激体外培养成骨细胞的增殖、分化和矿化[19]。转录因子OSX、Runx-2在成骨细胞的分化、成熟中扮演重要角色，并且Runx-2 蛋白参与成骨形成的早期阶段[20-22]。翟远坤等[23]采用终浓度分别为10-4，10-5，10-6，10-7 mol/L的淫羊藿苷对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞进行药物干预，发现浓度为10-5 mol/L的淫羊藿苷可显著增加钙化结节和成纤维细胞集落形成单位碱性磷酸酶数量，促进与成骨相关的转录因子Runx-2与Osterix mRNA的表达，同时也可增强Ⅰ型胶原蛋白的分泌，提示淫羊藿苷有较强的促骨形成活性。马小妮等[24]用10-5 mol/L的淫羊藿苷干预原代培养大鼠颅骨成骨细胞，结果显示，与对照组相比，淫羊藿苷能明显促进骨形成，表现为转录因子Runx-2、OSX、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达量及Ⅰ型胶原蛋白表达量显著增加 (P均< 0.01) ，同时提高细胞内钙离子浓度。骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体系统对于成骨、破骨细胞功能的调控作用非常重要。张秀珍等[25]发现不同浓度淫羊藿苷均可促进大鼠成骨细胞表达骨保护素mRNA，同时抑制核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达，且以10-7 mol/L作用最显著。整合素作为应力受体，在调节成骨细胞生长环境方面亦起着重要作用。雷涛等[26]以不同浓度淫羊藿苷与成骨细胞孵育，结果显示各淫羊藿苷干预组Ⅰ型胶原、整合素α2和β1的表达均升高，且以10 μg/L浓度组表达最高。关于淫羊藿苷对于成骨细胞增殖、分化的促进作用的研究很多，但浓度的最佳选择却一直没有定论。钱卫庆等[27]予不同浓度淫羊藿苷对体外培养大鼠成骨细胞干预，观察发现10 μg/L淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖、分化均有促进作用，且作用较其他各浓度组更强，更持久，说明该浓度淫羊藿苷能显著增强其成骨活性。Xiao等[28]发现，不同浓度淫羊藿苷对于大鼠成骨细胞表达骨保护素和Ⅰ型胶原mRNA表达的促进不同，10 mg/L浓度作用最明显；而Zhang等[29]采用2.0×10-9-1.0×10-5 mol/L淫羊藿苷培养原代大鼠颅骨成骨细胞,发现均能够促进碱性磷酸酶的表达，但各浓度组表达的生理活性并无明显差异，说明可能在某个浓度范围之内，淫羊藿苷对碱性磷酸酶的表达均有促进作用，但却不能确定哪个浓度是最佳浓度(表1)。"

References

[1] Chen SH, Lei M, Xie XH,et al.A PLGA/TCP composite scaffold incorporating bioactive phytomolecule icaritin for enhancement of bone defect repair in rabbits. Acta Biomater. 2013; S1742-7061(13):00039-1.

[2] 李时珍.现代本草纲目[M].7版.北京:中国医药科技出版社, 2001:2674-2677.

[3] Xiao Q, Chen A, Guo F. Effects of Icariin on expression of OPN mRNA and type I collagen in rat osteoblasts in vitro.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2005;25(6): 690-692.

[4] Chen KM,Ge BF,Liu XY,et al.Icariin inhibits the osteoclast formation induced by RANKL and macrophage-colony stimulating factor in mouse bone arrow culture.Pharmazie. 2006;62(5):388-391.

[5] 蒋绍艳,宋丹妮,史玉朋,等.淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J].海南医学院学报,2009,15(10):1198- 1200.

[6] 贾东升, 贾晓斌, 施峰, 等. 淫羊藿苷元脂质体的制备及其对大鼠骨髓基质细胞增殖分化影响的研究[J]. 中国药学杂志, 2010, 45(3):353-357.

[7] 杨丽,张荣华,朱晓峰,等.淫羊藿苷对大鼠间充质干细胞骨向分化过程中转化生长因子β1、骨形态发生白2表达的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(9):3518-3522.

[8] 吴昊,查振刚,姚平,等.淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志,2010,30(4):410-415.

[9] 谢玲玲,邹移海,刘炫斯.淫羊藿苷对骨髓间质干细胞增殖及分泌血管内皮生长因子碱性成纤维生长因子的影响[J].实用医学杂志, 2008,24(6):908-910.

[10] 周建,葛宝丰,陈克明,等.淫羊藿苷促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化活性强于蛇床子素[J].中国生物化学与分子生物学报, 2013,29(7):667-673.

[11] Yin XX,Chen ZQ,Liu ZJ,et al.Icariine stimulates Proliferation and differentiation of human osteoblasts by increasing production of bone morphogenetic protein 2.Chin Med J(Engl). 2007;120(3):204-210.

[12] 宋鹏,王鸣刚,姚娟,等. 淫羊藿苷对rBMSCs成骨和成脂分化的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(20):200-204.

[13] Mao XY, Bian Q, Shen ZY,et al. Analysis of the osteogenetic effects exerted on mesenchymal stem cell strain C3H10T1/2 by icariin via MAPK signaling pathway in vitrol. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2012;10(11):1272-1278.

[14] 张立娟，雷涛，张秀珍.淫羊藿苷对成骨细胞凋亡的影响[J].同济大学学报(医学版)，2008，29(1)：30-33.

[15] Hsieh T, Sheu S, Sun J, et al. Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2, SMAD4,and Cbfa1 expression. Phytomedicine. 2010;17 (6): 414-423.

[16] 柯勇,张功礼,禹志宏,等.淫羊藿苷对体外培养的成骨细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响[J].郧阳医学院学报,2008,27(3): 202-204.

[17] Zhao J,Ohba S, Shinkai M,et al. Icariin induces osteogenic ifferentiation in vitro in a BMP-and Runx2-dependent manner.Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(2): 444-448.

[18] 何伟,李自力,崔元璐,等.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表达的影响[J].北京大学学报:医学版,2009,41(6):669-673.

[19] 肖强兵，邹季.淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞I型胶原表达和BGP影响的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志, 2007,15(9): 36-38.

[20] Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, et al. The novel zinc fin-ger-containing transcription factor osterix is required for osteo-blast differentiation and bone formation. Cell. 2002; 108(1):17-29.

[21] Komori T. Regulation of osteoblast differentiation by transcrip-tion factors. J Cell Biochem. 2006;99(5):1233-1239.

[22] Nishio Y, Dong Y, Paris M, et al. Runx2-mediated regula-tion of the zinc finger Osterix/Sp7 gene. Gene. 2006;372: 62-70.

[23] 翟远坤,李志忠,陈克明,等.淫羊藿苷对体外培养乳鼠颅骨成骨细胞增殖、分化及成熟的影响[J].中药材,2011,34(6):917-922.

[24] 马小妮,葛宝丰,陈克明,等.淫羊藿苷调节成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的机制[J].中国医学科学院学报,2013,35(4): 433-438.

[25] 张秀珍,杨黎娟.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞护骨素、RANKL表达的影响[J].中华内分泌代谢杂志,2006,22(3):222-225.

[26] 雷涛,张立娟,张秀珍,等.淫羊藿苷对成骨细胞I型胶原和整合素α2β1表达的影响[J].中华内分泌杂志,2007,23(3):226-227.

[27] 钱卫庆,尹宏,孙海涛.不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响[J].中国医药导报,2011,8(36):23-25.

[28] Xiao Q, Chen A, Guo F.Effects of Icariin on expression of OPN mRNA and type I collagen in rat osteoblasts in vitro.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2005;25(6):690-692.

[29] Zhang DW, Cheng Y, Wang NL,et al. Effects of total flavonoids and flavonol glycosides from Epimedium koreanum Nakai on the proliferation and differentiation of primary osteoblast. Phytomedicine.2008; 15(1-2):55-61.

[30] 王建钧,张晓荣,李晓冬.淫羊藿苷对SD大鼠成骨-破骨细胞共育体系的影响[J].江西中医学院学报,2010,22(2):75-77.

[31] 李晶晶,于世风,李铁军, 等.淫羊藿对口腔各矿化组织破骨细胞性骨吸收的体外实验研究[J].中华口腔医学杂志, 2002, 37(5): 391-394.

[32] Huang J, Yuan L, Wang X, et al. Icarit in and it s glycosides enhance ost eoblast ic, but suppress ost -eoclastic, diff erentiation and activity in vitro. Life Sci. 2007;81: 832-840.

[33] 吕明波,刘兴炎,葛宝丰,等.淫羊藿苷对破骨细胞活性的影响[J].中国骨伤,2007,20(8):529-531.

[34] 张大威,程岩,张金超,等.淫羊藿苷对破骨细胞的分化及骨吸收功能的影响[J].中国药理学通报,2007,23(4):463-467.

[35] Roodman GD. Treatment strategies for bone disease.Bone Marrow Transplant.2007;40(12):1139-1146.

[36] Cui L,Liu YY,Wu T,et al. Osteogenic effects of D + beta-3, 4-dihydroxyphenyl lacticacid(salvianic acid A, SAA) on osteoblasts and bone marrow stromal cells of intact and prednisone-treated rats. Acta Pharmacol Sin. 2009;30(3) : 321-332.

[37] 王婷, 张大威, 张金超, 等.淫羊藿黄酮的分离鉴定及其对前破骨细胞株增殖的影响[J].中草药, 2006, 37(10):1458-1462.

[38] Xie F, Wu CF, Lai WP, et al. The osteoprotective effect of Herba epimedii extract in vivo and in vitro.Evid Based Complement Alternat Med. 2005; 2: 353-361.

[39] Grenha A, Seijo B, Serra C, et al. Chitosan nanoparticle-loaded mannitol microspheres: structure and surface characterization.Biomacromolecules. 2007;8(7): 2072-2079.

[40] Okumura M, Ohgushi H. Osteoblastic phenotype expression the surface of hydroxya patite ceramics. J Biomed Mater Res. 1997;37(4):122-129.

[41] 韩纪梅,李玉宝.纳米经基磷灰石与牙无机质的比较研究[J].功能材料,2005,7(36):1069-1071.

[42] Shen S, Fu D, Xu F,et al.The design and features of apatite-coated chitosan microspheres as injectable scaffold for bone tissue engineering. Biomed Mater. 2013;8(2): 025007.

[43] 李慕勤,王健平,赵莉.淫羊藿/天然高分子/磷灰石复合支架对成骨细胞增殖的影响[J].黑龙江医药科学,2008,31(5):1-2.

[44] Wu T, Nan KH, Chen JD, et al. A new bone repair scaffold combined with chitosan/hydroxyapatite and sustained releasing icariin. Chinese Sci Bull. 2009;54(9):1198-1206.