Directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.024

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells is the most promising tissue engineering seed cells because of their strong proliferation and passage ability, multi-directional differentiation potential, as well as no ethical problems and no rejection.
OBJECTIVE: To review the recent advances in the directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by various conditions
METHODS: The first author retrieved CNKI, PubMed, Wanfang databases for relevant articles published from January 2001 to September 2016. The keywords were “bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs, directional differentiation” in Chinese and English, respectively. Literature addressing experimental research and review were selected, and finally 48 articles were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells can be induced in vitro to differentiate into chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, and nerve cells by cytokines, chemical drugs, Chinese herbs and extracts, physical stimulation. To establish feasible induction conditions in vitro and improve cell induction efficiency is the basis for the clinical application of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Li Qiao-qiao, Wu Zhen-qiang, Zhang Li-jun. Directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 4082-4087.

Figures/Tables 1

2.1 骨髓间充质干细胞概述骨髓间充质干细胞是来自于中胚层的干细胞，主要存在于骨髓中[2]。目前国外已建立了小鼠、大鼠、兔和人的骨髓间充质干细胞系，并诱导分化出多种结缔组织，国内也出现了许多有关骨髓间充质干细胞的研究。骨髓间充质干细胞有以下生物学特性：①增殖能力和多向分化能力：在体外特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝样细胞、髓核样细胞等方向分化[3]；②不表达或低表达T细胞共刺激分子，避免免疫反应的发生[4]；③骨髓间充质干细胞来源方便，提取、纯化、培养及扩增均比较容易，研究表明其多次传代扩增后仍然具有干细胞的特性[5]；④移植后骨髓间充质干细胞具有向损伤区域主动趋化和迁移的特性[6]。由于骨髓间充质干细胞具有以上生物学特性，目前已成为组织工程研究的理想种子来源[7]。常用的分离方法有全骨髓贴壁法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法及密度梯度离心法等方法。分离出来的骨髓间充质干细胞在用于实验之前，需要经过鉴定。目前对骨髓间充质干细胞的鉴定有3类方法：①根据形态和培养特性检测，一般认为体外培养的骨髓间充质干细胞体积小、呈梭形、核浆比大、能连续传代培养；②根据标记分子鉴定，细胞表面蛋白如CD73、CD90、CD105 等呈阳性，但CD19、CD14、CD34、CD79呈阴性[8]；③根据分化潜能鉴定，在体外特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、髓核细胞等。 2.2 成软骨分化关节软骨损伤及缺损一直是骨科治疗的难题，关节软骨的惟一细胞成分是软骨细胞，能分泌大量细胞外基质，主要由Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖组成，对调节软骨代谢、维持关节功能起着关键作用，是软骨细胞的特征性标志。科学家认为骨性关节炎和其他炎性关节炎病理演变的关键是关节软骨细胞基质的丢失。软骨细胞的来源有限和自我修复能力差是软骨组织工程发展和应用的主要困难之一[9]，传统的治疗方案并不能完全恢复关节软骨的生物力学结构和功能，最近人们对软骨损伤修复的研究逐渐转向了细胞移植。软骨组织工程应用最广泛的细胞来源是软骨细胞和骨髓间充质干细胞。软骨细胞移植后并不能分泌足够的软骨细胞外基质，不能与软骨下板很好的融合[10]。骨髓间充质干细胞来源广泛，具有自我增殖能力和多向分化潜能，在特定条件下可分化为软骨细胞，且移植后能够与软骨下骨板更好地融合，是软骨组织工程的理想细胞[11]。体内软骨细胞由间充质干细胞分化而来，而体外分化必须有诱导因子的参与，可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞系分化的常用生长因子有碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子及骨形成蛋白等。刘林等[12]研究表明生长因子5(growth and differentiation 5,GDF5)在低糖DMEM中可促进骨髓间充质干细胞的增殖。Tian等[13]研究发现核心结合因子β促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。近来研究发现其他类激素也可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化，Karl等[14]研究发现甲状腺激素由骨形态发生蛋白4介导诱导骨髓间充质干细胞成软骨增生。相比其他各类化学诱导剂，中药单体作为诱导剂具有其独特的优势，如大部分中药价格低、易获取，同时中药诱导细胞存活时间相对较长，普遍具有抗氧化功能。汪建样等[15]证明中药淫羊藿素能够促进生长因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化。黄荷等[16]采用甲苯胺蓝染色法和SABC免疫组化法检测淫羊藿甙定向诱导后骨髓间充质干细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原情况，证明高剂量淫羊藿甙(60 μg/L)可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。诱导方法也会影响诱导分化结果，Fischer等[17]发现骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养时，软骨细胞分泌甲状腺激素相关蛋白促进软骨肥大。在成软骨诱导体系中，可使单层培养的骨髓间充质干细胞聚集诱导其向软骨细胞分化，并形成软骨小结。除了以上影响因素外，还有细胞本身基因的影响，闫继红等[18]构建Lv-miRNA-221-3p/222-3p-inhibition 共转染骨髓间充质干细胞，成功沉默了细胞中的 miR-221-3p/222-3p表达水平，RT-qPCR结果显示沉默骨髓间充质干细胞miRNA-221-3p/222-3p抑制了细胞增殖并促进了成软骨分化。刘波等[19]将第3代骨髓间充质干细胞转染miR-155基因，转染36 h后对细胞进行软骨诱导分化，结果显示miR-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化，而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展。王浩等[20]将大鼠骨髓间充质干细胞转染miR-23a基因，RT-PCR和Western blot检测结果显示miR23a可能通过上调SOX9表达及抑制 RUNX2表达来达到促进骨髓间充质干细胞成软骨分化并抑制其进一步肥大的作用。陈祁青等[21]采用免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和RT-PCR检测结果表明慢病毒介导的转化生长因子β1基因可成功转染大鼠骨髓间充质干细胞，并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。尽管应用骨髓间充质干细胞的软骨组织再生医学发展了很长时间，但骨髓间充质干细胞在临床应用中仍有许多问题需要解决，其遗传稳定性目前也有争议。未来软骨组织工程的工作重点是一方面提高骨髓间充质干细胞的分离、体外培养及分化技术，另一方面进一步研究骨髓间充质干细胞成软骨分化的确切机制及软骨分化相关信号通路；同时还需寻找或研发更适合于软骨修复的支架材料，使体外培养的组织工程软骨的生物学及机械特性与自体软骨更加接近，从而更进一步推动软骨再生修复医学的发展。 2.3 成骨分化骨髓间充质干细胞的成骨定向诱导是骨组织工程种子细胞研究的焦点。成骨细胞是骨形成的主要细胞，主要功能是分泌碱性磷酸酶，合成Ⅰ型胶原、骨钙素等细胞外基质，进一步基质矿化形成骨组织。成骨细胞鉴定指标包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形成蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等，碱性磷酸酶活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志，骨钙素是成骨细胞成熟的标志，也是成骨细胞功能的特异性标志。许多研究表明，骨髓间充质干细胞在一定条件下可以诱导为成骨细胞，骨髓间充质干细胞的分化有许多调控因素[22]，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、降钙素等,其中骨形态发生蛋白是发现最早和最有潜力的细胞因子，以地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C联合促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法最为常用。孙博等[23]研究EPHA2在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达的动态变化及其在成骨分化中的作用。采用RT-PCR和Western blot方法检测结果显示EPHA2在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达逐渐上升，EPHA2可能通过增强RUNX2的表达从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。研究表明多种中药或其有效成分也能调控骨髓间充质干细胞的成骨分化，王建华等[24]研究发现补骨脂素能在体外促进大鼠成骨细胞增殖，史春民等[25]研究发现补骨脂素的同分异构体异补骨脂素能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化并抑制其向脂肪细胞分化。Zhang等[26]研究发现淫羊藿总黄酮可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时抑制其向破骨细胞分化。梁广胜等[27]研究发现骆驼蓬碱通过诱导、活化骨形成蛋白和核心结合蛋白因子2的表达增强了鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。张洪长等[28]研究发现鹿茸多肽通过提高骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶活性，促进骨髓间充质干细胞增殖分化，上调骨髓间充质干细胞中BMP-2及其下游RUNX2基因和蛋白的表达来调控骨髓间充质干细胞向成骨分化。李文凯等[29]研究表明三磷酸腺苷促进骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达和钙沉积，抑制成脂肪相关基因表达和脂滴生成，但不影响细胞增殖，这些影响呈剂量依赖性。三磷酸腺苷可以激活ERK1/2通路，ERK1/2通路抑制剂U0126抑制了三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞的促成骨抑成脂效应。还有一些研究运用物理方法促进骨髓间充质干细胞成骨分化，周建等[30]研究了不同强度静电磁场对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化作用，AKP组织化学染色和钙化结节染色结果表明0.9 mT组抑制骨髓间充质干细胞增殖，1.5 mT到2.1 mT组不同强度静电磁场促进体外培养骨髓间充质干细胞的增殖。磁场能促进骨髓间充质干细胞成骨性分化，其中尤以1.5 mT和1.8 mT促进大鼠骨髓间充质干细胞分化作用效果最为明显。Yang等[31]研究表明正弦电磁场15 Hz、1 mT也可以刺激大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，电磁场增强了Runx2、ALP、BMP2、DLX5和BSP等成骨细胞特异性基因的表达。除了上述环境调控因素(分泌因素、细胞外基质，化学因素、细胞与细胞间的相互作用)的影响外，分化还受自身调控因素(控制基因表达的转录因子)的影响，张韬等[32]设计3条Sema4D基因的siRNA转染骨髓间充质干细胞，RT-PCR和Western blot检测结果显示Sema4D基因沉默后，骨髓间充质干细胞中ALP、BGP、CollagenⅠ，OPG的表达水平明显升高，而RANKL和RANK的表达水平明显下降。作者认为Sema4D基因可能通过上调 OPG/RANKL/RANK相关基因的表达来下调骨髓间充质干细胞成骨分化及成脂肪分化相关基因的表达。Jeong等[33]研究发现具有PDZ结合序列的转录共活化因子可以通过上调RUNX2的表达，进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；还可以通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，从而阻止骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。由于年龄、外伤和骨骼异常等原因引起的骨损伤和骨质疏松等目前常用的治疗方法有自体或异体、异种骨移植，但是有一定的问题和限制。组织工程骨组织的研究为骨损伤修复开辟了新的途径，但是在骨组织工程产品进入临床应用前，尚存在一些困难需要解决，其中最重要的是种子细胞的选择。在骨组织工程中种子细胞来源主要有成骨细胞和干细胞等，成骨细胞虽然有良好的成骨活性，但来源有限，大量分离和扩增困难，难以满足骨组织工程临床应用的需要。近年来，利用具有成骨潜能的骨髓间充质干细胞复合各种生物支架修复骨损伤已经取得了很大成果。如何诱导出大量有成骨活性的细胞以满足再造骨组织的需要已经成为现阶段骨组织工程学中种子细胞的研究热点，将组织工程化骨用于骨缺损修复也是未来临床治疗的趋势。 2.4 成脂分化肥胖的主要病理特征是脂肪细胞增殖和分化调控异常，如脂肪细胞过度肥大和异常增生，常常会引发2型糖尿病、心血管疾病及癌症等多种疾病。还有研究表明骨髓间充质干细胞过度分化为脂肪细胞，会使其成骨分化能力减弱、骨量丢失引起骨质疏松。骨髓间充质干细胞是目前用于研究脂肪细胞增殖分化及调控最广泛的体外细胞培养模型。一般通过调节PPARγ来促进骨髓间充质干细胞成脂分化，例如增加活性 PPARγ比例，调节PPARγ转录共刺激因子，增加PPARγ核转移等[34]，Choi等[35]研究发现罗格列酮可通过降低PPARγ-Ser273磷酸化程度增加骨髓间充质干细胞成脂相关基因表达。近年来有很多研究来抑制骨髓间充质干细胞成脂分化从而治疗疾病，多种物质会抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，如雷奈酸锶[36]，高浓度全反式视黄酸等[37]，刘革修等[38]研究发现促红细胞生成素可能通过增加p38 MAPK和ERK蛋白磷酸化，下调PPARγ、C/EBPα、FABP4和脂联素mRNA表达，从而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化。王洁等[39]发现17β雌二醇能显著抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂向分化。高飞等[40]研究表明小剂量间歇应用甲状旁腺激素1-34(PTH 1-34)可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，促进其成骨分化。张庆美等[41] 研究表明适当浓度姜黄素具有促进猪骨髓间充质干细胞增殖和抑制猪骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的作用，15 μmol/L 以上浓度反而显著抑制细胞增殖，且抑制作用随姜黄素的浓度增大而增强。 2.5 其他分化中枢神经系统的损伤、修复一直是神经生物学研究的重点和热点，随着干细胞研究的不断深入，利用干细胞治疗神经系统性疾病是未来发展的方向，目前国内外主要以化学制剂作为诱导剂(β-巯基乙醇、全反式维甲酸等)来诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化[42]，严珺等[43]研究证明适宜浓度的锌能够促进骨髓间充质干细胞增殖，而锌浓度增加到一定阈值，增殖能力反而下降甚至起到抑制作用，在适宜锌浓度处理下能够促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化，锌浓度过高对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化起到抑制作用。但是化学药剂有很多缺点，大量研究报道利用中药单体可以解决细胞毒性问题，张景欣等[44]研究发现杜仲可以促进骨髓间充质干细胞增殖和向神经细胞分化。除了药物诱导外，还有研究用共培养方法来诱导骨髓间充质干细胞分化。骨髓间充质干细胞除了可以在特定条件下诱导为成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞，还可以被诱导为其他细胞。吴增城等[45]采用半乳糖凝集素3联合肝细胞生长因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化，免疫荧光染色检测和实时荧光定量核酸扩增检测结果显示半乳糖凝集素3联合肝细胞生长因子能有效诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞。Han等[46]发现转化生长因子β1可以诱导骨髓间充质干细胞成为髓核样细胞。岳宗进等[47]通过腺相关病毒介导的基因转染技术，成功将BMP13和SOX9基因导入骨髓间充质干细胞，基因表达分析显示共转染的骨髓间充质干细胞中BMP13和SOX9的表达水平明显高于单独基因转染的细胞，表明BMP13和SOX9共表达具有协同促进骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向分化。刘汝银等[48]研究发现人血管内皮生长因子和转化生长因子β1可通过调节P38MAPK信号通路诱导骨髓间充质干细胞增殖并向髓核细胞分化，且血管内皮生长因子和转化生长因子β1的协同作用可以更显著增强骨髓间充质干细胞增殖和分化的能力，促进胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的表达，从而促进退行性脊柱的修复和再生。髓核细胞是一种类软骨细胞，是椎间盘的重要组成细胞，可以维持蛋白多糖和胶原蛋白的稳态，诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞表型分化，可以为椎间盘退变的细胞移植治疗提供可靠的种子细胞，是目前研究的热点方向。"

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