Extracellular matrix-derived scaffolds for cartilage tissue engineering

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.017

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: At present, a variety of extracellular matrix-derived scaffolds have been successfully applied for cartilage tissue engineering in experiment and clinical practice.
OBJECTIVE: To summarize the application and research status of extracellular matrix-derived scaffolds in cartilage tissue engineering.
METHODS: A computer-based online search in PubMed, CNKI, CqVip and WanFang databases was performed using the keywords of “tissue engineering, cartilage, extracellular matrix, scaffolds” in English and Chinese, respectively. A total of 1 140 literatures were retrieved, and finally 65 eligible literatures were included.
RESULTS AND CONCLUSION: In terms of the components, extracellular matrix-derived scaffolds are divided into monomeric natural polymers, mixed natural polymers, natural polymers compositing with synthetic polymers as well as acellular extracellular matrix-derived materials. Extracellular matrix-derived scaffolds hold good biocompatibility and degradability, and can promote proliferation and differentiation of choncrodytes; therefore, they as good bionic scaffolds have been applied for cartilage tissue engineering in clinical practice, However, poor mechanical properties and difficulty to molding should never be ignored. Further research should focus on improving the preparation technology by combining synthetic materials with extracellular matrix-derived scaffolds for cartilage tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Cartilage, Extracellular Matrix, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Xiao Tong-guang, Zhang Yi-min, Guo Wei-min, Liu Shu-yun, Yang Jian-hua, Guo Quan-yi.

Extracellular matrix-derived scaffolds for cartilage tissue engineering

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5737-5744.

Figures/Tables 1

2.1 软骨细胞外基质细胞外基质是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的基质结构。细胞外基质的组成决定了细胞外基质的功能，比如为细胞提供支持，调节细胞的动态行为和细胞间的沟通等[11-12]，不同组织中细胞外基质的成分各不相同[13]。软骨细胞外基质的主要组成成分是胶原、蛋白聚糖及其他非胶原蛋白和糖蛋白，以及多种生长因子、细胞因子和蛋白酶。胶原蛋白是软骨细胞外基质的非常重要且含量最多的大分子成分，在关节软骨中，Ⅱ型胶原占总胶原量的90%-95%，胶原蛋白最主要的用途是为组织提供张力和剪力，以及固定基质中的蛋白多糖[14]。蛋白聚糖是软骨细胞外基质中含量仅次于胶原蛋白的大分子，它是由糖胺多糖和核心蛋白组成的共价结合物[15]。糖胺多糖由长链未分叉的重复二糖单位组成。软骨中与核心蛋白共价结合形成蛋白聚糖的糖胺多糖有硫酸软骨素、硫酸角素和硫酸皮肤素，其中硫酸软骨素占55%-90%。关节软骨中80%-90%的蛋白聚糖形成大的聚合体，称为多聚蛋白聚糖。多聚蛋白聚糖和透明质酸(惟一不发生硫酸化的糖胺多糖)可与连接蛋白以非共价键结合，形成稳定的多聚蛋白聚糖-透明质酸-连接蛋白复合体，这种复合体间的非共价结合力非常强大，只有蛋白水解酶才能将其降解。在基质中，聚合作用可稳定多聚蛋白聚糖。其他成分包括：弹性蛋白，形成弹性纤维网状结构，赋予组织以弹性；纤粘连蛋白，可将细胞连接到细胞外基质上；软骨寡聚蛋白，只在软骨中出现，有联结软骨细胞的能力；以及少量脂质等。软骨细胞外基质还储存了许多的生长因子和细胞因子、骨形成蛋白、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、软骨调节素，并且形成了一个很好的储存池来储存它们。改变条件能够激活特殊酶的活动，引起储存池中因子的释放，达到快速和稳定调节细胞功能的作用[16-21]。 2.2 细胞外基质来源支架在软骨组织工程中，支架应从结构和成分上模拟软骨细胞外基质，为种子细胞的增殖及分化提供理想的微环境。天然高分子支架材料来源于生物体本身，具有生物相容性好、细胞毒性小、易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点[22-24]。细胞外基质源支架是指细胞外基质的一种或多种成分制作的支架，这些材料成分来源于细胞外基质，相比其他生物材料更接近软骨组织。常用的细胞外基质源支架材料有胶原蛋白、糖胺多糖、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、组织脱细胞细胞外基质等，这些材料可单独应用制作支架，但在单独应用时往往难以仿生天软骨的所有成分，因此也有研究者将这些材料进行两种或两种以上组合，或者将其与其他天然材料或人工材料组合应用[22-24]。细胞外基质源支架根据其组成成分的不同可分为4类：单体天然高分子材料、多种天然高分子混合材料、天然高分子材料与合成高分子材料复合构造的新型生物材料、组织脱细胞的细胞外基质材料。 2.2.1 天然生物材料常用的细胞外基质源性天然生物材料有胶原、明胶、透明质酸、硫酸软骨素、纤维蛋白等。胶原：胶原是软骨组织中的主要结构蛋白，使软骨组织具有其独特的力学性质。而且胶原蛋白也有利于细胞的黏附、增殖和分化。胶原降解后可为新生组织提供足够的空间，且能刺激软骨细胞分泌新的胶原。在软骨组织工程中，主要应用的是Ⅰ型和Ⅱ型胶原。软骨组织中的Ⅰ型胶原含量并不多，但仍然有人用Ⅰ型胶原制作软骨组织工程支架并获得了成功。Nugent等[25]在Ⅰ型胶原溶液中培养小牛膝关节软骨细胞，并在体外培养出了软骨组织，与天然软骨进行比较，证明了Ⅰ型胶原可促进软骨细胞产生细胞外基质并形成软骨组织。Yates等[26]将牛关节软骨细胞种植在Ⅰ型胶原海绵支架上培养4周，采用定量分析软骨细胞特异性基质合成物、基因表达产物的方式评价该支架，得到的数据显示，胶原海绵支架能够有利于软骨细胞的黏附、增殖、分化和表型的维持。Wakitani等[27]用Ⅰ型胶原凝胶与软骨细胞和间充质干细胞混合后修复兔膝关节软骨的全层缺损，取得了比较满意的结果。 Ⅱ型胶原作为软骨组织中含量最多的大分子，有促进软骨细胞分化、为软骨细胞黏附提供基础的作用，理所当然会作为支架材料应用在软骨组织工程当中。Lee等[28]用自体软骨细胞种植于Ⅱ型胶原支架在体外培养 4周后，修复犬的关节软骨缺损，发现缺损区再生的组织中纤维性组织修复明显减少，类软骨样组织明显增加，但修复组织的强度仅为正常关节软骨的1/20。Funayamn等[29]采用Ⅱ型胶原凝胶与兔软骨细胞混合后移植到兔右膝缺损处，结果表明，移植12-24周后，新生软骨与周围天然软骨呈现类似色泽且与周缘天然软骨整合良好。杨小红等[30]采用高纯度猪Ⅱ型胶原制成的海绵支架对兔膝关节软骨缺损进行修复，经过12周体内置入后取材进行检测，实验结果显示Ⅱ型胶原海绵支架可在体内诱导形成类软骨组织，并且生成的新生软骨具有天然软骨的表型及功能。明胶：明胶是胶原经部分水解后提纯而获得的蛋白质制品，属于天然高分子多肽聚合物。在医学上，明胶有利于伤口和骨骼的愈合，还可制作成包裹药物的胶囊、替代血浆和创伤敷料。在软骨组织工程中，明胶也被用来制作支架，Klangjorhor等[31]用医用止血明胶海绵制成软骨支架，负载上人软骨细胞，经过 21 d的体外培养，通过对特异性基质表达和表型基因的分析，证明了明胶支架有促进软骨细胞扩增和维持软骨细胞表型的能力。透明质酸：透明质酸为软骨细胞外基质的组成成分，具有特别的线性多聚糖结构，有增进细胞新陈代谢的功能，其主要组成是蛋白聚糖，由单聚体构成，可从微生物或生物体得到，因此透明质酸被作为一种可吸收支架材料得到了广泛应用。Stok等[32]综合评价了复合人胚胎干细胞的透明质酸支架与人类关节软骨在机械性能方面的区别，发现复合人胚胎干细胞的支架机械力学强度在培养2周和3周时比1周时有显著提高，但仍然不能达到正常的软骨水平。Toh等[33]采用透明质酸复合人胚胎干细胞体外培养，并用生长因子促进其生长，在体外培养2周后移植入SD大鼠膝关节滑车造模部位，12周后分化成为骨软骨组织，在其表面可看到光滑规则的透明软骨层，并与周围正常软骨和软骨下骨呈现完全整合。 Pasquinelli等[34]采用非取向透明质酸支架复合间质干细胞21 d，证明了该支架能够促进间质干细胞的黏附、迁移和增殖，以及在无任何化学诱导的静态培养条件下可合成自体软骨细胞外基质成分。Horák等[35]用透明质酸支架复合纤维母细胞用于人体股骨髁软骨移植，发现该方法能成功修复人体软骨缺损，并且随着时间推进临床效果会越来越好。 2.2.2 人工合成高分子材料人工合成高分子材料制成的支架会因为成分的单一而产生诸多问题，如对细胞的增殖分化影响较弱、修复时间长等。因此，研究者们通常采用将两种或两种以上材料混合，以期得到理想的软骨组织工程仿生支架材料。常用的材料有胶原、明胶、透明质酸、蛋白多糖、硫酸软骨素、糖胺多糖、纤维蛋白等，将上述材料按照不同种类和比例可制成特性各异的支架。 Allemann等[36]将胶原和不同浓度的透明质酸制成海绵材料，加入牛关节软骨细胞悬液培养后，发现低浓度的透明质酸与胶原蛋白共价结合，可促进软骨细胞合成蛋白多糖和硫酸软骨素及特定软骨细胞基因表达；杨泽龙等[37]将8∶1的Ⅱ型胶原和透明质酸通过静电纺丝技术制成三维支架，复合兔软骨细胞后观察其生物学形态和细胞外基质分泌情况，证明了该支架具有良好的生物学性能和促进细胞黏附及增殖的能力。Duan等[38]用Ⅰ型胶原和粘多糖-多孔钛双相支架修复犬软骨缺损，获得了令人满意的修复效果，缺损区完全被透明软骨填充，表面也和天然软骨很好的延续，形成了连续的软骨下骨。Levett等[39-40]分别用明胶、透明质酸、硫酸软骨素制作水凝胶支架和冻干支架，证明了该混合材料支架不但拥有良好机械性能，也能促进种子细胞的增殖和分化。Filová等[41]制备了复合的胶原-透明质酸-硫酸软骨素三维支架，实验结果表明此混合材料支架对软骨细胞不但有着较好的维持特异分化表型能力，同时具有良好的增殖力。徐奕昊[42]利用3D打印技术制备出了鼻翼软骨PGA/PLA支架并复合鼻翼软骨进行体外和体内修复检测，证明了3D打印的鼻翼软骨PGA/PLA支架具有精细的三维结构，能够再生出生理结构的软骨组织。2.2.3 复合材料天然高分子混合材料制成的支架会因为成分特点存在一些缺陷，例如力学性能差等。所以，通常将天然高分子材料和人工合成材料或一些非软骨细胞外基质来源的材料等进行混合制备复合支架，如蚕丝蛋白、壳聚糖、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙二醇、聚乙烯醇等。 Shi等[43]采用冻干法，将Ⅰ型胶原和脱乙酰度88%壳聚糖制备成多孔海绵状三维支架，并采用碳化二亚胺交联增强其力学强度，皮下种植实验证明其生物相容性和可降解性好。软骨细胞和支架复合体外培养后，发现该支架促进了软骨细胞的增殖、分化并能维持软骨表型。Cao等[44]将Ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素混合，通过冷冻干燥法制备成多孔支架，并用碳化二亚和N-羟基酰亚胺交联。体外评价发现，软骨细胞在复合支架中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达较高，且组织学分析表明支架形成了一个较厚的软骨层。Silva等[45]采用3D打印逐层叠加技术制作的壳聚糖/硫酸软骨素支架，被证明可以促进骨髓干细胞向软骨细胞分化并分泌软骨细胞外基质。Filová等[41]用透明质酸-Ⅰ型胶原-纤维蛋白支架复合软骨细胞用于修复猪的软骨缺损，证明了该支架具有在6个月内再生出软骨的潜能。郭涛等[46]采用发泡技术来制备了聚乙烯醇/明胶支架，并通过电镜分析、力学测试、皮下植入实验检测材料孔径和孔隙率、力学性能和生物相容性等，并证实聚乙烯醇/明胶支架具有较好的生物相容性和力学性能。Koller等[47]制作的PET-透明质酸/聚己内酯的生物材料支架可增强软骨的表型，增加了Ⅱ型胶原mRNA表达和的糖胺多糖产生量。Unterman等[48]制作了一种由非共价透明质酸固封的聚酯纤维水凝胶支架，用于修复大鼠膝关节缺损模型，获得了不错的修复效果。徐正良等[49]采用电纺丝构建聚己内酯-明胶纳米纤维膜复合体软骨支架，体外实验证明此材料支架能促进骨髓间充质干细胞成软骨分化，且支架具有较好的力学性能，细胞亲和特性以及良好的生物相容性。赖建明等[50]制备了一种胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石二层生物支架，复合骨髓间充质干细胞来在体外构建组织工程软骨，用来修复关节软骨缺损。实验结果显示该支架和天然软骨结构相似，并在湿润环境下各层力学特性有差别，对维持软骨表型及修复软骨损伤有着很好的作用。郑希福[51]制作了仿生聚乳酸-羟基乙酸共聚物/软骨细胞外基质复合取向支架复合骨髓间充质干细胞在体外构建组织工程软骨，用来修复关节软骨缺损。实验结果显示，聚乳酸-羟基乙酸共聚物/软骨细胞外基质复合支架能够促成取向性的关节软骨再生。聚乳酸-羟基乙酸共聚物/软骨细胞外基质复合支架中的软骨细胞外基质在体内能够诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞。 2.3 组织脱细胞细胞外基质支架软骨组织工程中应用到的组织脱细胞细胞外基质通常由软骨组织获得，但也有人从其他组织中获取脱细胞细胞外基质来制作软骨组织工程支架，例如骨、脂肪、内脏、脐带等[52-58]。这些材料都被证明可以用于诱导干细胞分化形成软骨细胞，可能成为软骨组织工程支架材料。但是，由于软骨以外的脱细胞细胞外基质在组成成分上与软骨细胞外基质有所差别，非软骨组织来源细胞外基质很难在软骨组织工程实验研究上与软骨细胞外基质相比较。Gibson等[59]用不同组织的细胞外基质修复软骨缺损，证明了上述观点。近年来有研究者发现，脐带Wharton胶细胞外基质在成分和结构特征上与软骨组织也类似[58]。而进一步的实验研究证实，脐带Wharton胶细胞外基质是优秀的组织工程软骨细胞外基质支架材料替代物[55-58]。但是总体来说，软骨脱细胞细胞外基质依然是最适合于软骨组织工程要求的脱细胞细胞外基质材料。软骨组织在制备成为细胞外基质来源的支架前，需要经历2个非常重要的步骤，组织脱细胞和支架制备。组织脱细胞的目的是在去除细胞膜物质、可溶性蛋白、核酸等引起免疫反应的物质，同时尽可能保留软骨细胞外基质成分，并保持其生物活性[59]。目前常用的脱细胞方法分两类，物理法和化学法。其中物理法有冻融法、机械振荡法、差速离心法等；化学法有酶消化法、高渗或低渗溶液脱细胞法、酸碱脱细胞法等。通常在脱细胞时会采用一种方法或多种的方法并用。在制备脱细胞细胞外基质材料时，应该更多关注脱细胞是否完全及成分的丢失[60]。当细胞外基质材料制备完成后，需要把它制作成支架。目前已研究出多种制备软骨组织工程支架的方法。制备工艺的不同对支架性能可产生明显影响，在实际应用中可以根据条件选择不同的制备工艺[61-62]。冷冻干燥法将细胞外基质浆料灌注于模具中，在低温下冷冻干燥，然后进行交联处理，最后经过消毒后制成成型3D支架。 Pati等[63]采用物理法、化学法和酶法组合并改良的方法处理制作软骨细胞外基质材料，并结合水凝胶技术和3D打印技术制成支架，证明了脂肪干细胞可在该支架上分化形成软骨细胞并进一步形成软骨组织。Kang等[58]用Triton X-100对软骨进行脱细胞处理，用冻干法制作支架并复合脂肪干细胞，证明了该支架-种子细胞复合体是体外构建组织工程软骨的良好方法。而杨强[52]和赵鹏等[57]用类似的方法制作了软骨细胞外基质来源支架，并分别证明了骨髓干细胞和脐带Wharton 胶间充质干细胞也可用于软骨修复。Almeida等[64]用粉碎、离心的方法制作软骨细胞外基质，冻干制作支架后复合脂肪干细胞，并将其与胶原-透明质酸支架进行对比，证明了细胞外基质支架在软骨组织工程中比胶原-透明质酸支架更利于软骨形成。软骨脱细胞细胞外基质支架材料有诸多优势，它完全取自生物组织，经过脱细胞处理后最大限度去除了免疫原性，还保留了非常多天然软骨细胞外基质的有效成分，能提供比单纯成分材料和人工混合材料更好的种子细胞生长微环境；细胞外基质中含有天然细胞因子，可在没有添加外源性细胞因子的情况下促进种子细胞的增殖、分化。当然，细胞外基质作为支架材料也有它的弊端，由于在制作过程中几乎没有办法维持软骨组织原有的物理性状，制成的细胞外基质支架在生物力学特性上不能达到天然软骨的程度，并且在种植种子细胞后出现萎缩现象，但这些问题可通过在制作支架时使用交联的方法得到极大改善。Rowland等[65]分析了热交联的处理、紫外线照射和化学交联剂碳化二亚胺对支架收缩的影响，并复合成人骨髓来源干细胞进行软骨细胞分化培养，并证明了交联(非交联作对照)可防止细胞介导的细胞外基质支架收缩。"

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