2.1  传统骨缺损治疗方法  传统的骨缺损治疗方式有自体骨移植与异体骨移植、骨搬延长术和诱导膜技术等。由于其出现较早，技术不断的改进，操作越来越熟练，所以在临床中得到了广泛应用。 2.1.1  自体骨移植  自体骨移植是医治骨缺损最传统的方法，是将患者自身其他部位骨截取部分，移植到缺损部位，通过“爬行取代”达到骨愈合。由于取自自体腓骨、髂骨、肋骨或跟骨等骨，因而相对于异体骨不会出现免疫排斥；且取骨与植骨同时开展，可以取到新鲜健康的骨组织，不需要保存及二次手术的开展，能够减少感染的发生，其愈合率也非常可观，并且自体骨本身具有极强骨生成刺激作用。临床中自体骨移植可分为不带血瓣的自体骨移植、带血瓣的自体骨移植、松质骨移植等。不带血瓣的自体骨移植是最早应用于临床治疗骨缺损，左东波等[1]采用自体骨植骨治疗前臂骨缺损，效果确切。有研究证实自体骨移植在不应用血瓣的情况下成活率较低，主要是成骨对血液循环的要求较高，周训银等[2]对76例患者采用吻合血管的自体骨移植修复下颌骨缺损证实，非血管化的自体骨移植过程中移植的骨片或骨瓣均无血流提供而失去生机，移植到受区后，需通过“爬行取代”作用达到骨愈合，其成功率为58%-80%，而血管化自体骨移植重建下颌骨其成活率高达92%，所以不带血瓣的自体骨移植血运很关键。对于不带血瓣的自体骨移植，有着术后供骨区存在长期的疼痛、感染可能性大、供骨区骨容量有限和应力性骨折等问题[3-4]，目前寻找一种生物材料能够完全代替自体骨是主要的研究方向，也有学者指出或许在缺损部位填充自体骨髓或血小板血浆以及一些血管生长因子也能解决血运问题。带血瓣的自体骨移植治愈率非常可观，TAYLOR等[5]在1975年首次报道了带肌蒂骨瓣移植的成功案例。而后这一方式被普遍推崇，到目前为止此项技术仍然广泛应用，李远辉等[6]采用带血管腓骨移植修复四肢大段骨缺损，证实了带血瓣自体骨移植可观的临床疗效。但对于带血瓣的自体骨移植，有着手术操作难度大、带血瓣的自体骨来源少以及后期供骨区并发症问题。对于以上问题目前解决方法主要是提高术者操作能力、术后严格管理、寻求新的自体骨替代物等[7]。松质骨移植供骨区主要是髂骨，其原因是髂骨骨量多、位置表浅。松质骨中存在大量的成骨细胞所以形成新骨的能力较皮质骨强，但其生物力学强度较皮质骨差，所以其适用于小范围、不起支撑作用的骨缺损，且不适于骨质疏松的老年患者。 2.1.2  异体骨移植  异体骨移植是指同类个体给另一个个体的移植，其原理同样是爬行替代作用，且随着新生骨的生长，异体骨也逐渐分解，异体骨主要起着生物力学作用和骨诱导作用。异体骨移植与自体骨移植相比，其具有来源广泛、生物力学强度大，以及使用不受形态、大小限制等优点[8]，一直在临床有着广泛应用。近期张翼等[9]对于21例四肢恶性骨肿瘤切除后骨缺损病例进行大段同种异体骨移植重建，结果证实临床效果良好。异体骨移植由于宿主与供骨者之间有着遗传差异，所以免疫排斥是制约异体骨移植疗效的主要因素，同时也有着增加传染病的风险，对于这一问题，目前冷冻、冻干、脱矿和煮沸都取得了不错的效果[10]。 2.1.3  Ilizarov骨延长术  Ilizarov骨延长技术是由俄罗斯医生Ilizarov在20世纪50年代提出的，原理是张应力规律及骨细胞的强再生能力，可以通过牵拉组织来刺激骨的生长，以填补骨缺损。其操作方法是在正常段截骨，在体外安置外固定架，在张应力的作用下逐渐增大正常截骨处的缝隙，由新生骨填补，通过调节外固定架治疗骨缺损。Ilizarov骨延长术是目前临床应用最广泛的技术，钟甫华等[11]在应用骨搬移技术治疗下肢创伤后严重复杂感染长段骨缺损，对于所在医院近10年来37例下肢创伤后严重复杂感染长段骨缺损患者进行疗效分析，证实其疗效确切，伤口小，并发症相对较少，手术简单，可以广泛传播。随着科学技术的不断进步，目前对于Ilizarov骨延长术外固定架的使用主要是环形外固定支架和单边外固定支架[12]，外固定架的使用会导致患者术后康复及护理困难，出现钉道感染、假关节形成骨再生不足、矿化不全、畸形等并发症问题[13]。对于这些问题的解决方法是要合理的调节外固定架，并加强术后管理。基于张力-应力法则衍生出了许多疗效可观的治疗方法，如“手风琴技术”[14]，以及于福铎[15]在应用Ilizarov骨搬运技术治疗骨缺损的基础上增加了自体骨髓和血小板血浆注射于截骨处，证实了Ilizarov技术在治疗下肢创伤后感染性骨缺损的疗效。Ilizarov骨搬运技术存在的主要缺陷是手术次数多，外固定架佩戴时间长对于患者来说不易接受，所以国内外学者一直都致力于改进Ilizarov技术来弥补其存在的缺陷，目前半针的出现、计算机软件辅助的Taloy架的出现、Orthofix单边外固定支架的出现、Paley数理分析的矫形原则的出现等等，都预示着Ilizarov技术将会越来越完善，其存在的问题将会逐步解决。 2.1.4   Masquelet诱导膜技术  Masquelet技术被认为可以修复各种类型的骨缺损，使用范围较广泛，其原理为创造一个类似骨膜的骨诱导膜，利用其成骨作用，促进骨质的愈合。Masquelet技术形成的诱导膜上有沿着长骨长轴方向走行的血脉系统，且能大量渗出对骨骼生长有着促进作用的物质，如血管内皮生长因子、转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2等[16]，诱导膜起着防止骨吸收的隔离作用，有着与骨膜相似的强大成骨作用。其治疗方法是先清创缺损，然后填充聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥形成骨诱导膜，诱导膜形成后，打开骨诱导膜取出骨水泥，然后植入骨(松质骨)。1986年法国研究人员MASQUELET等[16]首次应用膜诱导技术成功治愈了长达25 cm的骨缺损患者。由于治疗周期短、花费少、效果好、方便易被患者接受，所以在这之后该技术被广泛应用于临床。最新报道陈鹏等[17]通过对12例行Masquelet 技术的骨缺损患者进行研究，发现其疗效确切。Masquelet诱导膜技术是治疗感染性骨缺损最为有效的方法之一，感染后骨缺损软组织常不能完全覆盖创口，以致血运不好，尤其是大于5 cm的骨缺损，其他技术临床效果均不是很好[18]。Masquelet诱导膜技术由于一期的彻底清创，减少了后期感染的可能性，骨水泥的填充防止了软组织死腔的形成；二期内植物留于体内对于患者来说容易接受，并且相对于Ilizarov骨缩短-延长技术，其花费时间较短，软组织不易切入，对位也较好。由于骨水泥生物力学强度差，所以需要增加其机械强度，随着理念的更新和技术的进步，目前主要是应用髓内锁定钉，其可以提供良好的轴向稳定性[19]。现研究方向主要是在骨水泥中添加抗生素，起初抗生素没有添加到骨水泥中是因为担心在骨水泥中添加抗生素会遮掩清创的不彻底[20]。随着时间的推移，研究人员开始在骨水泥中添加抗生素，将其补充到骨骼缺陷，以便能够储存和释放到感染部位，以控制传染性骨缺损。杨聪林林等[21]采用Masquelet技术治疗感染性骨缺损，并指出了该项技术的成功与否关键在于一期清创的彻底性和抗生素骨水泥的配比比例，第二阶段手术时机的选择应在第一次手术后的6-8周内进行。对于Masquelet诱导膜技术现阶段主要问题是二期骨水泥的剔除操作难度大，容易损伤诱导膜，并且聚甲基丙烯酸甲酯的不可降解性对于感染性骨缺损来说药物释放浓度难以保证，以及感染的可能性以及植骨吸收等问题[22]。磷酸钙和硫酸钙等可降解骨水泥的出现，解决了部分问题，徐建平等[23]运用硫酸钙介导的诱导膜技术与常规诱导膜技术治疗胫骨创伤后大段骨缺损，临床疗效对比结果显示，硫酸钙介导的诱导膜技术由于硫酸钙骨水泥可降解所以具有二期骨水泥容易取出、残留缺损少、植骨量少等优势。对于可降解骨水泥有着降解速度不可控制的缺点，如果过快软组织会切入，力学条件较差会不稳定，形成的骨诱导膜较薄容易损伤；此外骨诱导膜的成骨性在骨水泥填充后的第4周达到高峰，6周后开始下降[21]，但对于一般的感染性骨缺损来说感染必须达到有效控制才可以植骨，并且过早的植骨存在骨诱导膜过薄的问题，且在剔除骨水泥植骨后出现骨折端骨不连的现象。 2.2  组织工程骨技术  组织工程近年来出现，主要致力于开发生物替代品、修复、维持和刺激各种受损组织或人体器官的功能。由于组织工程的密集使用，组织工程发展迅速，随着组织工程的发展，组织工程技术在治疗骨骼缺陷方面的应用已成为一个受欢迎的研究场所，即骨组织工程技术。其原理和方法是从患者自身提取出所需的种子细胞，在体外经过特殊的体外培养技术，使其大量增殖，然后把培养的种子细胞放置在适合缺陷部位形态结构的细胞支架上，该支架具有良好的生物相容性，其可以是天然的，也可以是人工的。细胞支架主要用于为种子细胞提供稳定的繁殖空间，为其输送养料，排除代谢产物，并能够限制细胞群的生长形态，使其按着支架的形态生长，并提供缺损部位的力学强度，接着将植入种子细胞的支架放入到已经清创的骨缺损部位，随着种子细胞的成骨作用，支架材料也开始降解，最终完成骨缺损的治疗。组织工程骨技术治疗骨缺损由Crane首次提出，之后这一方法被广泛推崇[24]。骨组织工程技术由于其良好的骨传导能力和骨诱导能力，为骨缺损的治疗提供了良好的前景，从开始应用于口腔颌面骨缺损治疗逐渐发展为治疗四肢大段骨缺损的有效方法之一[25-26]。目前组织工程骨技术研究方向主要是对于理想种子细胞的选择、体外培养种子细胞技术、支架材料选择和血管化问题解决等。理想的种子细胞选择首先需要在体外能够大量培养，其次要求能够有好的成骨活性、取材方便对自身损伤小、无制瘤性的特点。体外种子细胞培养技术目前相对成熟，主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法、膜过滤方法及膜迁移法等[27]。支架材料的选择主要是寻找具有良好生物相容性的支架，这些支架可以在体内分解，对人体没有不良反应。血管化问题的解决迫在眉睫，目前主要是寻找一种能够产生足够的新生血管，维持血供，提供足够的营养，并且有一定成骨作用的物质或方法，通过与组织工程技术结合来治疗骨缺损。 2.2.1  种子细胞  种子细胞是骨组织工程技术的核心，通过组织工程方法用于组织和器官复制的不同类型的细胞称为种子细胞。骨生长的力学行为与骨细胞中的成骨细胞密切相关，所以成骨细胞最先被考虑为种子细胞，成骨细胞的来源虽然可以是骨、骨膜、骨髓及骨外组织，但其来源少，体外不易培养，它的增殖和分化受到遗传因素、激素水平和细胞调节剂的影响和调节，不是最为理想的种子细胞。1981年EVANS等[28]首次从小鼠中分离出胚胎干细胞，众所周知，胚胎干细胞具有分化的全能性和强大的增殖能力，可以诱导其分化为骨细胞来治疗骨缺损，但由于其提取困难、不易培养以及存在伦理问题被否决了。之后又把目光转向了诱导多能干细胞以及现在被广泛使用的骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和具有很大发展潜力的基因修饰干细胞[29-30]。但基因工程技术不是很完善，有致瘤性，而且存在很多不可预知的危险。骨髓间充质干细胞成为目前相对理想的种子细胞，其在很大程度上满足了基本需要，主要是因为它们可以分化为成骨所需的细胞和分泌成骨所需的物质，而且有强大的增殖能力，可以从患者自身提取，避免了免疫排斥，具有体外容易培养、组织耐受性好、容易定向分化能够维持定向组织活性的优势，所以目前被广泛使用，并且其优越的临床效果也得到了证实。2012年OSUGI等[31]将体外培养的骨髓间充质干细胞移植到骨缺损部位，结果显示移植至缺损部位的数量较多并可促进骨缺损的修复。最新报道束佳鑫等[32]采用β-磷酸三钙联合骨髓基质细胞治疗骨缺损与单独β-磷酸三钙治疗通过分析术后骨形成度[MD=9.06，95%CI(4.44，13.6)]、骨能量吸收值[MD=15.90，95%CI(5.48，26.33)]，证实β-磷酸三钙联合骨髓基质细胞治疗骨缺损效果更好。但骨髓间充质干细胞并不能无限繁殖，有研究表明，体外培养骨髓间充质干细胞最多培养20-40代，过多培养其产物会出现变异、生长抑制、半衰期变短以及功能减退的现象[33]。脂肪干细胞具有成骨作用，在组织工程骨技术中也有着广阔的前景，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞体内浓度是骨髓间充质干细胞浓度的100-300倍[34]，来源丰富使其成为研究的一大热点，且脂肪干细胞在一定诱导条件下能分泌碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、基质细胞衍生因子1等活性成分[35-36]，使得其造血能力和增殖能力都较骨髓间充质干细胞强。 2.2.2  支架材料  组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，支架材料充当种子细胞及活性因子的载体，为其提供一个稳定的生长环境，作为组织分化和新陈代谢的场所，引导细胞、让血管沿着支架的孔隙繁殖，并起支撑作用，所以理想的支架材料必须要有良好的生物相容性及降解性、表面活性、骨传导性、骨诱导性、机械强度以及合适的孔隙率等[33]。目前主要有天然可降解材料、人工材料。天然可降解支架材料由于材料有限，强度较差，存在免疫排斥以及降解速度不可控制的缺点，临床前景较局限[33]。人工材料目前临床应用前景十分广阔，和天然材料相比其降解速率可以控制，并有较好的生物相容性是其最大的优势，但也存在一定的缺陷，如陶瓷支架缺乏相互连接的孔，在体内吸收较慢，且缺乏天然骨中存在的生物因子来促进强大的成骨分化，并且容易发生骨折，所以广大学者致力于寻找较为完美的支架材料。由于骨骼本身便是一种复合材料，所以在支架材料的选材制作过程中，2种或2种以上材料混合形成的支架似乎是合乎常规的，通过取长补短来改善骨传导、骨整合、骨诱导和增加血管形成，所以复合材料是目前组织工程骨技术的主要研究方向[37-38]。LI等[39]采用聚乳酸羟基乙酸共聚物/明胶/纳米羟基磷灰石复合支架治疗骨缺损，结果表明，该复合支架能够更好地支持成骨细胞的黏附、扩散和增殖，与纯聚乳酸羟基乙酸共聚物支架相比，该复合支架具有细胞相容性和更高的骨诱导活性。 最新报道指出胶原-羟基磷灰石与微纤化纤维素复合所得的一种新型骨替代材料，与纯羟基磷灰石相比，抗压强度提高了20- 40 MPa[40]。从复合支架材料理念中思考是否可以在支架中加入一些其他物质构建自体组织与外来组织的桥梁，起到增加支架生物活性的作用，以改善骨传导、骨整合、骨诱导和增加血管形成。TARAFDER等[41]证实了这一理念的效果，其使用磷酸三钙支架并进行了聚己内酯/阿仑膦酸涂层，与只使用磷酸三钙支架相比，具有聚己内酯与阿仑膦酸复合涂层的支架可局部缓慢释放阿仑膦酸，保护磷酸三钙支架的结构完整性以免在酸性环境中高度溶解，促进早期骨形成增加。近年来微孔联通结构设计理念的提出也得到了认可，腾强等[42]证实了这一理念，其指出对于支架材料设计合适的孔隙率，有利于血管和新生骨的生长，也可加快支架在体内的降解速率。 2.2.3  血管化  目前骨髓间充质细胞和脂肪干细胞被当作较为理想的种子细胞，能够满足人们的需求，复合材料发展已经让组织工程技术得到了很大的进步，但其仍没有广泛应用于临床，其原因就是骨髓间充质细胞与生物材料复合物植入体内后如何及时建立血供连接仍需进一步研究[43]。成骨的关键在于血供，血管通过与组织液交换物质来提供营养和处理废物，因此骨缺损的治疗必须基于血管化。目前对于血管化问题的解决主要有两种方式，第一种方法是将能够促进组织工程的骨骼血管化的生长因子与支架材料结合起来，第二种方法是植入自体血管束或肌肉瓣。ZHAO等[44]利用骨髓间充质干细胞与兔桡动静脉束结合，植入骨缺损处，结果证实，与未植入血管束相比新生血管数量增多。曹波等[45]证实了血小板衍生因子促进血管内皮细胞血管化这一理念。目前还提出了一种血管化的方法，就是将能够分泌生长因子的细胞同种子细胞一同培养，然后结合支架填补至缺损部位治疗骨缺损，所以把目光聚集到了成血管细胞，即内皮祖细胞，其是血管内皮细胞的前体细胞，主要来源于骨髓，该细胞在机体受到损伤或某些刺激时，可通过血液循环动员到该处，形成新的血管[46]。USAMI等[47]用裸鼠骨髓间充质干细胞和背皮下血管祖内皮祖细胞混合培养治疗骨缺损，证实了新血管生成能力的增强和对骨化的刺激作用。 2.2.4  3D生物打印技术  3D生物打印技术是一种将生物材料从计算机化的三维模型中组装起来的新技术，用于绘制人体器官和生物医学产品。对于其在组织工程技术上的应用，主要是其可以制造细胞分布可控的支架[48]，同时3D生物打印技术可以增强支架的机械性能和生物相容性以及调整孔隙率。目前对于3D生物打印技术在组织工程骨技术领域的研究方向主要是通过该技术来控制支架的降解速率，以及调节孔隙率解决血管化的问题。 "