2.1  红细胞生成  红细胞是无核细胞，携带氧气到组织中发挥重要作用。每微升血液中含有500万的红细胞，红细胞是血液中最多的细胞类型。为了保持血液中的红细胞数量，骨髓每秒产生200万个红细胞，因此，红细胞的生成受到内在和外在双重因素的准确调控。临床上，红细胞生成调节异常可导致贫血或红细胞增多症。 在成年哺乳动物中，稳定状态下红细胞的生成几乎全部发生在骨髓内。红细胞的生成是一个复杂而动态的过程，同时保持自我更新能力，成熟红细胞是由造血干细胞和祖细胞产生的。造血干细胞可分化成不同类型的祖细胞中间体，但是在分化过程中也有一定的限制和成熟障碍[1]。最近的单细胞追踪研究显示，RNA测序和移植可以在比先前更早的阶段确定分化谱系。髓系祖细胞上的单细胞RNA测序显示，极个别的祖细胞可表达具有对多种细胞分化因子趋向起决定作用的转录因子。相反，个体细胞聚集成谱系特异性的分化组[2]。此外，在观察老鼠已标记的祖细胞上单细胞系转化的过程中发现，少量骨髓祖细胞具备分化成细胞系和骨髓细胞系的能力，从而提示骨髓祖细胞是一种多向分化的前体细胞，而不是单一定向分化的细胞系。RODRIGUEZ- FRATICELLI等[3]发现红系在稳定状态条件下相比于巨核细胞系，与淋巴系和髓系关系更密切。TUSI等[4]得出与此不一样的结论，利用单细胞转录组学，表现出连续分化轨迹的红细胞生成的等级视图，从多能祖细胞到祖细胞的红系与红系-嗜碱细胞/肥大-巨核系细胞到早期红系祖细胞，促进红细胞的生成。 这些研究存在差异，可能由于表面标记物的选择不同，或者祖细胞可塑性在体内外存在差异导致的。总体来说造血干细胞的分化是一个高度动态和适应性的过程，尽管很复杂，但只要达到红细胞终末分化的阶段，红细胞生成就非常顺利。在骨髓中，红系祖细胞通过一系列阶段分化，包括原始红细胞、嗜碱性和嗜多色幼红细胞、幼红细胞，最后通过去核获得网织红细胞，这些不同的阶段基于细胞体积的逐渐减少，红细胞生成已经在形态学上被确定，增加染色质浓缩和增加血红蛋白化以及通过表达细胞表面分子CD71和Ter119。 骨髓微环境中红细胞生成的调节依赖于全身和局部控制的红系祖细胞分化、增殖和生存。积累的临床和临床前研究数据表明，骨髓中红细胞生成和骨稳态的调节是相协调的，细胞和分子因素可能影响骨稳态。 2.2  红细胞生成与骨稳态的临床相关性  临床研究发现贫血和红细胞生成增多的患者中红细胞生成和骨稳态具有功能相关性。贫血和红细胞增多症患者均有骨质异常风险疾病。慢性溶血性贫血的患者，如地中海贫血，患者骨量显著下降，出现骨质疏松、骨折和骨痛症状[5]；与镰状细胞病相关的贫血中有80%的患者骨质密度较低[6]；此外，贫血在老年患者人群中很常见，并且与骨折和低骨密度的风险相关[7]；真性红细胞增多症患者也增加骨质疏松性骨折的风险[8]。虽然这些临床试验研究提供了一个红细胞生成障碍与骨缺血的相关性，但是贫血和红细胞增多症患者发展骨病的机制尚不清楚。OIKONOMIDOU等[9]研究表明，在地中海贫血和红细胞增多症的小鼠模型中可发生骨病，很容易猜测在这种情况下红细胞生成需求，骨髓微环境和造血可能协调地改造以支持增强的红细胞生成输出，从而影响骨稳态。 2.3  促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)与骨稳态  EPO是一种糖蛋白细胞因子，分子质量为34 kD，同时也是一种造血因子，在维持最终的红细胞生成中起着关键作用[10]。EPO的主要造血功能是通过与其在红细胞上表达的特异性同型二聚膜受体EPO受体结合而发挥的[11]。越来越多的证据表明，糖蛋白EPO可能对红细胞生成和骨稳态的起协调作用。EPO是针对组织氧合作用下调节红细胞数量必不可少的，通过刺激红细胞上的EPO受体诱导红细胞的生成，刺激骨髓存活、增殖和分化，从而提高血液的携氧能力。EPO与EPO受体结合后，EPO受体能够通过JAK2、MAPK和PI3K激酶进行同型二聚体的信号传导[12]。EPO/EPO受体激活促进红细胞生成的JAK2/ STAT3/STAT5信号通路。JAK2的失活可导致贫血，而JAK2突变可导致红细胞数量的增多和红细胞增多症。小鼠发育过程中缺乏EPO可导致心衰和贫血，并最终导致胚胎死亡[13]。临床上EPO表达失调导致血清EPO水平不足发生贫血，EPO生成过多致红细胞增多症。增加EPO基因转录的主要生理机制是组织缺氧，其可以诱导循环血清EPO水平增加。针对贫血，肾小管周围间质细胞产生由缺氧诱导因子2驱动的EPO。在缺氧诱导因子稳定的条件下，成骨细胞也能够产生EPO促进红细胞生成[14]，表明针对成骨细胞EPO，可以在临床上利用脯氨酰羟化酶抑制剂稳定缺氧诱导因子1和缺氧诱导因子2来治疗贫血[15]。然而，成骨细胞EPO在生理条件下的作用仍在进一步研究中。 EPO除了调节红细胞生成之外，还调节骨稳态。使用反转录酶-聚合酶链锁反应、蛋白质印记、流式细胞术和(或)功能测定法，在小鼠、人类和其他啮齿类动物的骨细胞中鉴定出EPO受体的表达[16]。在人骨髓成骨细胞中，几乎所有的EPO阳性细胞中都有CD131的表达，利用EPO受体/CD131异二聚体受体来发挥EPO的作用。一定剂量的EPO可诱发骨矿化增加、增加碱性磷酸酶活性和成骨细胞基因的表达[16]。鉴于促生成骨反应所需的EPO剂量相对较高，而生理上EPO基础血浆浓度在6-32 U/L之间，在0.5和5 U/L之间的低剂量时，EPO却抑制成骨细胞矿化，因此，EPO在成骨细胞中的作用似乎是剂量依赖性的。当EPO浓度非常高时，EPO会刺激成骨，而在较低的生理相关剂量时，EPO的作用正好相反，成骨细胞分化和矿化的衰减。外源性适当剂量的EPO治疗可以增加骨量和骨质的修复，小鼠股骨骨折修复模型中EPO治疗可增加骨的生物力学的特性[17]。在新生和成年小鼠中，外源性EPO治疗(6 000 U/kg)足以诱导骨形成[18]。在一项兔子脊柱融合模型中，每日皮下注射β-EPO   (250 IU/kg)共20 d，6周后可增加骨的形成[19]。EPO增加软骨和缺损骨愈合，骨形成与增加血管密度和血管生成相关[20]，血管生成在骨骼形成和愈合中起关键作用已得到充分证实[21-22]。在骨微环境中，血管中的CD31黏附蛋白将氧气、营养素、生长因子和骨祖细胞携带到骨微血管位点，促进骨骼生长[22]。既往有研究表明内皮细胞表达EPO受体，EPO或EPO受体的缺失导致血管生成的减少，提示EPO可能刺激骨髓内皮细胞生成[23]。此外，血管生成在EPO介导的骨形成过程中的作用尚未明确。EPO促进骨形成的机制已被报道，通过靶向的间充质基质和造血干细胞直接刺激成骨生成，EPO治疗人间充质干细胞和小鼠骨髓基质细胞均促进成骨细胞的分化[24]。成骨细胞中的构成型缺氧诱导因子信号传导导致其成骨细胞EPO的产生，随着血管形成的增加，其相关联的骨小梁量增加，尽管在骨稳态中成骨细胞缺氧诱导因子驱动EPO产生的作用仍在研究中[15]，此外，EPO可间接刺激造血干细胞分泌骨形态蛋白。 HOLSTEIN等[25]首次报道了短期EPO治疗在骨折修复中的有益作用，EPO在骨折愈合中的一般作用包括增加愈伤组织体积和矿物质含量、加速骨折桥接和增强生物力学性能。EPO被发现作用于其他细胞导致间接刺激成骨细胞，证明EPO激活造血干细胞中Jak-Stat信号通路，从而导致骨形成蛋白的产生。EPO在体外还直接激活间充质细胞形成成骨细胞，在体内形成骨。EPO首先激活破骨细胞生成，然后是由EPO直接诱导的成骨细胞生成，或由造血干细胞表达骨形成蛋白形成骨。并首次证明了EPO通过直接和间接途径调控骨形成，进一步证明了骨髓造血和造骨之间的精妙耦合[18]。基于血清EPO的生理浓度，人们可能认为低于100 U/L的浓度比体外诱导成骨反应的剂量更具有临床相关性[26]。EPO可能作用于破骨细胞前，调节破骨细胞向成骨细胞偶联的表达[27]。体外实验支持EPO在破骨细胞中的作用分化，EPO直接刺激前破骨细胞分化为成熟的破骨细胞[28]，破骨细胞分化导致EPO受体转录物水平相应减少，表明EPO受体表达限于前破骨细胞前而不是其成熟的破骨细胞后代。EPO还可以通过骨髓中造血干细胞刺激磷酸盐成纤维细胞生长因子23的表达，从而导致血清成纤维细胞生长因子23水平的升高和血磷的下降[29]。这可能是另一个机制，EPO水平的升高可以减少骨矿化，也表明造血干细胞表达功能性EPO受体。EPO是否通过EPO受体刺激破骨细胞、祖细胞、内皮细胞、间充质干细胞或造血干细胞，未来的研究通过体内试验使用条件基因靶向EPO受体及特定细胞亚群，需要骨髓微环境来确定EPO/EPO受体信号传导影响骨稳态或修复。 2.4  巨噬细胞与骨稳态  骨髓微环境内造血作用，红细胞生成和骨髓内稳态都是重要的过程，这都依赖于巨噬细胞。骨髓巨噬细胞可促进骨的稳定、造血作用和红细胞的生成，可使用不同的标记分类来识别[30](表1)。骨髓巨噬细胞的起源尚不明确，大多认为它们来源于单核造血；干细胞谱系，但组织中的巨噬细胞提示可能并不是来源于造血干细胞。JACOME-GALARZA等[31]证明体外实验中功能性骨髓巨噬细胞、树突状细胞和破骨细胞都是从一个共同的前体衍生出来的。但是，体外实验很难准确推断体内巨噬细胞的起源。尽管如此，巨噬细胞在骨髓微环境中发挥重要作用，它们的消耗导致各种缺陷，包括骨矿化，造血干细胞滞留和应激受损的红细胞生成[32]。 "

骨髓中的巨噬细胞群体是骨巨噬细胞或骨瘤，骨瘤被发现在骨内膜龛内，衬在骨表面内部，通常与成骨细胞密切接近，他们支持骨母细胞通过促进其分化和矿化行为来维持持续的骨稳态。造血干细胞的CD82和骨肿瘤的CD234之间相互作用，被发现对骨稳态维持至关重要，骨肿瘤表达F4/80+CD11b+CD115+CD68+CD169+ VCAM-1+，并且因缺乏Mac2和TRAP表达，可以与炎症性巨噬细胞和破骨细胞区分开来。 与典型巨噬细胞密切相关的是，破骨细胞是骨髓中多核定居的缺乏经典巨噬细胞标志物F4/80表达的巨噬细胞，并且被注意到其表达NF-κB受体激活剂。正如巨噬细胞依赖于巨噬细胞集落刺激因子，破骨细胞的发育也依赖于巨噬细胞集落刺激因子，它们在骨骼维持和骨吸收功能的动态平衡中起着关键作用[30]。另一种重要的骨髓巨噬细胞是中心巨噬细胞，它构成的基础是形成红细胞分化的成红细胞岛。成红细胞岛具有独特的结构，能支持红系祖细胞分化为网状细胞，并且已经在体内试验中证实可鉴定人类红细胞生成的每个位点。在骨髓中，血管和血管分布均匀，而不是聚集在血管或其他附近结构的部位。每个成红细胞岛都由一个中心巨噬细胞组成，通过5-30个不同分化状态的红系细胞环绕着一个环。中央巨噬细胞分泌刺激性细胞因子如胰岛素样生长因子1和骨形态蛋白4，为发育中的成红细胞提供稳定的生态位[33]。他们还提供有区别的以铁蛋白形式的铁结合成红细胞。 2.5  巨噬细胞和EPO  EPO受体在红细胞系外表达是一个有争议的话题[34]。然而越来越多的证据表明，至少在某些情况下，包括巨噬细胞在内的其他细胞类型可以对EPO起作用。SAKHNO等[35]发现粒细胞巨噬细胞刺激因子可诱导巨噬细胞产生EPO，EPO亦可调节巨噬细胞[36]。MELASHCHENKO等[11]研究的数据表明，EPO对巨噬细胞功能的影响很大程度上取决于这些细胞的基线激活状态。LUO等[37]发现LysM-Cre相关的EPO受体缺失削弱了腹膜巨噬细胞在体内清除凋亡细胞的能力，导致由于凋亡细胞的积累引起全身自身免疫激活频率增加。EPO也已被证明以诱导型一氧化氮合酶依赖性方式增加腹膜巨噬细胞的T细胞抑制能力[38]。在横纹肌溶解诱导的急性肾损伤的小鼠模型中，EPO提供了部分调节巨噬细胞反应起保护性作用，EPO增加了体内肾巨噬细胞M2标记物的表达，抑制炎性信号传导，并促进体外骨髓来源巨噬细胞的M2极化。这些作用与pJak2和pSTAT3信号传导相关[39]。EPO在脑胶质巨噬细胞群也有作用，已经证明EPO刺激脑小胶质细胞抑制炎症信号传导以促进M2表型并刺激吞噬作用，EPO也针对炎症、脑缺血和少突胶质细胞瘤具有促进神经保护作用[40-41]。最近的一项研究检测了Kupffer细胞中的EPO受体表达，Kupffer细胞为肝脏巨噬细胞，外源性给予EPO治疗可增加肝内Kupffer细胞增殖，它还提高了单核细胞趋化剂CCl2的表达去招募Ly6Chi单核细胞向肝脏转移，这是在对乙酰氨基酚诱导的损伤后发生的[42]。用EPO刺激这些巨噬细胞，以pJak2和PI3K依赖性方式增加促生长基因的表达和分泌，作者还展示了增加EPO刺激巨噬细胞、血管内皮细胞及血管生成的能力[43]。这些研究表明EPO可能促进巨噬细胞的抗炎症，促进修复和促血管生成功能，将他们转向更多类似M2样作用。未来的研究需确定EPO受体信号在骨髓巨噬细胞群中的功能作用及其在红细胞生成和(或)骨稳态中的潜在作用(表1)。 2.6  巨噬细胞和红细胞生成  红细胞生成是一个高度调控的过程，在这个过程中要确保造血干细胞正确分化为最终的红细胞。骨髓中的巨噬细胞通过提供信号诱导早期红细胞祖细胞的分化和增殖，在造血过程中发挥重要作用；随后向成红细胞阶段的分化伴随着所谓的成红细胞岛的形成，其中中心巨噬细胞提供进一步的线索来诱导成红细胞的分化、扩展和生成；最后，成红细胞挤出细胞核后被巨噬细胞吞噬，而网状细胞则被释放到血液循环中。在循环过程中，红细胞缓慢积累损伤，由脾巨噬细胞修复；最后经过循环120 d，衰老红细胞被脾和肝巨噬细胞从循环中清除。因此，巨噬细胞对红细胞的整个生命周期都很重要。最后，在一系列疾病中，巨噬细胞与发育和成熟的红细胞之间微妙的相互作用受到干扰。 红细胞生成在发育阶段，由巨噬细胞以多种方式调控[44]。首先，巨噬细胞将造血干细胞保留在造血龛中，生长因子和细胞因子包括白细胞介素3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子促进最早的原始红细胞祖细胞的增殖和分化。在肾源性EPO的作用下，这些缓慢增殖的红细胞祖细胞可分化为迅速分裂的集落形成的单位红细胞；巨噬细胞和成红细胞通过黏附分子形成成红细胞岛；中心巨噬细胞通过巨噬细胞和成红细胞上的各种黏附分子与多达30个成红细胞相互作用。在这些红细胞岛中，巨噬细胞促进成红细胞增殖、分化，并参与铁供应；最后，巨噬细胞吞噬并消化由成红细胞挤压出的细胞核，使其过渡到网状细胞阶段(表2)。 "

成红细胞和伴随的中心巨噬细胞之间的细胞相互作用对维持红细胞岛至关重要，这些相互作用已经被证明是相互依赖于红色系巨噬细胞蛋白或巨噬细胞幼红细胞黏附蛋白，细胞黏附分子4 -αvβ3整合素和血管细胞黏附分子1，晚期活化抗原4整合素α4β1。在它们发育的最后阶段，初生的网织红细胞经历了去核过程，并与网织红细胞密切相关使巨噬细胞能够有效清除由此产生的幽门螺杆菌，这种吞噬行为是由TAM家族成员受体酪氨酸激酶MerTK驱动的[45]。 巨噬细胞可直接向红系祖细胞供铁，亦可合成和分泌铁蛋白，以铁蛋白的形式为红细胞供铁[46]。人类成熟的红细胞在衰老并再次接触巨噬细胞之前的寿命为120 d，红细胞的吞噬作用是体内铁通量的主要来源，因为血红蛋白必须近似地回收利用，每个人体内有2 700亿个血红蛋白分子，每秒钟大约有200万个衰老的红细胞被循环利用。铁和亚铁血红素的传递途径可以促进红细胞的形成。转铁蛋白是铁的主要来源，它从纤溶蛋白转铁蛋白受体中释放出来，内化并将铁释放到酸性囊泡中。在成红细胞岛中发现的中心巨噬细胞可将铁运送到发育中的红细胞，并在巨噬细胞和成红细胞之间的间隙中观察到分泌铁蛋白。因为红细胞和巨噬细胞都表达质膜血红素转运蛋白Hrg1和Flvcr1，再由亚铁血红素转移到发育中的红细胞中。衰老的红细胞被网状内皮系统的巨噬细胞识别并内化降解。铁是由吞噬溶酶体中的血红蛋白以一种未知的机制释放出来，通过Nramp1导入细胞质，储存在铁蛋白中，或由转铁蛋白从细胞中输出。 巨噬细胞和红细胞之间的相互作用使红细胞形成、修复和清除。在地中海贫血或溶血性贫血中，机体不能总是应对所观察到的不良反应。调节巨噬细胞和发展成红细胞之间的相互作用已经被证明是有益的结果，这方面的一个例子是CHOW等[32]的研究，他们发现CD169+巨噬细胞的耗竭可以使真性红细胞增多症患者的红细胞生成正常化。因此，研究疾病中调节红细胞生成和吞噬的替代机制对减轻多种红细胞相关疾病的临床症状具有重要意义。巨噬细胞在调节红细胞稳态、控制成红细胞最终成熟成网状细胞和清除旧红细胞方面有2种主要作用[47]，体内红细胞岛巨噬细胞的减少可阻止成红细胞的生成，在骨髓清除或苯肼红血球中毒后，成红细胞岛巨噬细胞对促红细胞生成救援是必要的[32]。针对巨噬细胞的治疗可能对红细胞生成障碍性疾病的治疗有一定的益处。 "