The safety and application of induced pluripotent stem cells

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.026

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Induced pluripotent stem cell technology have solved the contradiction between the ethics and immune rejection, and this high-efficient and safe technique is becoming the mainstream of today’s research.
OBJECTIVE: To comprehensively review the safety and application of induced pluripotent stem cells.
METHODS: A computer-based online retrieval of PubMed and CNKI was performed to search relevant papers published from January 2006 to April 2016, with the key words of “induced pluripotent stem cell, reprogramming, clinical application, safety, transcription factor, disease mode” in English and Chinese, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: In recent years, research on induced pluripotent stem cells has attracted much attention from the scientific community and the medical community, and this technique has successfully gained induced pluripotent stem cells and overcome the problems of immunity and ethics. However, it is limited to the theoretical and laboratory research due to the inability to solve the safety, efficiency and re-differentiation mechanism of induced pluripotent stem cells. Therefore, we are faced with enormous difficulties and challenges, which involve all aspects of basic research, including how to safely and effectively induce the differentiation of induced pluripotent stem cells into the desired cell type and how to establish a suitable disease model as well as a high-throughput drug screening platform.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Multipotent Stem Cells, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Tian Sheng-nan, Wang Bo, Li Qi, Huang Yuan-hua, Ma Yan-lin. The safety and application of induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 815-820.

Figures/Tables 1

2.1 诱导多能干细胞的产生 2.1.1 诱导多能干细胞通过经典诱导途径获得诱导多能干细胞的经典诱导途径分为受体细胞的选择，诱导因子的导入，细胞增殖培养及目标细胞筛选等几步。首先分离培养已分化的细胞，理论上每一种细胞都可以被诱导为诱导多能干细胞[2]，但已被证实的可被重编程的细胞类型有皮肤成纤维细胞、羊水细胞[3]、胃表皮细胞、B淋巴细胞、血液细胞、肝脏细胞、神经干细胞、内皮细胞、骨髓细胞、角化细胞及子宫内膜干细胞等[4]。诱导过程中选择合适的诱导因子至关重要，Takahashi等[5]率先从24个候选基因中通过标记及基因转染等方法筛选了4个因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4(即OSKM体系)并诱导细胞逆分化程序[6]。Oct4参与多种基因机构调节，并具有维持细胞自我更新和多能性且不能被其他家族成员代替[7]；而Sox2、c-Myc和Klf4则可以分别被Soxl或Sox3，Klf2和Klf5，n-myc或l-Myc替代。c-Myc是公认的致癌基因，Saric等[8]仅采用Oct4、Sox2和Klf4也能实现小鼠胚胎成纤维细胞和人皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，Vodyanik和Yu等[9]报道在人的体细胞用Oct4和Sox2及Nanong和Lin28四个因子也可完成诱导，重编程的细胞表现胚胎干细胞的特点。选择适当的细胞，加入诱导因子后进行细胞的增殖培养并对ips克隆进行传代培养。然后进行目标细胞的筛选，有研究利用Oct4作为报告基因系统进行抗性筛选，并应用OSKM体系诱导诱导多能干细胞，可得到嵌合成年小鼠，并通过其繁殖得到诱导多能干细胞衍生的后代小鼠[10]。将诱导多能干细胞注入到4倍体囊胚中，得到全部由Oct4诱导多能干细胞发育而成的妊娠中晚期胚胎，从而以此来检验细胞的多能性。有实验组已应用形态学标准筛选诱导多能干细胞克隆的方法成功获得活胚胎[11-12]。也有研究者发现，形态学标准筛选比抗性药物筛选的方法效率提高5-10倍[13]。通过诱导多能干细胞形态特点进行筛选，不仅避免了使用抗药基因作为报告基因的问题，而且简化了诱导多能干细胞诱导方法。 2.1.2 诱导多能干细胞的全能性、永生性及基因组完整性将适当的诱导因子导入已分化的成体细胞，从而实现细胞核的重新编程，细胞经过培养后并进行相应的筛选，进而获得在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似的多能细胞。诱导多能干细胞具有自我更新能力，其是指通过对称分裂产生于母代细胞完全相同子代细胞的“无限”增殖能力，也可以称之为“永生性”；具有多向分化潜能，是指在特定的诱导条件下可分化为不同表型的成熟细胞。诱导多能干细胞具有完整的基因组，即其含有来源细胞的全部遗传信息。 2.2 诱导多能干细胞的应用研究 2.2.1 基于诱导多能干细胞技术的疾病模型构建由于多数疾病无法建立动物模型来研究，科学家更注重对于人类疾病特异性诱导多能干细胞的研究[14]。有科学家构建了一个诱导多能干细胞诱导分化的体系，在该体系中诱导多能干细胞和胚胎干细胞的分化能力一致，该体系可以应用到人心血管疾病再生医学模型上[15]。这种体系不仅是心血管系统的疾病模型，对代谢性疾病也有重大启发并展开了研究，如将患有1型糖尿病患者的皮肤成纤维细胞利用反转录病毒(Oct4，Sox2和KIf4)重编程为疾病特异性诱导多能干细胞[16]，他们将该诱导多能干细胞定向分化为β细胞，用于研究糖尿病的发生发展。基于诱导多能干细胞技术可建立特定的体外疾病模型：疾病模型可用来研究疾病的发生机制及病理过程，但人类的一些疾病无法找到合适的细胞或实验动物模型，而诱导多能干细胞技术恰可解决这一难题。不论在血液病、神经系统疾病领域，还是在眼科疾病、糖尿病、免疫系统疾病等学科，都已建立了疾病动物模型。目前建立的疾病模型有β-地中海贫血、镰刀形细胞病、肌萎缩侧索硬化症和脊髓性肌萎缩患者特异性诱导多能干细胞系[17]，帕金森病、亨廷顿病、唐氏综合征/21三体综合征(Down syndrome/trisomy 21)、色素性视网膜炎、糖尿病、系统性硬化病等多种遗传病患者的特异性诱导多能干细胞系[18]。疾病模型仍存在的问题：虽然科学家们对诱导多能干细胞疾病模型的应用期望很大，但在实际应用中还存在许多问题。人们对诱导多能干细胞的临床实验基本都是动物模型，很多报告都指出了小鼠疾病模型和真实人类疾病是有差异的，而且很多疾病并不是来源于单一的疾病特异性诱导多能干细胞系就能表达的，如一些在老年期发生的疾病，不单与遗传因素有关，还有可能与外界环境因素有关。此外，有些疾病为非细胞自主性疾病，故疾病的进程也受到细胞之间连接的影响。所以单凭简单的模拟细胞的遗传学变异，是很难反映疾病的真实体内环境，且在重编程过程中，可能会出现诱导多能干细胞克隆变异，如点突变和拷贝数的突变及某些内源性基因激活引起的表观遗传修饰[19-21]。诱导多能干细胞技术在疾病模型治疗中的应用：人诱导多能干细胞建立的疾病模型，为研究疾病的发病机制提供了有利的条件，为用诱导多能干细胞治疗复杂性疾病创造了可能性。目前建立的患者特异性疾病模型有范可尼贫血症[22]、肝病[23]、人1型糖尿病[24]、骨髓增生病[22]、家族性植物神经功能障碍症等疾病模型[25]。Hanna等[26]建立了用自体皮肤诱导产生的诱导多能干细胞治疗镰刀形红细胞贫血症的小鼠模型，该实验中用小鼠尖端成纤维细胞侵染OCT2、SOX2、KLF4及loxp C-Myc病毒进行诱导多能干细胞。美国哈佛大学干细胞研究所Dimos及Eggan等[27]用取自肌萎缩侧索硬化症患者的皮肤成纤维细胞，诱导产生特异性诱导多能干细胞，可分化为运动神经元。研究发现用OCT4、SOX2、NANOG和Lin28感染脊髓性肌萎缩Ⅰ型患儿的皮肤成纤维细胞，该细胞在培养中可保持疾病基因型，并可生成运动神经元[28]。作者所在实验室也利用产前诊断收集的地中海贫血患者特异性的羊水、尿液等为细胞来源，幼儿包皮为饲养层细胞成功建立了240多株胚胎干细胞和诱导多能干细胞系。随着研究的不断深入，利用干细胞定向分化建立含有不同血型的红细胞血库成为可能，所分化的细胞来自于患者本身，无排斥反应，不含病原体，也避免了输血相关传染病，且这类细胞寿命长，利于长期保存，为地中海贫血患者的治疗带来了新的契机。此外，作者所在课题组人员利用CRISPR/Cas9基因组修复系统来修复已建立地中海贫血患者源性的诱导多能干细胞基因组序列，可望获得有治疗价值的诱导多能干细胞系，再将细胞系体外培养相应的组织或器官，再将其移植到患者体内，诱导多能干细胞技术解决了很多动物模型不能解决的问题。 2.2.2 组织细胞工程与细胞治疗诱导多能干细胞可在适当刺激下分化成含各个胚层来源的拟胚体，并可诱导为疾病相关的功能细胞，如胰岛素分泌细胞、造血细胞、神经细胞等。在此方面，Hanna等[29]通过重编患有镰刀型贫血的小鼠成纤维细胞为诱导多能干细胞，将体外经过基因修饰过的具有正常造血功能的细胞移植回体内，从而减轻贫血症状。而应用在皮肤乳头或真皮乳头细胞上还可使毛发再生。同时诱导多能干细胞对构建神经发育性和神经退行性疾病的体外模型具有重要意义，比如忧郁狂躁型的抑郁症，就可通过诱导多能干细胞来参与转录钙信号，替代前脑神经元来治疗[30]。科学家还通过实验还证明了诱导性全能干细胞还可诱导出听觉神经元来替代原有的神经元，从而修复听力损伤[31]。不仅如此，诱导多能干细胞移植能够明显改善心肌缺血所致梗死区心肌细胞的超微结构损伤程度，并且可以形成新的心肌肌丝[32]。Bilousova等[33]将诱导多能干细胞在体内和体外形成钙化结构，并且在小鼠体内实验表明了低葡萄糖含量对小鼠诱导多能干细胞的骨向分化有促进作用，这使诱导多能干细胞在骨科学也有了应用价值[34]。Werning等[35]同样将由小鼠成纤维细胞诱导的诱导多能干细胞培养分化为神经元前体细胞，将其移植到帕金森症模型小鼠脑中，有效改善了小鼠帕金森病情。Liu等[36]用髓核基质组织诱导诱导多能干细胞向脊索细胞分化，以用于治疗椎间盘退化。鼠类被设计工程化表达人类唐氏综合症DCR-1基因，显示降低支持人类肿瘤发生转移的能力，因其具有减少血管生成的能力。唐氏综合症和正常人诱导多能干细胞在免疫缺陷小鼠形成畸胎瘤的比较中揭示，唐氏综合症来源的诱导多能干细胞可降低微血管密度。因此提供证据表明，唐氏综合症基因降低肿瘤发病率的原因可能是因为降低了维持血管生成的能力。此外，随着3D打印技术的广泛开展，再造器官的理想来源是用干细胞培养的人体组织，已有报道利用3D打印技术为肿瘤患者重塑面部，Faulkner-Jones等[37]将此技术拓展到人胚胎干细胞范围，当诱导多能干细胞能够适应3D打印技术时，这将使再生医学及组织工程学迈上一个新的台阶。再生医学是医学的发展方向，可现在还基本没有在临床应用，原因很多，致癌率高、诱导效率低都是重要因素，其他比如很多疾病的发病机制与宿主所处的环境、心理因素、体质敏感性有关，并非简单的用细胞替代就可治愈的，所以在更加深入的研究诱导多能干细胞同时也要重视对疾病机制的探索。 2.2.3 药物筛选平台现今药物的药代学、毒理学及药效学等研究几乎都在动物细胞系进行，然而异种属之间存在不完全一致的药物治疗反应；此外，临床实际药物应用中，由于个体的差异，不同的个体对药物的反应与疗效不完全相同。体外诱导多能干细胞系的建立为药物筛选平台的建立创造条件，从而实现了以人类来源细胞作为药物筛选试验的对象，可判断药物对某种疾病的疗效。Maechr等[38]对由诱导多能干细胞及胚胎干细胞分化而来的心肌细胞分别应用了不同的抗心律失常药物，来观察心肌细胞的收缩频率及强度，结果发现两者无明显差异，与临床应用效果一致；Lippmann等[39]通过将诱导多能干细胞转化为血脑屏障的内皮细胞，用于药物神经毒性检测及神经系统疾病药物的高通量筛选。显然，疾病相关的诱导多能干细胞模型或胚胎干细胞模型的建立，评价了药物的安全性和疗效，实现了药物的体外快速筛选。 2.3 诱导多能干细胞的安全性问题及研究 2.3.1 受体细胞及饲养层细胞对诱导多能干细胞全能性和分化后细胞功能的影响诱导多能干细胞技术主要是从人体的遗传学方面进行模拟，故难以对以环境因素刺激作为主导作用的疾病进行构建理想的体外细胞模型并进行细胞治疗。诱导多能干细胞移植到体内后的再分化机制不明确，有报道诱导多能干细胞自体移植具有免疫原性[40]，目前利用诱导多能干细胞技术可在体外将细胞诱导分化为所需的靶细胞，但将分化后的细胞移植入体内后其如何分化及分化机制仍知之甚少，故仍需进一步研究诱导多能干细胞胞定向分化机制。此外，目前无具体的检测系统来评价移植后功能细胞的效率及安全性。最初诱导多能干细胞体外培养所用的饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，其需要添加必要的生长因子或除去抑制因子来实现细胞自我更新，但值得注意的是动物源性血清的安全性问题，包括可能存在具免疫活性物质、传播动物病毒及感染蛋白质，此外可能有某些难以控制的成分，作者所在实验室对收集尿液细胞经诱导去分化后，使用无血清完全培养基，避免了以上种种安全隐患，不仅可用于诱导多能干细胞的诱导和维持，也可支持诱导多能干细胞的自我更新及提供细胞多能性所需要的生长因子及代谢物。 2.3.2 细胞基因结构变异虽然诱导多能干细胞技术增加了干细胞的来源，但也增加了细胞变异的风险，从而影响诱导多能干细胞的安全性。现今对诱导多能干细胞技术机制的研究逐渐从转录因子相关的转录组水平、蛋白质组水平转移到表观遗传学方面，经典方法诱导诱导多能干细胞产生的变异主要源自于染色体异常、基因拷贝数变异、点突变等几个方面[41]。有研究表明，胚胎干细胞特异性染色质重构复合体BAF中的Brg1和BAF155，能够协同Oct4、Sox2、Klf4三个因子对成纤维细胞重编程，这些染色质重构不但有利于Oct4对其下游基因的调控，另一方面也增强了了Oct4蛋白结合Sall4、Tcf3和Dppa4基因启动子区的能力。在诱导过程中也会出现一些变异，有些体细胞会在诱导过程中受损，诱导本身也会导致拷贝变异增加[42]，同样培养的时间越长变异的积累也会越多[43]。此外，不同检测方法对诱导多能干细胞遗传稳定性的检测结果也不相同，现代分子遗传学分析技术比传统细胞遗传学分析技术发现了更多诱导多能干细胞的遗传异常。 2.3.3 诱导因子的致瘤性与优化诱导产生诱导多能干细胞因子的潜在致癌性，在一定程度上增加了人们对诱导多能干细胞技术临床应用安全性的顾虑，但也激发了科研人员对诱导因子的深入研究。有报道称，超过40%在基因突变水平表现变异的基因和肿瘤有关[44]。研究发现，诱导多能干细胞技术中用到的6个诱导因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog)，除Lin28 还未发现与肿瘤发生有关外，其余5个都是癌基因，其过表达常与肿瘤有关[45]。C-Myc是一种原癌基因[46]，可在多种肿瘤中可检测到，可促进细胞增殖和转化[47]。Nakagawa等[48]对Oct4、Sox2和Klf4的组合研究发现，缺少c-Myc会导致ips细胞诱导障碍，它的致瘤性能抑制重编程，也会增加诱导多能干细胞传代期间的细胞转换频率，当Myc转基因在诱导多能干细胞中持续作用时，也能增加肿瘤形成的风险性。Oct3/4可诱导细胞向类胚胎干细胞变化而远离肿瘤细胞，且其强制表达可维持胚胎干细胞的形态。常规方法诱导诱导多能干细胞使其重新编程成为类似胚胎干细胞功能的细胞，是需要综合多种病毒传导因子共同参与的，而Okita等[49]发现每一个诱导多能干细胞克隆包含3-6个反转录病毒集合，且每一个克隆都有超过20个反转录病毒结合位点，每一个位点都有可能增加癌变的风险。近些年来不少科学家运用降低外源基因随机整合的实验方法提高安全性，例如2014年有实验组应用成熟双链RNA(miRNAs)将小鼠和人类细胞重编程为诱导多能干细胞[50]。中国吴森教授将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、in28、Nr5a2、microRNA302/367和正负筛选标记基因构建到一个非整合型质粒上，当获取诱导多能干细胞后，通过筛选获得无非整合型质粒的细胞，从而确保无外源基因插入[51]。"

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