2.1 C-kit+心脏干细胞的发现 2003年Beltrami等[2]首次在成年大鼠心脏内发现并分离出C-kit+/Lin-心脏干细胞。这类细胞具有干细胞的特性：自我更新、克隆和多能分化的能力，体外可以诱导分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞，体内移植使受损心脏收缩和舒张功能明显改善。实验组20只大鼠中有19只梗死区内发现被标记的再生心肌，这些细胞能够表达缝隙连接蛋白43，但是这些新生心肌样细胞肌小节内相关蛋白的量要少于成熟心肌细胞，表明移植细胞在体内分化的心肌样细胞属于未成熟细胞；实验组大鼠心脏梗死区的毛细血管和细动脉密度均增加，并且在血管管壁内观察到了被标记细胞，说明C-kit+心脏干细胞在体内可以分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞[3]。随后心脏干细胞在多种哺乳动物心脏中均有发现，包括大鼠[2]、小鼠[4]、猪[5]、犬[6]、人类[7]。2007年Hsieh采用绿色荧光蛋白标记心肌细胞证明了心脏干细胞的存在，正常心脏中干细胞或者前体细胞并不参与心肌细胞的维持，只有心肌受损时干细胞或者前体细胞才会动员分化为心肌细胞修复受损心肌[8]。目前已经能够从人体心脏组织中有效地分离出C-kit+细胞群并在体外扩增至足够数量。但是值得注意的是，近期有研究提示并不是所有的C-kit+细胞都为心脏干细胞，部分可能是肥大细胞，原因是它们表达类胰蛋白酶而不表达Isl1和Nkx2.5[9]。因此，有关心脏干细胞的具体生物学标记物及其与相应的生物学行为之间的关系仍需进一步研究。 2.2 C-kit+心脏干细胞的起源 有关C-kit+心脏干细胞的起源仍然存在争议。目前主要有两种观点占主导地位：来自胚胎期的心脏祖细胞和来源于骨髓。大家知道C-kit+/lin-心脏干细胞CD34、CD45表达均为阴性，说明其并不是起源于造血系统[2]。2011年发现C-kit+心脏干细胞在心脏中形成特殊的干细胞生态微环境，即包含C-kit+心脏干细胞和具有谱系分化倾向如C-kit和心肌转录调节因子(GATA4、MEF2C或Ets1)双阳性细胞的细胞群，这些细胞与周围的心肌细胞和成纤维细胞通过缝隙连接和黏附作用相互联系，提示C-kit+心脏干细胞可能起源于心脏本身[10]。2012年Martins利用绿色荧光蛋白标记C-kit+心脏干细胞并用双光子显微镜直接原位观察随着时间变化绿色荧光蛋白阳性心脏干细胞群在转基因胚胎体中的空间变化，胚胎体发育6.5 d时C-kit+细胞在中胚层发现，8.0 d时发现心管中的C-kit+细胞逐渐向尖端迁移从而证明C-kit+心脏干细胞的心脏起源[11]。Fazel等[12]2006年发现C-kit+心脏干细胞起源于骨髓，认为骨髓是体内各器官原始细胞的主要来源，这些细胞从骨髓微环境中出来，随着血液循环进而定居在心脏和其他器官，然而，是否是骨髓衍生的C-kit+心脏干细胞最终获得内源性心脏干细胞的角色并促进心肌的维持和再生并不清楚。 2.3 C-kit+心脏干细胞的分布 关于C-kit+心脏干细胞是否存在分布差异性仍然存在争论。2012年研究发现心脏中C-kit+心脏干细胞的数量与其分布部位相关，心房和心尖处含量较高[13]。Itzhaki-Alfia试验中还发现在女性心脏组织块中C-kit+心脏干细胞含量可能稍高一点儿[13]。急性心力衰竭患者心脏中C-kit+干细胞含量较没有急性心力衰竭病史患者增加[14]。Mishra等[15]用来自于3-14岁儿童的心脏组织块培养出的C-kit+心脏干细胞含量波动在1%-1.9%(除了个别儿童的含量在11.7%-24.1%)，提示儿童的心脏组织可能含有更高量的C-kit+心脏干细胞，此结果与 Mishra等的研究结果相一致，提示C-kit+心脏干细胞的含量与年龄可能存在相关性。然而，Matuszczak等[16]研究发现来自成人不同部位的心脏组织块培养C-kit+心脏干细胞含量并没有明显的不同，均不足1%(0.7%-0.9%)，并且C-kit+心脏干细胞含量与性别、心血管疾病病史也没有明显相关性，与上述试验不一致，有关C-kit+心脏干细胞的分布还有待于进一步研究。 2.4 C-kit+心脏干细胞的特性 目前为止，研究特性最确切、最深的就是C-kit+/lin-细胞亚群。2003年Beltrami等[2]首次发现具有心脏干细胞特性的C-kit+/lin-细胞亚群。依据干细胞表面标志物C-kit阳性而白细胞表面标志物CD45和内皮细胞表面标志物CD34阴性，把C-kit+/lin-细胞群定义为定居在心脏的独立的干/祖细胞群。这些心脏细胞表现出很高的核浆比，并且它们的数量很少，10 000个心脏细胞中仅有1个具有这种特点的细胞[2]。它们经常成簇存在，大部分含有心脏心肌细胞形成早期阶段的前体细胞，这些细胞表达Gata4、Nkx2.5、Mef2转录因子，但是肌原纤维蛋白含量却很低。当分离并培养心脏干细胞时发现这些细胞具有广泛的自我更新和克隆能力，能够连续增殖19个月而不出现增长停止或衰老。体外进行诱导和分化后，这些细胞能够向心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞分化，但是诱导分化成的这些细胞在形态和结构上并不成熟。2013年Ellison等[17]研究发现C-kit+心脏干细胞确实能够弥补心脏损伤后丢失的心肌细胞。尽管在试验中并没有除外其他心脏干细胞或者本身心肌细胞有丝分裂参与心脏修复，但是该实验首次在体内证明C-kit+心脏干细胞能够直接分化成心肌细胞促进心肌细胞的再生。目前发现C-kit+心脏干细胞主要包括两种细胞亚群：肌源性(mCSC)和血管源性(vCSC)。前者主要表达C-kit，定居于成熟心肌细胞之间的微环境中，主要分化为心肌细胞，后者表达C-kit和内皮细胞标志物(kinase insert domain-containing receptor，KDR)，存储于血管壁的血管微环境中，主要分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞[18]。总的来说，C-kit+/lin-细胞群除了真正的心脏干细胞外可能包含几种具有谱系分化特征的细胞群。这些发现提示大家需要更严格的鉴定表面标志物用于C-kit+/lin-细胞群的定性，从而更好地应用于基础和临床研究。 2.5 C-kit+心肌干细胞的研究进展 Zakharova等[19]将C-kit+心脏干细胞移植到心肌梗死后心衰小鼠心脏模型 21 d后观察发现实验组小鼠毛细血管密度增加、间质胶原蛋白纤维含量减少、心肌梗死面积缩小、心肌细胞代偿性肥大减轻、心功能得到明显改善。Tang等[20]研究发现绿色荧光蛋白阳性心脏干细胞移植5周后心脏干细胞处理组梗死区存活心肌增多、非梗死区纤维化减少、射血分数明显提高。虽然结构和功能得到改善，绿色荧光蛋白阳性的供体细胞却很少在受体心脏中观察到，并且这些表达心肌细胞表面标志物的细胞并没有成熟心肌细胞典型的形态和肌节样结构。进一步在猪模型上将单克隆心脏干细胞注射到梗死相关血管[21]，1个月后观察发现心脏干细胞处理组左室功能明显改善。2011年有关外源性心脏干细胞移植治疗心肌梗死后心功能不全患者的Ⅰ期临床试验取得了积极结果。SCIPIO是有关C-kit+心脏干细胞移植治疗缺血性心功能不全的随机的、开放性临床试验[22-23]。入选标准是射血分数< 40%接受冠状动脉搭桥手术的患者。C-kit+/lin-心脏干细胞来自于冠状动脉搭桥手术中获取的心脏右心耳部分并在体外进行扩增。冠状动脉搭桥术后4个月时，20例患者接受106单克隆心脏干细胞冠脉内注射，13例对照组患者不接受任何处理。4个月后发现心脏干细胞处理组左室射血功能有明显的增加[从(27.5± 1.2)%到(35.1±2.4)%]，而对照组并没有明显变化；1年时，左室射血分数从(27.5±1.2)%增加到(41.2± 4.5)%。MRI检查心肌梗死面积明显缩小，4个月时(-6.9±1.5) g [-22.7%]，1年时(-9.8±3.5) g[-30.2%]。心脏干细胞处理组心功能的改善伴随着纽约心功能分级的提高和生活质量的明显改善。重要的是，试验中并没有观察到负面影响。SCIPIO试验的结果暗示冠脉内注射单克隆C-kit+心脏干细胞不仅安全而且对缺血性心脏病患者的心功能有明显意义的改善。心脏干细胞移植产生的临床效果的机制仍不清楚，考虑到动物实验中观察到的心脏干细胞低生存率和驻留率，推测可能是通过旁分泌作用触发了内源性新生作用。尽管SCIPIO临床试验获得了初步的积极结果，但是对C-kit+心脏干细胞重建心肌梗死后心肌的能力仍然有异议。不管是在体外还是在体内，C-kit+心脏干细胞向心肌细胞分化的能力都受到了挑战[24]。Tang等[20]2010年试验发现通过外源性的C-kit+心脏干细胞移植治疗梗死后损伤心肌的直接心肌再生作用是很微弱的，移植后左室结构和心功能的改善主要是由于这些移植细胞旁分泌产生的各种细胞因子的作用，这些细胞因子能够激活内源性的C-kit+心脏干细胞从而改善左室结构和改善心功能，并且这种作用在移植细胞消失后仍能够发挥作用。 2.6 C-kit+心脏干细胞治疗面临的挑战 2.6.1 移植C-kit+心脏干细胞的生存率和驻留率 许多研究报道不同来源干细胞都面临生存能力低下的问题，只有少数细胞能够持续到移植后几周[25]。C-kit+心脏干细胞治疗面临的问题之一就是注射细胞的低生存率和驻留率[26]。一般认为，心肌梗死后炎性细胞和细胞因子激活、细胞之间相互作用的细胞基质和支持细胞缺失、氧供和营养物质贫乏，所有这些都促进移植细胞的凋亡。研究发现心肌内注射心脏干细胞5 min后仅剩余43%心脏干细胞，考虑可能跟细胞流失有关，在随后的24 h内剩余75%的细胞也丢失，注射后第7天仅发现7.6%的剩余细胞，第35天时仅有2.8%，如果进行冠脉内注射5 min时60%的细胞丢失，随后24 h内85%的细胞随之丢失，仅3.5%和2.4%被发现于第7天和第35天[27]。除了心脏以外，冠脉内注射的供体细胞也被发现于肺脏和肾脏，但是他们在肝脏和脾脏中也是缺失的。尽管冠脉内注射细胞流失较心肌内注射稍快，但是第35天时细胞残存数量两组相似，接近1%。这些定量研究清楚的证明不管是哪种注射方法，心脏干细胞移植均遭受低存活率或驻留率的影响。 众位学者试着用不同的方法提高细胞存活率和驻留率，例如Mohsin等[28]用Pim-1基因修饰心脏干细胞以促进心脏干细胞生存、移植和修复能力，分析显示用荧光素酶标记的心脏干细胞实验组可以持续到第8周，而对照组仅仅持续到第1周，并且心脏组织中毛细血管密度增加、梗死面积缩小，到20周时实验组血流动力学明显改善。后续报道显示实验组增殖能力的增加是临时的，暗示Pim-1过表达不会引起无限增殖或者致瘤型转变。因此通过基因修饰心脏干细胞提高生存率和驻留率或许能够克服这一难题。药物激活内源性细胞保护作用是另一种途径。近期Cai等[29]采用原卟啉钴(COPP)激活内源性血红素氧合酶1提高生存率。Zafir等[30]研究一种糖基化修饰蛋白，这种蛋白能够在缺氧再灌注损伤中保护心脏干细胞。使用药物抑制剂抑制蛋白质0表达可以使心脏干细胞对氧化损伤敏感性增加，促进蛋白质0表达能够增加其耐受力。因此，移植前预处理心脏干细胞或者和其他因子共培养或许能够很好地改善其生存能力[31-34]。 2.6.2 C-kit+心脏干细胞的直接分化 尽管已经发现许多种类型的干细胞具有新生或者细胞保护作用，但是目前干细胞治疗的机制仍然以旁分泌作用而不是直接分化作用[35]。许多独立研究均发现移植的C-kit+心脏干细胞并不能够分化为成熟的心肌细胞[20，26]。移植后35 d时几乎所有心脏干细胞衍生的细胞都很小并且没有横纹结构，原因并不明确，可能跟体外培养时细胞性质的改变或者固有细胞与细胞之间的联系缺失有关。因此，如何使心脏干细胞直接分化为心肌细胞是C-kit+心脏干细胞治疗面临的又一大挑战。目前许多学者致力于通过引入或者重组一些基因如GATA4、NKX-2.5、MEF2C、TBX5和BAF60C改善C-kit+心脏干细胞的分化潜能。研究发现心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子能够促进C-kit+心脏干细胞增殖分化，修复受损心肌[36]。类胰岛素生长因子1/肝细胞生长因子在体外能够激活C-kit+心脏干细胞并促进其向心肌细胞分化，将其注射到猪缺血再灌注心脏，可原位激活C-kit+心脏干细胞并促进其增殖分化，修复梗死心肌组织[37]。Zhang等[38]提出了心脏鸡尾酒学说，即包括转化生长因子β1、骨形态发生蛋白4、激活素受体A、视黄酸、类胰岛素生长因子1、成纤维细胞生长因子2、α-凝血酶和白细胞介素6在内的各种细胞因子能够促进干细胞向心脏分化，改善心功能。因此，通过引入各种细胞因子促进C-kit+心脏干细胞向心肌细胞分化或许是一种可行的策略。"