2.1 概述  肺移植可分为同种异体肺移植、同种自体肺移植及异种肺移植等，目前以同种异体肺移植动物实验多见且对临床最有意义。同种异体肺移植是指把双侧有严重疾病的肺切除一侧或双侧，移植上因其他原因死亡者的健康肺，是现在治疗终末期病变(指双侧肺都有严重的，目前内外科方法均无法治愈的病变)的最后惟一有效的方法[2]。现在有心肺联合移植(HLT)、整块双侧肺移植(DLT)、双侧单肺序贯式肺移植(BLT)、单肺移植(SLT)、肺叶或缩小体积的肺移植、肺再移植6种形式[2]。目前肺移植动物实验以单肺移植为主。 2.2 发展简史 肺移植实验的历史可以追溯到20世纪40年代[2]，最初是在动物身上进行了初步的探索。1946年俄罗斯著名生理学家里梅沃夫行狗肺叶移植实验并最久存活了10 d，开创了肺移植动物实验的先河[3]。1950年5月美国Buffalo大学AndreA Juvenell等首先进行了犬的原位右肺移植并获得成功[4]。1950年法国Metras以及1954年美国Hardin和Rittle进行了犬同种异体肺移植，证实了肺移植技术的可行性[4]。1982年Marck和Wildevuur[5]首先阐述了大鼠左肺原位移植模型的手术操作方法[6]。随后，人们开始各种动物的肺移植实验研究，阐述了肺移植相关理论及完善了肺移植实验技术方法，为临床肺移植的研究和实施打下坚实的基础。 2.3 肺损伤及排斥反应 2.3.1 肺缺血-再灌注损伤 肺移植、体外循环手术，肺缺血再灌注后，肺缺血引起的肺损伤没有减轻，反而加重的现象称为肺缺血再灌注损伤[7]。肺缺血再灌注损伤可导致肺移植后发生原发性移植肺功能障碍，主要表现为肺动脉压升高、肺出血、肺水肿和急性呼吸功能衰竭，发生机制与活性氧产生增多、细胞内钙超载、中性粒细胞活化和高能磷酸化合物生成障碍等因素有关[8-9]。动物实验和临床研究显示肺移植肺缺血再灌注损伤表现为双相模式，肺缺血再灌注损伤的发生早期(灌注后24 h内)与供体有关，晚期则主要取决于受体情况，其病理生理贯穿于供肺的切取、保存、再灌注及术后管理的整个过程[10-11]。Xu等[12]用新西兰大白兔肺移植实验得出LPDG液中增加乌司他丁能够进一步提高移植肺的功能，其归因于乌司他丁对肺缺血再灌注损伤具有多重防护效果。在哺乳动物中，水通道蛋白是一种疏水性的膜蛋白，起着跨细胞和跨膜转运水的作用[13]，Zhao等[14]在Wistar鼠(Wistar研究所培育的白鼠株)肺移植模型中发现了水通道蛋白1、水通道蛋白3在移植肺组织中的高表达，并可能在肺缺血再灌注损伤导致的肺水肿中扮演重要角色。Xu等[15]在纯种狗左单肺移植模型中发现依达拉奉药物可以减轻肺缺血再灌注损伤，可能与抑制氧化应激及白细胞外渗的作用有关。Norberto等[16]用SD大鼠左肺移植模型研究发现雌二醇可以加重肺缺血再灌注损伤，机制可能与雌二醇增加肺血管平滑肌松弛度，使血流量加大导致肺再灌注损伤。 2.3.2 肺免疫排斥反应 肺移植后免疫排斥反应可以分为急性免疫排斥反应和慢性免疫排斥反应。急性免疫排斥反应决定早期移植物的失功，是肺移植的主要障碍[17]。免疫排斥反应是一个由受者识别供者细胞表面的组织相容性抗原引发的复杂免疫反应，活化的T淋巴细胞在器官移植免疫反应中起关键性作用[18-17]，其凋亡或无能诱导机体免疫耐受或无反应性，在机体免疫调节和免疫治疗中发挥着重要的意义[19]。在动物肺移植模型中发现CD8+ T细胞在移植物的浸润占主导地位，远超过CD4+ T细胞[20]，Naohisa等[21]用小鼠左单肺移植模型发现早期反应蛋白1的表达减少，可以有效防止急性肺免疫排斥反应。机制可能为反应蛋白1可以调节炎性细胞及转录水平，进而影响CD8+ T细胞的活化。Hisashi等[22]用小鼠肺移植模型发现将携带编码人类白细胞介素10基因的脂质体注入供体的支气管内，移植后减轻了肺的急性炎症和免疫排斥反应，机制可能与促使炎性细胞因子基因水平降低，减少其表达有关。 2.4 动物模型的建立 2.4.1  动物选择 除需要监测呼吸、血流动力学的实验或某些临床应用前的验证性试验必须使用猪、犬等大型动物外，其他实验大部分选用的是大鼠或小鼠[23]。鼠模型缺点是其解剖生理和形态结构与人相差甚远，操作难度大，研究的意义受到了限制。目前世界上各个实验室用于肺移植实验的动物主要有猪、犬、兔以及大鼠等，而采用犬作为肺移植实验动物最为常见[24]。猪作为一种食用家畜，其解剖和生理与人类相似，实验数量慢慢超过犬，因而正在成为大动物实验的首选[25]。 2.4.2 麻醉药物及途径 目前常用的药物有戊巴比妥钠、水合氯醛、氯胺酮、乌拉坦等。小型动物如鼠的给药途径主要为腹腔内注射，大型动物如猪、犬主要以静脉给药。鼠常用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)[26]，10 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg及注射水合氯醛[27-28]。犬、猪以戊巴比妥钠(30mg/kg)多见[29]。 2.4.3 常用模型 鼠单肺原位移植模型的建立[26]：①供体手术：用 30 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，取仰卧位，颈部行气管切开，接小动物呼吸机。取腹部正中切口，从下腔静脉注射肝素(300 U/kg)后，剪开膈肌，经右侧胸壁行半“U”形切口直至胸锁关节，切除胸腺，结扎左、右上腔静脉。经下腔静脉用4 ℃10 U/mL肝素化林格氏液(50 mL/kg)进行低压(1.955 kPa)灌注。剪开左心耳放出灌洗液，直至肺组织颜色变得完全苍白，流出的灌洗液清亮后，离断左下肺韧带，游离左肺门，于近心端用5-0丝线分别结扎左肺动、静脉后，在远心端离断并保留结扎线。在吸气相肺膨胀状态下用微血管夹夹闭左主支气管，在近心端离断。置4 ℃肝素化林格氏液中保存待用。分别将左肺动、静脉及左主支气管从自制套管中穿出并向尾端翻转，用5-0丝线分别结扎固定，完成供体准备。②受体手术：麻醉方法同供体。大鼠取右侧卧位，经左侧第5肋间切口入胸，离断左下肺韧带，牵左肺至胸外并固定，解剖游离肺门后，用微血管夹在近心端分别钳夹肺动脉、肺静脉和支气管，尽量在远端剪断。将供肺植入胸腔，依次吻合肺静脉、肺动脉、支气管，分别以5-0丝线和3-0丝线缝扎固定。首先开放支气管使肺复张后，再依次开放肺静脉、肺动脉。仔细止血、放置胸腔引流管后关胸。大鼠苏醒后拔除胸腔引流管，逐步脱离呼吸机。 兔原位肺移植模型[30]：①供体手术：选取左侧第5肋间切口。10倍显微镜下锐性切断肺下韧带，剪开纵隔胸膜及心包。充分解剖及游离支气管、血管。经下腔静脉近心端向右心房插入灌注管，4 ℃复方氯化钠液顺行灌注，剪开胸主(腔)动脉近心端放血。灌注至肺呈灰白色(100 mL/kg，时间8-10 min)、胸主动脉流出清亮液体；心耳钳夹闭肺静脉汇入处约1/3左心房壁，插入灌注管，自左房-肺静脉逆行灌注(50 mL/kg，时间约5 min)。灌注过程中继续机械通气。半膨胀状态夹闭左主支气管并切断，环绕左肺静脉入口处切断心房壁。移除供肺并放入4 ℃乳酸钠林格注射液中保存。②受体手术：切除受体左肺，将供肺心房壁修剪成心房袖，以冰盐水纱布包裹后放入塑料袋，置入受体左侧胸腔。修剪供肺和受体支气管断端长度以便吻合。连续缝合支气管；连续内翻缝合心房袖，做供肺和受体的心房袖吻合。间断缝合肺动脉。开放支气管，呼吸机潮气量逐渐增加到15 mL/kg。再灌注120 min留取标本后，剪开肺上、下静脉均有持续通畅血流则模型判定为成功。 犬/猪原位左肺移植[23]：犬/猪原位左肺移植的建模方法与人肺移植相似。供者麻醉、经口气管插管后，胸骨正中切口进胸，打开心包，游离气管及上、下腔静脉，并用纱带环绕。在紧邻动脉瓣远端的主肺动脉上用5-0聚丙烯缝线留置荷包缝合，通过静脉注射肝素(300 U/kg)。将1根导管(依动物大小用20-F或21-F管)插入肺动脉，收紧荷包缝线并固定。扎紧上、下腔静脉上的纱带，阻断心脏流人道，横跨钳夹闭升主动脉，切取左心耳，采用低温灌洗液(50-60 mL/kg，2.94-3.92 kPa压力)灌洗供肺。灌洗全程持续机械通气，夹闭气管前将气道压保持于1.47 kPa压力，使供肺处于充气状态。整块摘取心肺，4-8 ℃低温保存。植入前修剪供肺，在肺静脉周围保留足够多的心房袖和支气管、肺动脉残端。受者左第4肋间开胸，左全肺切取，保留尽可能长的血管与支气管残端。将后台修剪好的供肺放入胸腔，首先吻合支气管，用4-0聚丙烯缝线连续缝合后壁，间断缝合前壁；用6-0聚丙烯缝线连续缝合肺动脉前后壁，相遇前中止，心房吻合采用外翻水平褥式缝合，同样相遇前中止。移植肺恢复通气，逐步放开肺动脉夹，排出气泡后打紧吻合线，左房吻合口处理方法同前。恢复双肺通气，呼气末正压(PEEP)为0.49 kPa，调整呼吸频率，使动脉血CO2分压介于35-40 mm Hg (4.67-5.33 kPa)。 犬双肺序贯性肺移植[31]： 供体切取：供体犬仰卧位，肌注氯胺酮(8 mg/kg)诱导、气管插管静脉复合麻醉。呼吸机维持呼吸，潮气量为10 mL/kg，呼吸频率为12次/min，给氧吸入。备皮，消毒，铺巾后，取双侧第4肋间横断胸骨切口入胸。用撑开器暴露胸内结构，切除胸腺，垂直向下剪开心包至膈。解剖纵膈内结构，分别游离主动脉、气管、和上下腔静脉，并依次套上阻断带。用阻断带阻断左肺门5 min行缺血预处理，随即开放15 min，然后在阻断循环前先行全身肝素化(3 mg/kg)。阻断上下腔静脉、主动脉、肺动脉。主肺动脉内注入前列腺素E1 1 000 μg[32]，主肺动脉根部注入4 ℃ LPD1 500 mL (100 mL/kg)[33-34]，灌注压力为3.92 kPa，同时左心房切开引流。肺表面逐渐由粉红变为白色。同时胸腔内给予冰屑，保持心肺低温。灌注完毕后，麻醉人员以6 mm Hg为标准，气道正压使肺膨胀至50%[35]，接着用沙氏钳夹闭主支气管并切断，钝性剥离食管，取下整个心肺组织。 受体肺植入：受体犬麻醉同供体。由于犬的上下腔静脉和左房呈直线相关性，即钳夹左心房时，阻断钳会使上下腔同时受阻，易致血栓形成，减少回心血量导致心功能衰竭死亡，因此先行左肺移植。犬取右侧卧位，经第5肋间入胸，游离左肺后结扎左肺动脉第一支，在其下方结扎并切断左肺动脉，结扎上下肺静脉后切断，然后保留左主支气管旁组织。在左上叶支气管近端切断，移去左肺。缝合顺序为支气管-肺动脉-肺静脉[36]。支气管吻合时用4-0 prolene线连续对端缝合支气管膜部，前臂软骨部间断“8”字缝合，再行左肺动脉吻合，用5-0 prolene线间断缝合，肝素盐水冲洗吻合口，最后吻合左房袖。开放通气，胸腔倒入盐水，检查并确认支气管吻合口无漏气后，留置胸腔引流管及缝合切口。左侧吻合完毕后，犬取左侧卧位，进行右侧肺移植，步骤同左肺移植。 猪自体肺移植模型[37]：仰卧位后肌注阿托品    0.1 mg，30 g/L戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)静脉注射麻醉。气管插管并连接呼吸机，麻醉成功后，取右侧卧位，经左侧第4 肋间切口入胸。 解剖肺门，游离左肺动脉、左肺静脉及左主支气管，分别套阻断带。按200 U/kg 行全身肝素化。通气胀肺后于左主支气管近根部用阻断带阻断，使左肺处于半膨胀状态。左肺动脉于动脉干远心侧切断，左肺静脉则于左心房切开引流处予以切断(形成“左房袖”)。左主支气管阻断带远侧以无创伤钳钳夹，并于两者之间切断左主支气管，使左肺保持在半膨胀状态移出。将供肺置于托盘中修剪，左肺下叶动脉、静脉及叶支气管尽可能多以保留，肺静脉断面修剪成斜面，以备与左心房吻合。 修剪完毕后将供肺置入胸腔内。以心耳钳钳夹部分左心房，用6-0 Prolene 线连续外翻缝合肺叶静脉-左心房。用5-0 Prolene 线间断缝合下叶支气管与左主支气管。最后用6-0 Prolene 线外翻缝合左肺动脉，暂不打结。吻合好后开放左心房心耳钳，同时开放主支气管阻断带并胀肺，使血液逆流入移植肺组织，在肺动脉吻合口处溢出以排气，然后收紧缝线打结。 检查肺动脉吻合口处、左心房吻合口处有无漏血。张肺，并检查支气管吻合口处有无漏气。以温生理盐水冲洗胸腔，再次检查无出血、漏气，并清点器械、敷料无误后，置胸腔闭式引流管，接引流瓶。逐层缝合胸部切口，待其清醒。 清醒后逐渐减少潮气量，待自主呼吸恢复后，脱机。脱机后24 h 内注意观察猪的精神状态、呼吸频率、口唇黏膜色泽等。待引流量减少并稳定后拔除胸腔闭式引流管。 自体肺移植是指先切除一侧全肺，在体外状态下去除病变肺叶，再将健康肺叶组织移植回胸腔的过程。它的优点是将自身健康肺组织得以保留，不会发生自身免疫反应，手术也不受供体的限制。目前在临床上多用于治疗上叶中心型肺癌且下叶肺组织中未见肿瘤转移的患者。    兔肺缺血再灌注模型[38]：肌肉注射阿托品0.5 mg 后， 经耳缘静脉注射20 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg 麻醉， 手术中间断静脉注射20 g/L戊巴比妥钠，每次5 mg/kg， 维持足够麻醉深度。麻醉生效后将动物仰卧固定于手术台上，行气管切开，置入3.5 F气管插管接小动物人工呼吸机(安徽正华生物仪器设备有限公司，DW-3000型) 行机械通气。调节呼吸机参数为：呼吸频率30次/min，吸呼比1∶1，氧浓度100%，潮气量10 mL/kg，游离左肺门期间呼吸参数改为潮气量7 mL/kg，呼吸频率40次/min。游离右侧股动脉、置管连接二道生理仪监测动物平均动脉压和心率，游离一侧颈外静脉置管用于术中补液及注射肝素、补充麻药，补液量为生理盐水10 mL/(kg•h)。麻醉成功后，将动物改为右侧卧位固定，自左侧胸骨旁剪断第4 肋软骨，沿第3，4 肋间剪开左胸壁全层至腋后线，掀开胸壁，在腋后线处切除第4肋骨，暴露左侧肺门。用棉签和眼科手术器械分别游离左侧肺动脉及左肺上、下静脉，用于阻断肺循环之用。静脉注入肝素(1.0 mg/kg) 10 min后，根据研究的目的不同进行阻断(如用无创动脉夹先后阻断肺动脉及上、下肺静脉1 h后再顺序开放肺上、下静脉和肺动脉或单纯阻断肺动脉1 h后再开放等)，手术过程中左肺始终处于通气状态。 2.4.4  供肺保存  目前肺保存液分为细胞内液型和细胞外液型，细胞内液即高钾低钠型保存液，以EC液(欧-科溶液)和UW液(威斯康星液)为代表[39]。细胞外液型即低钾高钠型保存液，主要有PerfadeX、LPD、ETK液、Kerb’s液、肝素血、WallwOrk’s液、CelsiOr液等[39]。低温灌注及保存可以降低组织代谢率、酶活性，减少能量消耗并可抑制细胞降解酶，降低其细胞毒性，但它同时也抑制ATP依赖性Na+-K+泵的功能，导致膜电位下降和Na+内流，引起细胞内水肿[40-41]。有实验证实灌注温度为10 ℃比4 ℃能获得更好的效果，但大多数仍采用4 ℃进行灌注和保存[42]。在肺缺血再灌注模型中，用常温肝素溶液进行灌注较为多见[43]。 2.5  注意事项 肺移植动物实验中需要注意以下几个方面：①不同动物的解剖结构各有差异，在试验过程中选择的麻醉及手术方式要符合动物的生理状况。②保证气管插管顺利，使气道在整个手术过程中保持通畅[44]。③吻合准确，保证吻合口通畅无渗漏[41]。熟练的外科吻合技术是建立肺移植动物模型成功的关键，而这一关键的难点是受体肺动静脉及支气管的切口选择，如可选取图1中的切口[45]。④在吻合血管壁时尽量保持血管内皮细胞的完整性来预防血栓的形成。⑤移植过程中还需特别注意动物气道分泌物的处理[46]。"